目的 基于乳酸乳球菌(Lactococcus lactis,L.lactis)诱导表达系统制备呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial vi-rus,RSV)口服疫苗,并对其免疫原性进行分析.方法 将构建的质粒pUC57-Pre F与pNZ8149分别经Nco Ⅰ和Kpn Ⅰ双酶切,酶切产物经T4 DNA连接酶连接后获得重组质粒pNZ8149-Pre F,电转化至感受态L.lactis NZ3900,经乳糖培养基筛选获得非分泌型重组L.lactis NZ3900/pNZ8149-Pre F,以nisin A为诱导剂诱导表达,经Western blot和免疫荧光标记对其表达产物进行分析;将雌性BALB/c小鼠随机分为PBS、L.lactis NZ3900/pNZ8149、L.lactis NZ3900/pNZ8149-Pre F组,15只/组,每只口服500 μL,于第1、2天进行初次免疫,第16、17天进行加强免疫,第14和28天经小鼠下颌取血并分离脾脏细胞,ELSIA法检测重组L.lactis NZ3900/pNZ8149-Pre F诱导的体液和黏膜免疫应答水平,ELISpot法检测重组L.lactis NZ3900/pNZ8149-Pre F诱导的细胞免疫应答水平.结果 重组L.lactis NZ3900/pNZ8149-Pre F经PCR及测序鉴定,证明构建正确;抗原蛋白Pre F特异性地表达在L.lactis NZ3900中,相对分子质量约 50 000;初次免疫后第 14 和 28天,与 PBS 和L.lactis NZ3900/pNZ8149组相比,L.lactis NZ3900/pNZ8149-Pre F组小鼠血清Pre F-特异性IgG抗体效价、肠洗液中特异性分泌型IgA抗体以及脾脏细胞中IFNγ和IL-4分泌水平均明显升高,且差异均有统计学意义(t=-30.268～-3.087,P均＜0.05).结论 基于L.lactis诱导表达系统构建的RSV 口服疫苗具有较强的免疫原性,为研发RSV黏膜疫苗提供了参考,也为开发其他病毒或细菌口服疫苗提供了新的研究策略及方法.

目的 制备不同浓度的兔软骨脱落细胞支架,并评估其理化性能和干细胞的相容性,为软骨修复提供实验依据.方法 Percoll密度分离法培养骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs),并进行流式细胞学鉴定和成骨、成软骨分化能力检测.从兔膝、股关节中切取软骨片,进行物理粉碎、反复冻融以及各种酶混合消化脱细胞.为比较并观察不同浓度脱细胞支架的理化性能差异,设计3组支架,浓度分别为100％(A组)、50％(B组)、30％(C组),每组3只.将第3代PKH26示踪的BMSCs接种于最适浓度支架上培养1周,观察细胞生长情况.结果 流式技术检测BMSCs表面抗原,CD44、CD90呈阳性表达,CD45阴性表达;成骨诱导茜素红染色可见红色钙结节;软骨诱导阿利新蓝染色见软骨结节呈蓝色;3组支架经苏木素-伊红(HE)、甲苯胺蓝染色后未观察到明显细胞形态.样本脱细胞后的DNA浓度与未脱支架的指标均值差异具有显著性(P＜0.05).糖胺聚糖含量较正常值稍偏低.3组支架两两比较孔径、吸水膨胀率、孔隙率、支架断裂强度、杨氏模量差异具有显著性(P＜0.05);干细胞与支架共培养后细胞附着良好.结论 Percoll密度分离法可获取高纯度的兔BMSCs;应用混合脱细胞方法脱细胞较彻底.B组支架可作为构建组织工程软骨修复的最适方案.体外培养的BMSCs在B组支架生长良好.

目的:分析普雷沃菌(Prevotella)致肺脓肿鉴定诊断和治疗思路。方法:选择我院收治的1例肺脓肿患者，经厌氧培养，采用全自动微生物质谱检测系统Autof ms1000 、16S核糖体DNA (ribosomal DNA, rDNA)基因序列分析、胸腔脓液、宏基因二代测序(metagenomic nextgeneration sequencing, mNGS)明确病原菌，进行文献复习。结果:采用全自动微生物质谱检测系统Autof ms1000鉴定菌株为普雷沃菌，16S rDNA基因序列分析显示解肝素普雷沃菌(NR044633.1) 98.517%, mNGS明确病原菌为普雷沃氏菌属26%，梭杆菌属13%，棒杆菌属7%。予哌拉西林钠舒巴坦钠3 g联合奥硝唑0.5 g/d二次静点抗感染，症状明显好转，无发热，无咳嗽咳痰，复查胸部CT右下肺高密度影基本吸收。结论:普雷沃菌是一种条件致病厌氧菌，多发生在机会性感染，易误诊漏诊，建议尽早进行mNGS明确病原体。经典微生物培养联合宏基因二代测序技术可提高肺部感染性疾病的病原微生物检出率，为精准抗菌治疗提供临床依据。

高中阶段基因工程模块的实验对应着现代分子生物学研究的基础手段,对学生的概念体系、操作技能和科学思维有独特的培育价值.但目前很多中学由于缺少相关经验而无法实际开展此类实验.基于长期的探索实践,总结了开设DNA提取与鉴定、PCR及电泳等实验的方案和技巧,为普通高中开设此类实验提供参考.

目的:构建在阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)病变相关脑区过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子-1α(peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1 alpha,Pgc-1alpha)敲除小 鼠.方法:引入 Pgc-1alpha 条件性敲除杂合子小鼠(Pgc-1alphafl+),通过自交获得Pgc-1alpha条件性敲除纯合子小鼠(Pgc-1alphafl/fl).将Pgc-1alphafl/fl纯合子小鼠和在AD病变脑区(皮层、海马)特异性表达Cre重组酶的Cre工具鼠(Calb1-Cre)杂交,提取子代转基因小鼠基因组DNA,行PCR鉴定,确定其基因型;采用蛋白免疫印迹技术检测转基因小鼠与野生型小鼠脑区及肾脏PGC-1α蛋白表达.结果:双重PCR鉴定结果显示,同时扩增出400 bp及444 bp条带的小鼠为AD病变脑区Pgc-1alpha敲除纯合子小鼠(Pgc-1alphafl/fl::Calb 1-Cre,Pgc-1alpha-/-).蛋白免疫印迹结果显示,与野生型小鼠相比,条件性敲除小鼠脑区PGC-1α蛋白表达明显减少(P＜0.05).结论:成功构建在AD病变相关脑区Pgc-1alpha敲除小鼠.

目的:应用全外显子组测序鉴定一晶状体异位家系的致病基因。方法:对中国1个晶状体异位家系进行病史采集、体格检查，绘制家系图。收集家系3名患者和10名健康成员外周血各5 mL，提取基因组DNA。应用全外显子组测序方法，对测序结果进行分析，基因筛查和突变筛查排除后，对符合条件的突变进行Sanger测序验证和家系共分离分析。结果:该家系3名患者均有晶状体异位，超声心动图检查和骨骼检查未见明显异常。先证者经全外显子组测序，筛选突变基因，发现 FBN1基因和 ADAMTS17基因存在可疑致病突变，查阅文献排除 ADAMTS17基因突变致病的可能性。经Sanger测序验证及家系共分离分析，发现 FBN1基因第12外显子的错义突变(c.1421G>A，p.Cys474Tyr)符合条件。 结论:该家系符合单纯性晶状体异位疾病特征，通过全外显子组测序分析，发现 FBN1基因第12外显子上的杂合突变(c.1421G>A，p.Cys474Tyr)是导致该家系晶状体异位的主要致病原因。该突变为新的致病突变。

目的:了解青海省玉树藏族自治州（简称玉树州）鼠疫耶尔森菌（简称鼠疫菌）规律成簇的间隔短回文重复（CRISPR）的基因分型，探讨其遗传特征。方法:选取1963 - 2007年分离自玉树州鼠疫自然疫源地的44株代表性鼠疫菌，提取DNA，针对CRISPR的3个位点（YPa、YPb和YPc）设计引物，进行PCR扩增，并对扩增产物进行测序及分析，鉴定CRISPR间区序列（spacer），确定CRISPR基因型和类群。结果:44株鼠疫菌在CRISPR 3个位点上共有23种spacer，YPa位点14种、YPb位点6种、YPc位点3种，其中有2种新spacer，a106和a107。根据spacer阵列形式，44株鼠疫菌被分为15个CRISPR基因型、6个CRISPR类群，6个类群分别为Cb4、Cc3′、Ca7、Ca7′、Ca△5′和Ca35′，其中Ca7为主要流行类群（34株）。结论:玉树州鼠疫菌CRISPR位点具有多种基因型，遗传多态性较高，种群结构复杂。

目的:探讨circ_0063865在食管鳞状细胞癌(ESCC)组织和细胞中的表达及其对细胞生物学特性的影响。方法:应用Sanger测序、背靠背引物验证以及核糖核酸外切酶(Ribonuclease R，Rnase R)耐受实验鉴定circ_0063865的环状结构及稳定性。RNA荧光原位杂交实验检测ESCC病理组织芯片中circ_0063865的表达并分析其临床相关性。实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测正常食管上皮细胞系以及ESCC细胞系中circ_0063865的表达水平。Cell Counting Kit-8实验、集落形成实验、划痕实验、transwell侵袭实验以及流式细胞术分别检测circ_0063865对细胞增殖、迁移、侵袭能力以及凋亡水平的影响。结果:Sanger测序、背靠背引物和Rnase R耐受实验验证了circ_0063865的成环性。RNA荧光原位杂交结果显示，circ_0063865在ESCC组织中表达的平均荧光强度显著高于其配对癌旁正常组织( t＝2.267， P<0.05)，circ_0063865表达与淋巴结转移显著相关( χ2＝4.356， P<0.05)，circ_0063865高表达ESCC患者的平均总生存时间低于低表达患者。RT-qPCR结果表明，与正常食管上皮细胞系相比，circ_0063865在ESCC细胞系中的表达水平显著升高( F＝18.413， P<0.05)。此外，敲低circ_0063865后，KYSE-30和KYSE-150细胞的增殖、迁移和侵袭能力显著降低，凋亡水平显著升高(均 P<0.05)。 结论:ESCC中circ_0063865呈高表达，其表达变化与淋巴结转移显著相关，而且circ_0063865可促进ESCC细胞的增殖、迁移和侵袭。

目的 评估亚洲璃眼蜱在普氏野马分布区域传播疾病的潜在风险,研究雌、雄蜱在宏基因组水平的特征并进行病原体分析.方法 2022年4月,在新疆卡拉麦里山有蹄类自然保护区使用"守株待蜱"法采集硬蜱,利用体视镜进行形态学鉴定,提取48只蜱(雌、雄各24只)DNA,PCR扩增线粒体细胞色素C氧化酶第1亚基(COⅠ)序列进行分子生物学鉴定.将雌、雄亚洲璃眼蜱分组进行宏基因组测序,非冗余基因集与非冗余蛋白(NR)数据库进行比对,分析蜱携带的微生物群落组成;与京都基因与基因组百科全书(KEGG)数据库和抗生素抗性基因数据库(ARDB)进行比对,获取蜱及蜱传病原体的基因功能注释结果以及抗生素抗性功能注释结果.数据的比较采用t检验分析.结果 共采集硬蜱124只,经形态学鉴定亚洲璃眼蜱成虫119只.硬蜱DNA扩增出约700 bp的阳性条带,经测序与亚洲璃眼蜱(GenBank:MH459386.1)的序列一致性为99％～100％.宏基因组测序经质控过滤共获得469 327 812条序列读长,开放阅读框预测得到836 843～1 094 994条序列.NR数据库比对结果显示,亚洲璃眼蜱携带的细菌菌落丰度占注释到的总群落丰度的99.13％,共注释到细菌32门2 040种,变形菌门和放线菌门为优势菌门,分别占细菌群落丰度的51.52％和44.35％;嗜吞噬细胞无形体为优势菌种,占细菌群落丰度的16.35％.病毒菌落丰度占注释到的总群落丰度的0.004％,共注释到病毒5 门 21种.雌蜱和雄蜱携带的细菌群落和病毒群落的丰富度及多样性差异均无统计学意义(t=-1.180、-1.729,均P＞0.05).KEGG基因功能注释到亚洲璃眼蜱新陈代谢基因占比最高(54.38％),主要的功能条目为氨基酸代谢、碳水化合物代谢、膜转运等;共识别出11 352种蛋白通路,其中154种蛋白通路在雌蜱和雄蜱间的差异有统计学意义(t=-2.348,P＜0.05).ARDB注释到亚洲璃眼蜱携带154种抗生素抗性基因,包括49种抗性基因类型,主要抗性基因类型为Baca(占62.53％),抗生素类型为肝菌肽.大部分注释到的抗性基因与多重耐药相关,如Mexf、Mexb、Emrd、Mexw等.雌蜱和雄蜱在抗生素抗性基因类型的差异性对比结果显示,仅雌蜱的Emrd基因抗性高于雄蜱(t=-7.558,P＜0.05).结论 本研究在宏基因组水平上揭示了亚洲璃眼蜱携带的主要细菌、病毒群落及多重耐药相关的抗生素抗性基因,雌蜱及其携带的病原体具有较高的物种丰度和基因丰度.

目的:分析国家自然科学基金委员会（简称自然科学基金委）2010—2021年检验医学领域项目整体申请与资助情况。方法:采集2010—2021年自然科学基金委检验医学领域申请与资助数据，重点针对学科内资助项目经费、地域、依托单位分布情况、关键词以及代表性论文进行分类统计，并分析和总结10余年来整体的项目特点。结果:2010—2021年自然科学基金委检验医学领域共收到项目申请7 746项、累计资助1 152项、资助金额共计50 631.7万元。项目申请数由2010年的228项增加至2021年1 184项，项目资助数由2010的36项增加至2021年的137项，项目资助金额也相应地由2010年的1 012.0万元增长至2021年的6 538.0万元，均逐年上升。在检验医学领域（H26）中，分支学科H2605（分子生物学检验）与H2606（检验医学研究新技术与新方法）是受资助数量最多的2个方向，占59.7%（688/1 152）。地域获资助情况中，北京、广东、上海、重庆、浙江和江苏为获资助数较多的前6个地区，占60.2%（695/1 152）。30家依托单位获得检验医学领域826项资助，占总数71.7%（826/1 152）。在检验领域1 152资助项目中，肿瘤（37.1%，427项）、感染类疾病（26.9%，310项）、循环系统疾病（5.3%，61项）、自身免疫疾病（4.3%，49项）、内分泌与代谢性疾病（2.8%，32项）是出现频率较高的疾病类型；蛋白（33.4%，385项）、DNA（19.4%，224项）、RNA（17.3%，199项）、外泌体（6.0%，69项）和细胞（5.9%，68项）是研究较多的标志物；纳米技术（6.0%，69项）、质谱技术（3.0%，34项）、探针技术（1.82%，21项）、电化学技术（1.6%，19项）和二代测序技术（1.6%，18项）是研究较多的检验技术。检验领域10年来在建立参考值范围、鉴定新型疾病标志物、开发检验新技术等方面取得多项突破，形成多个具有特色方向的研究团队。结论:自然科学基金委2010—2021年检验医学资助项目数及金额均显著上升，不同二级代码、地域和依托单位资助情况差异明显，研究范围广泛，多个团队在新型标志物挖掘与检验新技术等方面已取得标志性成果，整体水平有望进一步提升。