黑色素瘤细胞黏附分子CD146作为一种新的内皮细胞标志物,其表达与肿瘤、自身免疫性疾病的进展密切相关.类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种以对称性、慢性多关节炎症为特征表现的系统性自身免疫性疾病,滑膜血管翳作为RA的代表性病理产物在疾病的发生发展中起着重要作用.为了研究CD 146分子在人类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞(human rheumatoid arthritis fibroblast like synovial cell,HFLS-RA)条件培养液状态下的人脐静脉内皮细胞株 EAhy.926 的基因表达差异及其影响机制,本研究通过慢病毒介导的RNA干扰技术抑制EAhy.926细胞中CD146的表达.培养并提取HFLS-RA上清液制备条件培养液.将转染后的EAhy.926细胞用HFLS-RA条件培养液培养24 h构建RA损伤模型,并对其进行转录组测序,筛选出差异表达基因(differentiallly expressed genes,DEGs),并通过GO、KEGG通路分析,探索CD146调控的DEGs主要参与的相关信号通路及生物学过程.结果显示,与对照组细胞相比,HFLS-RA条件培养液状态下CD146敲低的EAhy.926细胞有341个DEGs,其中上调基因有173个,下调基因有168个;GO、KEGG通路分析发现DEGs主要富集在Wnt信号通路、PPAR信号通路、TRP通道的炎症介质调节、脂肪细胞因子信号通路上,参与了细胞黏附、细胞运动、细胞定位、半胱氨酸生物合成过程等生物过程.本研究通过转录组学分析发现在HFLS-RA条件培养液状态下,CD146分子可能通过多条关键信号通路及多个基因影响EAhy.926.研究结果为探讨CD146分子在类风湿关节炎滑膜血管生成中的作用及机制的研究提供了理论依据.

目的 探讨高良姜素体内、体外对肿瘤血管生成的影响.方法 采用磺酰罗丹明B(SRB)法测定高良姜素对人微血管内皮细胞(EaHy926)增殖的影响;细胞划痕实验检测其对EaHy926迁移能力的影响;观察其对鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)模型体内血管生成的影响.实验分为对照组(高良姜素0 μg)、高良姜素药物组(1、5和10 μg);采用H22细胞株建立裸鼠肝癌种植瘤模型,模型小鼠分成5组,阴性对照组,高良姜素低、中、高剂量组小鼠按照10、20和40 mg/(kg·d)分别灌胃给药,阳性对照组环磷酰胺按20 mg/(kg·d)腹腔注射,连续15 d;免疫组化法分析肿瘤组织中微血管密度(MVD),观察高良姜素裸鼠对肿瘤生长及肿瘤血管形成的影响.结果 不同浓度的高良姜素对EaHy926细胞生长、迁移能力及体外Matrigel小管的形成均有抑制作用,且抑制作用随药物浓度递增而增强;高良姜素5和10 μg组对CAM血管形成均呈现较强的抑制作用(P<0.05,P<0.01);与模型组相比,高良姜素20和40 mg/(kg·d)剂量组和环磷酰胺组能显著降低肿瘤瘤重(P<0.05),其抑瘤率分别为34.17%,79.73%,55.71%;同时,高良姜素20和40 mg/(kg·d)剂量组能显著降低肿瘤组织中MVD(P<0.05).结论 高良姜素体内体外都具有抑制肿瘤血管生成的作用.

该文为观察龙血通络胶囊对氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)致人脐静脉内皮细胞(EAhy.926细胞)损伤的保护作用.采用氧化低密度脂蛋白(100 mg·L-1)损伤建立体外人脐静脉内皮细胞损伤模型方法,MTT法检测龙血通络胶囊对正常细胞生长影响及对损伤细胞的保护作用,酶联免疫吸附法检测龙血通络胶囊对内皮细胞损伤后乳酸脱氢酶(LDH)、一氧化氮(N0)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)的影响,蛋白质印迹(WB)法检测细胞间黏附分子-1(ICAM-1),血管细胞黏附分子-1 (VCAM-1),p65,p-p65,IKB,p-IKB的表达水平.结果显示,与正常对照组比较,ox-LDL损伤后EAhy.926细胞活力显著降低,细胞LDH漏出量增加(P＜0.01),NO含量、SOD活力均显著降低(P ＜0.01,P＜0.05),细胞中MDA含量升高(P＜0.05),ICAM-1,VCAM-1,p-p65/p65,p-IKB/IKB等蛋白的表达量均显著升高(P＜0.01);与模型对照组比较,龙血通络胶囊(1,2 mg·L-1)对正常细胞生长无显著影响,可促进ox-LDL损伤的血管内皮细胞增殖(P ＜0.05,P＜0.01),降低胞内MDA含量、减少细胞LDH释放量(P＜0.05),提高SOD活力及NO含量(P＜0.01,P＜0.05);可降低ICAM-1,VCAM-1,p-p65/p65,p-IKB/IKB的表达(P＜0.01).结果提示龙血通络胶囊对ox-LDL所致的人脐静脉内皮细胞损伤具有明显的保护作用,说明龙血通络胶囊对动脉粥样硬化具有一定治疗作用.

为了模拟肠道小肠上皮-血管屏障,我们建立了一个基于肠道生理结构的Caco-2/EAhy926串联复合模型.基于此模型,我们对纳米粒的跨膜转运进行了研究,并且与传统小肠上皮细胞模型做了比较.本研究中,使用粒径为30 nm左右的Fe3O4纳米粒作为模式制剂开展研究,它有着均匀的粒径分布和很好的单分散性.在孵育浓度下,此制剂对Caco-2细胞和EAhy926细胞几乎没有毒性.Caco-2/EAhy926串联复合模型是通过将Caco-2细胞单层和EAhy926细胞单层连接建立的.基于FD4渗透和跨膜电阻(TEER)的研究表明,在一定的培养时间范围内,所有的细胞模型都能保持完整.使用Claudin-4和VE Cadherin,验证了紧密连接的存在.F-actin微丝蛋白的完整性表明了存在着良好的细胞内连接.研究表明,与Caco-2模型和EAhy926模型相比,串联模型对FD4和Fe3O4纳米粒的转运造成了更大的阻碍.并且发现,EAhy926细胞单层有着很好的渗透性,串联模型对纳米材料的阻碍主要是由于Caco-2细胞单层.总的来说,此串联复合模型使我们能够同时对纳米粒在小肠上皮层和内皮层的转运进行评价,提供了一个研究小肠生物-纳米相互作用的好方法.

目的 以不规则趋化因子(Fractalkine,FKN)不同浓度作用于人脐静脉内皮细胞株(EAhy.926),探讨FKN对内皮细胞上趋化因子受体CX3CR1表达的影响.方法 通过MTT法挑选出内皮细胞的FKN最佳药物作用浓度;根据Western-blot(WB)方法检测内皮细胞CX3CR1蛋白表达情况,确定FKN的最佳作用浓度;在不同时间给予FKN刺激内皮细胞,qRT-PCR检测内皮细胞中CX3CR1 mRNA表达水平;WB方法检测内皮细胞中CX3CR1蛋白表达水平.结果 MTT法筛选出FKN的最佳药物作用浓度为25 ng/mL.FKN(25 ng/mL)能明显提高内皮细胞中CX3CR1蛋白表达(P＜0.05);最佳作用浓度FKN刺激内皮细胞8h明显增加CX3CR1mRNA的表达量(P＜0.05);同样浓度FKN刺激内皮细胞2h,明显增加CX3CR1蛋白的表达量(P＜0.05),持续刺激内皮细胞24 h,CX3CR1蛋白的表达量最高.结论 内皮细胞CX3CR1的表达受FKN影响,从而促进内皮细胞炎症反应,为研究动脉粥样硬化的发病机制提供新的切入点.

目的 探讨miR-217对血管内皮细胞增殖、凋亡的影响及其作用机制.方法 运用25μmol/ml高糖建立血管内皮细胞EAhy926损伤;运用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测细胞中miR-217、软脂酰化磷蛋白(SPRY1)的表达;将HG+anti-miR-con组(转染anti-miR-con)、HG+anti-miR-217组(转染anti-miR-217)、HG+pcDNA组(转染pcDNA)、HG+pcDNA-SPRY1组(转染pcDNA-SPRY1)、HG+anti-miR-217+si-con组(共转染anti-miR-217和si-con)、HG+anti-miR-217+si-SPRY1组(共转染anti-miR-217和si-SPRY1)用脂质体法转染至EAhy926细胞,再用高糖处理;Western印迹检测细胞中SPRY1、细胞周期蛋白依靠性激酶抑制剂(p21)、B细胞淋巴瘤/白血病(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)的蛋白表达;噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖;膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)双染法检测细胞凋亡;双荧光素酶报告基因实验检测miR-217与SPRY1的靶向结合关系.结果 成功建立高糖诱导的血管内皮细胞EAhy926;与NG组相比,HG组细胞中miR-217表达明显上调,SPRY1表达明显下调(P<0.05);抑制miR-217、过表达SPRY1均可促进高糖诱导的EAhy926细胞增殖,抑制凋亡,上调p21、Bcl-2,下调Bax;miR-217可抑制野生型SPRY1细胞的荧光活性,负向调控SPRY1表达;敲减SPRY1可逆转抑制miR-217对高糖诱导的EAhy926细胞增殖、凋亡的调控及相关蛋白表达的影响.结论 miR-217可调控血管内皮细胞的增殖、凋亡,其机制可能与靶向SPRY1有关,可为高糖引起的心血管疾病的治疗提供新方向.

目的 探讨PD-L1过表达在Ⅱ型登革病毒(DENV-2)影响血管内皮细胞自噬和凋亡中的作用及机制.方法 以血管内皮细胞EAhy926为研究对象,以含梯度DENV-2(1×108～2×109 pfu/L)的无血清培养基处理细胞24 h和48 h,同时以无血清培养基处理细胞作为对照组,无血清培养基加入空白孔作为调零孔,MTT法检测细胞增殖活力.以PD-L1过表达慢病毒液和空载慢病毒液处理细胞,分别设空载对照组和转染组.DENV-2(1.2×109 pfu/L)处理细胞12、24、48 h作为DENV-212 h组、DENV-224 h组及DENV-248 h组,同时设置对照组(无血清培养基处理);另以DENV-2处理空载对照组和转染组48 h,以蛋白印迹法检测LC3B、Beclin-1及Bcl-2蛋白表达变化,流式细胞术检测各组细胞凋亡率.结果 1×108～2×109 pfu/L DENV-2可剂量依赖性抑制EAhy926细胞增殖,DENV-224 h和48 h的半数抑制浓度(IC50)分别是1.8×109 pfu/L和1.2×109 pfu/L.与对照组比较,DENV-212 h组、DENV-224 h组及DENV-248 h组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin-1蛋白表达上调,Bcl-2蛋白表达下调,细胞总凋亡率增加(均P<0.05).与空载对照组比较,转染组PD-L1蛋白表达上调(P<0.01).DENV-2处理48 h,与空载对照组相比,转染组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin-1蛋白表达下调,Bcl-2蛋白表达上调,细胞总凋亡率降低(均P<0.01).结论 DENV-2通过上调LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1蛋白表达及下调Bcl-2蛋白表达,从而诱导EAhy926细胞自噬和凋亡,而过表达PD-L1可抵抗DENV-2的诱导效应.

目的 研究红花黄色素A对人脐静脉内皮细胞增殖、凋亡及炎性因子分泌的影响及其机制.方法 通过ox-LDL诱导人脐静脉血管内皮细胞EAhy926损伤模型标记为ox-LDL组;红花黄色素A(50、100 mg/L)治疗损伤的EAhy926细胞标记为红花黄色素A-低组、红花黄色素A-高组;将ox-LDL+红花黄色素A+si-con组(转染si-con)、ox-LDL+红花黄色素A+si-沉默信息调节因子(SIRT)1组(转染si-SIRT1)、pcDNA组(转染pcDNA)、pcDNA-SIRT1组(转染pcDNA-SIRT1)用脂质体法转染至EAhy926细胞,再用100 mg/L红花黄色素A处理;Western印迹检测各组细胞SIRT1蛋白表达;四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测各组细胞的存活情况;流式细胞术检测各组细胞凋亡情况;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组细胞中肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6的表达.结果 红花黄色素A可明显抑制ox-LDL诱导人脐静脉血管内皮细胞EAhy926的存活,促进凋亡,抑制TNF-α、IL-6、SIRT1的表达(P<0.05);过表达SIRT1可逆转ox-LDL对EAhy926细胞的存活、凋亡及TNF-α、IL-6表达的影响;敲减SIRT1可逆转红花黄色素A对ox-LDL诱导EAhy926细胞损伤的保护作用.结论 红花黄色素A可保护ox-LDL诱导的人脐静脉血管内皮细胞的损伤,其保护作用的分子机制与下调SIRT1基因表达有关,可为红花黄色素A用于临床治疗人脐静脉内皮细胞损伤提供支持.

目的 探讨长链非编码RNA(lncRNA)核旁丛组装转录本1(NEAT1)对高糖诱导血管内皮细胞的作用及机制.方法 将EAhy926细胞随机分为对照(NG)组、高糖(HG)组、HG+pcDNA组、HG+pcDNA-NEAT1组、HG+anti-miR-con组和HG+anti-miR-217组、HG+pcDNA-NEAT1+miR-con组、HG+pcDNA-NEAT1+miR-217组.实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测miR-217和NEAT1表达水平;细胞计数试剂盒(CCK)-8检测细胞存活率;流式细胞术检测细胞凋亡;双荧光素酶报告实验检测NEAT1和miR-217的靶向关系.结果 与NG组相比,HG组EAhy926细胞中NEAT1低表达,miR-217高表达(P<0.05).过表达NEAT1或干扰miR-217表达,细胞存活率升高,细胞凋亡率降低(P<0.05).NEAT1靶向调控miR-217的表达,过表达miR-217逆转了NEAT1过表达对高糖诱导的EAhy926细胞增殖和凋亡的作用.结论 过表达NEAT可能通过调节miR-217促进高糖诱导的EAhy926细胞增殖,抑制细胞凋亡.

目的:探讨小核仁RNA宿主基因3(SNHG3)对过氧化氢(H2O2)处理的血管内皮细胞损伤的影响及分子机制.方法:将Eahy926细胞分为对照组(不做任何处理)、H2O2组(500 mmol/LH2O2)、H2O2+pcDNA3.1组(转染pcDNA3.1+500 mmol/L H2O2)、H2O2+pcDNA3.1-SNHG3 组(转染 pcDNA3.1-SNHG3+500 mmol/L H2O2)、H2O2+pcDNA3.1-SNHG3+miR-NC 组(转染 pc-DNA3.1-SNHG3 和 miR-NC+500 mmol/L H2O2)、H2O2+pcDNA3.1-SNHG3+miR-186 组(转染 pcDNA3.1-SNHG3 和 miR-NC+500 mmol/L H2O2).RT-qPCR检测SNHG3和miR-186表达;四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测细胞存活率;超氧化物歧化酶(SOD)和乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒分别检测细胞SOD活性和培养液LDH含量;流式细胞术检测细胞凋亡;荧光素酶报告实验检测SNHG3和miR-186的靶向关系.结果:与对照组相比,H2O2处理的Eahy926细胞中SNHG3表达、存活率、SOD活性显著降低,LDH水平、细胞凋亡率显著升高(P＜0.05).过表达SNHG3,H2O2处理的Eahy926细胞存活率、SOD活性显著升高,LDH水平、细胞凋亡率显著降低(P＜0.05).SNHG3靶向调控miR-186表达,过表达miR-186逆转了 SNHG3对H2O2处理的Eahy926细胞活性、凋亡及SOD、LDH的影响.结论:过表达SNHG3可促进H2O2处理的Eahy926细胞存活,抑制细胞凋亡,提高SOD活性,降低LDH水平,对H2O2诱导的Eahy926细胞损伤具有保护作用,其机制可能与miR-186有关.