目的:探讨DNA损伤激活的非编码RNA (NORAD)诱导细胞自噬对食管胃结合部腺癌(AEG)奥沙利铂耐药的影响及分子机制。方法:收集2023年1月至6月安阳市肿瘤医院诊治的进展期AEG患者AEG及其癌旁正常组织手术标本4对，应用长链非编码RNA微阵列芯片分析AEG及其癌旁组织中NORAD的表达情况。使用新鲜AEG组织标本制备肿瘤组织来源的AEG细胞系(PDC) ，构建PDC和AEG细胞系OE19的奥沙利铂耐药细胞系(PDC-R、OE19-R)，并通过转染shNORAD制备敲减NORAD的PDC-R和OE19细胞系(shNORAD PDC-R、shNORAD OE19-R)。应用生物信息学工具Starbase v3.0和DIANA-lncBase v3.0预测NORAD潜在靶点及其与微RNA-433-3p(miR-433-3p)的相互作用。PDC、PDC-R，OE19、OE19-R细胞分别共转染miR-144-3p和野生型NORAD(NORAD-WT)或突变型NORAD(NORAD-Mut)质粒，应用双萤光素酶报告实验验证NORAD与miR-433-3p的相关性。通过定量反转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测胃正常黏膜细胞系GES-1及AEG细胞系PDC、PDC-R、shNORAD PDC-R、OE19、OE19-R、shNORAD OE19-R中NORAD和miR-433-3p表达水平，蛋白质印迹法检测上述细胞p62和微管相关蛋白1轻链3 B-Ⅱ(LC3B-Ⅱ)的表达。采用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)测定奥沙利铂对PDC、PDC-R、shNORAD PDC-R、OE19、OE19-R和shNORAD OE19-R细胞的细胞半数抑制浓度(IC 50)。统计学方法采用独立样本 t检验。 结果:微阵列芯片分析发现与癌旁正常组织相比，AEG中NORAD表达显著上调(差异表达倍数≥2.0, P<0.05)。生物信息学研究发现miR-433-3p是NORAD的潜在靶点。双萤光素酶报告实验结果显示，在PDC和PDC-R细胞中，NORAD-WT组的相对萤光素酶活性低于NORAD-Mut组(0.441±0.104比0.928±0.204、0.449±0.112比0.947±0.201)，差异均有统计学意义( t＝－14.74、－14.94,均 P<0.001)；OE19和OE19-R细胞中双萤光素酶报告实验结果与PDC细胞系相同。qRT-PCR检测结果显示，NORAD在GES-1细胞中的相对表达量(1.016±0.213)低于PDC细胞(2.194±0.322)和PDC-R细胞(4.040±0.336)，且在PDC细胞中相对表过量低于PDC-R细胞，差异均有统计学意义( t＝－14.94、－37.21、－19.43，均 P<0.001)；在shNORAD PDC-R细胞中的相对表达量(0.290±0.165)则低于PDC-R细胞，差异有统计学意义( t＝－49.05, P<0.001)。miR-433-3p在GES-1细胞中的相对表达量(1.017±0.248)高于PDC细胞(0.470±0.156)和PDC-R细胞(0.203±0.045)，且PDC细胞中的相对表达量高于PDC-R细胞，差异均有统计学意义( t＝9.15、15.85、8.11,均 P<0.001)，在shNORAD PDC-R细胞中的相对表达量(0.699±0.256)也高于PDC-R细胞，差异有统计学意义( t＝9.37, P<0.001)。蛋白质印迹法检测结果显示，PDC-R中LC3B-Ⅱ相对表达量高于PDC细胞(0.426±0.060比0.212±0.041)，shNORAD PDC-R细胞中LC3B-Ⅱ的相对表达量(0.155±0.029)低于PDC细胞，差异均有统计学意义( t＝8.70、－79.45，均 P<0.001)；而p62在各细胞系中表现呈相反趋势，在PDC-R中相对表达量低于PDC(0.205±0.031比0.311±0.040)，在shNORAD PDC-R中的相对表达量(0.504±0.084)高于PDC，差异均有统计学意义( t＝－31.19、62.80，均 P<0.001)。在OE19细胞系的原始细胞、耐药细胞和NORAD敲减细胞中NORAD和miR-433-3p，以及LC3B-Ⅱ和p62表达变化规律与PDC细胞系相似。CCK-8评估靶细胞活力发现，奥沙利铂对PDC、PDC-R和shNORAD PDC-R细胞的IC 50值分别为14.28、22.27和2.51 μg/mL，对OE19、OE19-R和shNORAD OE19-R细胞的IC 50值分别为3.95、8.12和1.89 μg/mL。 结论:NORAD在AEG组织及细胞中呈高表达；在奥沙利铂耐药的细胞呈过表达，而且增加了细胞的自噬活性。敲减NORAD后AEG细胞自噬活性受到抑制，而且AEG细胞对奥沙利铂的敏感性增加。

目的:探讨DNA损伤激活的长链非编码RNA(NORAD)对多发性骨髓瘤(MM)细胞增殖及对硼替佐米(BTZ)化疗耐药性的影响.方法:应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测健康人和骨髓瘤患者、不同MM细胞系中NORAD表达差异,并分析其与MM患者生存率关系;运用慢病毒转染技术,干扰细胞系中NORAD的表达,检测其表达差异;定量PCR(qPCR)检测骨髓瘤细胞系中人类非编码RNA-144a-3p(hsa-miR-144a-3p)的表达;采用双荧光酶素报告验证NORAD和hsa-miR-144a-3p的结合;通过RNA结合蛋白免疫沉淀(RIP)实验进一步验证LncRNA和miRNA的结合;细胞计数试剂8(CCK8)法检测各细胞处理后细胞活性.细胞克隆试验检测细胞增殖能力.结果:MM患者细胞系中NORAD常高表达,提示预后差,生存期短;敲除NORAD基因后,MM耐药细胞系对BTZ药物敏感性增加.MM患者hsa-miR-144a-3p高表达,在骨髓瘤细胞系中加用miR-144a-3p类似物时细胞增殖能力下降;NORAD低表达可显著抑制细胞增殖,细胞对药物敏感性增强.细胞克隆形成实验也证实NORAD低表达可抑制癌细胞增殖.结论:NORAD高表达可增强MM对BTZ化疗耐药性,NORAD可直接与hsa-miR-144a-3p结合,上调其在MM细胞中的表达,进一步调控癌细胞增殖,同时调控患者对BTZ药物敏感性.

长链非编码RNA(long non-coding RNA,IncRNAs)近年来成为研究的热点.IncRNA CDKN1A反义链启动子DNA损伤激动 RNA(promoter of CDKN1A antisense DNA damage activated RNA, PANDAR)在多种肿瘤中表达上调,其主要通过结合核转录因子Y(NF-Y)抑制细胞凋亡激活因子的转录等途径参与肿瘤的发生、发展.进一步研究发现,PANDAR还可作为肿瘤预后标志物,在肿瘤的早期诊断、疗效判断及预后评估等方面具有重要的应用前景.

目的:探讨长链非编码RNA (long non-coding RNA,lncRNA)DNA损伤激活的非编码RNA (non-coding RNA-activated by DNA damage,NORAD)对食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)细胞株EC9706增殖和迁移能力的影响及其机制.方法:采用RT-PCR法检测不同ESCC细胞(EC9706、TE1、YES-2、KYSE150)中NORAD mRNA表达水平,通过RNA干扰技术将NORAD的小干扰RNA(siRNA)转染到EC9706细胞(si-NORAD组)以建立NORAD低表达细胞,另设置空白对照组(Ctrl组,不转染任何序列)及阴性对照组(NC组,转染siRNA阴性对照序列),qPCR验证其转染效果.用MTT、平板克隆形成和划痕愈合实验检测敲低NORAD前后EC9706细胞增殖和迁移能力的变化,Western blotting检测敲低NORAD前后EC9706细胞中上皮钙黏蛋白(E-cadherin)、神经钙黏蛋白(N-cadherin)和锌指转录因子Snail的表达变化.结果:在4种ESCC细胞中NORAD mRNA均呈高表达状态,同时与TE1、YES-2、KYSE150细胞相比,EC9706细胞中NORAD mRNA呈显著高表达(P＜0.01).与Ctrl组和NC组比较,转染NORAD-siRNA后,si-NORAD组EC9706细胞中NORAD表达水平显著降低(均P＜0.01),EC9706细胞的增殖和迁移能力显著降低(均P＜0.05);敲低NORAD表达后,EC9706细胞中E-cadherin表达升高而N-cadherin和Snail表达降低(均P＜0.05).结论:NORAD在EC9706细胞中呈高表达状态,敲低NORAD表达可通过上调E-cadherin、下调N-cadherin和Snail表达而抑制EC9706细胞的增殖和迁移能力.

目的:研究长链非编码RNA(lncRNA)-DNA损伤诱导的非编码RNA(NORAD)在食管癌Eca-109细胞中的表达,分析沉默NORAD通过miR-26a-5p/Unc-51样自噬激活激酶1(ULK1)对食管癌Eca-109细胞生物学行为的影响.方法:收集45例食管癌患者癌组织和40例癌旁正常组织标本,培养正常人食管鳞状上皮Het-1A细胞和食管癌Eca-109细胞,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测癌组织、癌旁正常组织、Het-1A细胞和Eca-109细胞中NORAD mRNA、miR-26a-5p和ULK1 mRNA表达水平.采用miRanda数据库检测NORAD与miR-26a-5p的结合位点,双荧光素酶报告基因实验检测NORAD与miR-26a-5p的关系.根据实验目的和转染质粒的不同,Eca-109细胞分为siRNA NC组和NORAD siRNA组,inhibitor NC组和miR-26a-5p inhibitor组,pcDNA-3.1(+)+mimics NC组、pcDNA-NORAD+mimics NC组、pcDNA-3.1(+)+miR-26a-5p mimics组和pcDNA-NORAD+miR-26a-5p mimics组,采用MTT法检测各组细胞活性,Transwell法检测各组细胞中侵袭细胞数,Western blotting法检测各组细胞中E-钙黏蛋白(E-cadherin)和N-钙黏蛋白(N-cadherin)蛋白表达水平.采用TargetScan数据库检测miR-26a-5p与ULK1的结合位点,双荧光素酶报告基因实验检测miR-26a-5p与ULK1的关系.Eca-109细胞分为siRNA NC组和ULK1 siRNA组,采用MTT法检测各组细胞活性,Transwell法检测各组细胞中侵袭细胞数,Western blotting法检测各组细胞中E-cadherin和N-cadherin蛋白表达水平.Eca-109细胞分为siRNA NC+inhibitor NC组、NORAD siRNA+inhibitor NC组、siRNA NC+miR-26a-5p inhibitor组和NORAD siRNA+miR-26a-5p inhibitor组,采用RT-qPCR和Western blotting法检测各组细胞中ULK1 mRNA和蛋白表达水平.结果:与癌旁组织或Het-1A细胞比较,食管癌组织或Eca-109细胞中NORAD和ULK1 mRNA表达水平明显升高(P<0.01),miR-26a-5p表达水平明显降低(P<0.01).与siRNA NC组比较,NORAD siRNA组细胞活性明显降低(P<0.01),侵袭细胞数明显减少(P<0.01),细胞中E-cadherin蛋白表达水平明显升高(P<0.01),N-cadherin蛋白表达水平明显降低(P<0.01).miRcode数据库和双荧光素酶报告基因检测,NORAD靶向miR-26a-5p.与inhibitor NC组比较,miR-26a-5p inhibitor组细胞活性明显升高(P<0.01),侵袭细胞数明显增加(P<0.01),细胞中E-cadherin蛋白表达水平明显降低(P<0.01),N-cadherin蛋白表达水平明显升高(P<0.01).与pcDNA-3.1(+)+miR-26a-5p mimics组比较,pcDNA-NORAD+miR-26a-5p mimics组细胞活性明显升高(P<0.01),侵袭细胞数明显增加(P<0.01),细胞中E-cadherin蛋白表达水平降低(P<0.01),N-cadherin蛋白表达水平明显升高(P<0.01).TargetScan数据库和双荧光素酶报告基因检测,miR-26a-5p靶向ULK1.与siRNA NC组比较,ULK1 siRNA组细胞活性明显降低(P<0.01),侵袭细胞数明显减少(P<0.01),细胞中E-cadherin蛋白表达水平明显升高(P<0.01),N-cadherin蛋白表达水平明显降低(P<0.01).与siRNA NC+miR-26a-5p inhibitor组比较,NORAD siRNA+miR-26a-5p inhibitor组细胞中ULK1 mRNA和蛋白表达水平明显降低(P<0.01).结论:沉默lncRNA-NORAD可抑制Eca-109细胞增殖、侵袭和上皮-间质转化(EMT),其机制可能是通过调控miR-26a-5p/ULK1轴实现的.

目的:探究下调DNA损伤激活的长链非编码RNA(lncRNA NORAD)抗心房颤动(房颤)大鼠心肌纤维化作用及可能的作用机制.方法:SD大鼠随机分为对照组、房颤组、重组腺相关病毒血清型9阴性对照(rAAV9-NC)组、重组腺相关病毒血清型9载体含用于沉默lncRNA NORAD的小干扰RNA(rAAV9-siNORAD)组、p38丝裂原激活的蛋白激酶(p38 MAPK)抑制剂SB203580组、rAAV9-siNORAD+SB203580组,每组8只.建立各组模型大鼠并进行对应干预措施,实验结束后对大鼠进行心电图测试,记录房颤的发生率和持续时间;并检测血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)、心肌肌钙蛋白I(cTnI)和炎性因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)水平;Masson染色检测心房组织纤维化,计算心房胶原容积分数(CVF);实时荧光定量PCR检测心房组织lncRNA NORAD、Ⅰ型胶原(COL1-A1)和Ⅲ型胶原(COL3-A1)的mRNA表达情况;Western blot检测心房组织丝裂原活化蛋白激酶激酶6(MKK6)、p38 MAPK和核因子κB p65(NF-κB p65)及其磷酸化蛋白的表达情况.结果:与对照组相比,房颤组大鼠可观察到P波消失,出现大小不等、不规则的f波,心房组织有明显的纤维化改变,CVF、血清cTnI、CK-MB、TNF-α、IL-6水平、心房组织COL1-A1和COL3-A1的mRNA水平以及lncRNA NORAD表达水平、MKK6蛋白水平、磷酸化p38 MAPK与p38 MAPK的比值和磷酸化NF-κB p65与NF-κB p65比值升高,差异具有统计学意义(P均<0.05);与房颤组相比,rAAV9-siNORAD组和SB203580组大鼠房颤的发生率降低,持续时间缩短(P<0.05),CVF,血清cTnI、CK-MB、TNF-α、IL-6水平,心房组织COL1-A1和COL3-A1的mRNA水平以及lncRNA NORAD表达水平、MKK6蛋白水平、磷酸化p38 MAPK与p38 MAPK的比值及磷酸化NF-κB p65与NF-κB p65的比值降低,差异均具有统计学意义(P均<0.05);分别与单用SB203580和rAAV9-siNORAD相比,两者联合应用后p38 MAPK/NF-κB p65信号通路的激活被进一步抑制,心肌纤维化程度进一步降低.结论:下调lncRNA NORAD可能通过抑制p38 MAPK/NF-κB p65信号通路激活对房颤大鼠发挥抗心肌纤维化作用.

目的 探究长链非编码RNA中DNA损伤激活的非编码RNA(non-coding RNA-activated by DNA damage,NORAD)对人脐静脉内皮细胞血管生成的影响和机制.方法 本文以人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)为研究对象,采用小干扰RNA和过表达质粒分别转染细胞24 h,采用逆转录-实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和免疫印迹实验(western blot,WB)检测mRNA和蛋白水平.染色质免疫沉淀技术(ChIP)检测转录因子FOXP3(forkhead box P3)在血管形成关键蛋白VEGFA(vascular endothelial growth factor A)启动子区的结合情况.血管生成实验检测HUVEC血管生成功能.采用两独立样本t检验或单因素方差检验法进行数据分析.结果 在HUVEC中过表达 NORAD 后(增加 57.96 倍,t=68.761,P＜0.001),VEGFA 和 FOXP3 的 mRNA 水平分别上调 2.96 倍(t=8.942,P=0.001)和 2.23 倍(t=7.372,P=0.002),其蛋白水平分别上调 1.78 倍(t=12.834,P＜0.001)和 1.97 倍(t=30.391,P＜0.001).FOXP3在VEGFA的启动子区的结合量是对照组的3.36倍(t=6.232,P=0.003).在过表达FOXP3后(增加至57.73倍,t=14.152,P＜0.001),VEGFA 的 mRNA 及蛋白水平分别上调 3.80 倍(t=14.421,P＜0.001)和 1.42 倍(t=10.212,P＜0.001).过表达NORAD后HUVEC血管形成功能增强.结论 NORAD促进转录因子FOXP3表达进而促进VEGFA转录和蛋白表达,增强了内皮细胞血管生成功能,提示NORAD可能作为预防由血管生成功能障碍而引发的妊娠相关疾病的重要调控分子.