目的:探讨本地区从血培养分离的肺炎克雷伯菌临床株的毒力与碳青霉烯类耐药表型的关系,并对碳青霉烯类耐药高毒力肺炎克雷伯菌(CR-HVKP)进行毒力表型验证.方法:收集2016-2019年血流感染患者血培养分离的192株非重复肺炎克雷伯菌,其中96株为碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌(CRKP),96株为碳青霉烯敏感肺炎克雷伯菌(CSKP).采用VITEK-2全自动微生物分析仪检测菌株对药物的敏感性,聚合酶链反应检测碳青霉烯类耐药基因、毒力基因和荚膜分型,拉丝实验检测菌株的高黏表型,全基因组测序方法检测CR-HVKP菌株的基因组特征,并通过血清抗性试验和生物膜形成试验进一步验证CR-HVKP的毒力.结果:CRKP对常见抗菌药物耐药率高,CSKP则对常见抗菌药物较敏感;除米诺环素外,CRKP组和CSKP组菌株对抗菌药物的耐药率差异均有统计学意义(均P<0.05).96株CRKP中,92株携带碳青霉烯酶基因,以blaKPC-2为主.在毒力因子方面,4株CRKP和36株CSKP拉丝试验阳性,呈现为高黏表型,两者差异具有统计学意义(P<0.05).与CRKP组比较,CSKP组Kfu、aerobictin、iutA、ybtS、rmpA、magA、allS等毒力基因检出率均增加,荚膜抗原K1和K2检出率也增加(均P<0.05).CRKP组检出高毒力肺炎克雷伯菌(HVKP)1 株(即CR-HVKP),CSKP组检出HVKP 36株,差异有统计学意义(P<0.05).全基因组测序结果显示,CR-HVKP多位点序列分型为412,荚膜抗原为K57,携带iutA、entB、mrkD、fimH和rmpA毒力基因,生物膜形成能力和血清抵抗力强,同时携带blaSHV-145、blaTEM-1、blaCTX-M-3、fosA6、oqxA5、oqxB26和aac(3)-Ⅱd耐药基因,伴随外膜蛋白K(OmpK)35和OmpK36的异常.结论:CRKP对抗菌药物的耐药率明显高于CSKP,虽然其携带的毒力基因数和种类均少于CSKP,但也出现了碳青霉烯类耐药且高毒力的新型多位点序列分型肺炎克雷伯菌.后者可能对公共卫生造成严重威胁.

目的 探讨尿感方对尿道致病性大肠杆菌毒力特征的影响.方法 以CFT073 作为实验菌株,通过细菌生长培养,观察尿感方含药尿液对CFT073 生长的影响.分别采用体外持留模型、微孔板法、平板法、ELISA法和RT-PCR法检测尿感方含药尿液对 CFT073 持留能力、生物膜形成、泳动能力、内毒素释放水平、侵袭力和毒力相关基因(fur、chuA、iha、fyuA、glt S、glt P、fimH和Lex A)的影响.结果 与未经干预的CFT073 比较,经空白尿液干预后的CFT073 生长能力、持留能力、生物膜形成、泳动能力、侵袭力、内毒素释放水平和毒力相关基因mRNA表达均无明显差异(P＞0.05);与经90%空白尿液干预后的CFT073 比较,经90%尿感方含药尿液干预后的CFT073 生长受到抑制(P＜0.05);与经60%空白尿液干预后的CFT073 比较,经60%尿感方含药尿液干预后的CFT073 持留能力、生物膜形成、泳动能力、侵袭力和内毒素释放水平降低(P＜0.05,P＜0.01),毒力相关基因fur、chuA、iha、fyuA、glt S、glt P、fimH、Lex A mRNA表达下调(P＜0.05,P＜0.01).结论 尿感方可降低CFT073 的持留能力、泳动能力和侵袭力,抑制生物膜的形成和内毒素的释放,下调毒力相关基因fur、chuA、iha、fyuA、glt S、glt P、fimH、Lex A mRNA表达,影响CFT073 的毒力特征.

目的 分析肺炎克雷伯菌临床分离株K63[第63号耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(CRKP)]的毒力耐药情况及全基因组特征.方法 收集分离自宁夏某医院新生儿重症监护室男性患儿痰液标本的肺炎克雷伯菌K63株,通过VITEK 2 Compact对其进行鉴定和药物敏感性试验.PCR法检测菌株毒力基因(ybtS、iutA、iucA、iroB、rmpA 2、fimH、mrkD、peg344)和耐药基因(blaTEM、blaSHV、blaNDM、blaIMP、blaOXA-48、blaVIM).PacBio RS Ⅲ 和 illuminate 高通量测序平台对其进行全基因组测序、基因组组装及生物信息学分析,获得菌株基因组特征.结果 成功从呼吸窘迫和新生儿肺部感染患儿痰液标本中分离出一株CRKP,命名为K63.药敏结果显示其对碳青霉烯类、磺胺类、头孢菌素类、β-内酰胺类、β-内酰胺酶抑制剂复合物等抗生素均耐药.PCR结果显示,毒力基因ybtS、i-ucA、iutA、rmpA2、iroB、fimH、mrkD、peg344 为阳性,同时携带 blaTEM、blaSHV、blaNDM及 blaVIM耐药基因.全基因组测序及组装得到1条完整的基因组序列及1条质粒序列,其基因组大小为5 880 871 bp,序列比对结果显示K63菌株为ST23-K1型.在染色体基因组基因鉴定中,发现有8种毒力基因,有7种耐药相关基因.质粒携带有 blaSHV-66、blaSNDM-5、sul1、mphA 和 aph(3')-Ia、tetC、vanA 和 mexe 等耐药基因.clb(ABCDFGHIJKLMNOPQS)、glf、pilW、ibeB等毒力基因也被注释.同时,水平转移区域预测结果显示质粒pVir-CR-63-1具有转移的潜力.基因富集及功能分析显示主要富集于代谢相关通路.结论 分离定植的K63株可能为高毒力耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌,有潜在传播风险,临床上应予以高度重视.

目的:探究口腔黏膜树突状细胞(dendritic cells,DCs)肝激酶B1(liver kinase B1,LKB1)表达对于应用黏膜疫苗佐剂反应的影响.方法:使用CD11ccre-GFP;LKB1fl/fl条件性敲除(conditional knockout,cKO)小鼠,同窝LKB1n/fl小鼠作为野生型(wild type,WT)对照组.首先选6～8周龄cKO与WT小鼠各12只,流式细胞术分选小鼠口腔黏膜DCs,进行转录组高通量测序;其次使用cKO与WT小鼠各16只,建立小鼠黏膜免疫模型,在第0、2和4周用卵清蛋白(ovalbumin,OVA)模式抗原颊黏膜下注射免疫(cKO-OVA,WT-OVA),鼠伤寒沙门氏菌来源的 FimH(FimH-S.typhimurium,FimH-ST)佐剂联合 OVA 模式抗原颊黏膜下注射免疫(cKO-OVA+FimH-ST,WT-OVA+FimH-ST).在接种后第3周收集小鼠血清和唾液,通过免疫酶联吸附试验(enzyme-linked immu-nosorbent assay,ELISA)法检测血清中OVA特异性IgG1和IgG2b、唾液中OVA特异性IgA抗体水平;在接种后第6周,使用流式细胞术检测小鼠颊黏膜和包括下颌下、颈部淋巴结的口腔引流淋巴结(draining lymph node,dLN)中各免疫细胞数目和比例.结果:cKO组口腔黏膜DCs的上调基因在基因本体论(gene ontology,GO)数据库富集到先天免疫反应、B细胞介导的免疫反应;基因集富集分析(gene set enrichment analysis,GSEA)中富集到Toll样受体信号通路和mTOR信号通路.WT-OVA+FimH-ST组相对WT-OVA组血清OVA特异性IgG1和IgG2b、唾液中OVA特异性IgA抗体水平升高;黏膜局部免疫B细胞与浆细胞数目与比例升高.cKO-OVA组血清IgG1和IgG2b、唾液中IgA抗体水平较WT-OVA组升高;dLN中滤泡辅助T细胞(follicular helper T,Tfh)及B细胞比例升高(P＜0.05).但cKO-OVA+FimH-ST组相对cKO-OVA组抗体分泌水平无差异,仅表现为dLN中Tfh和B细胞增多.结论:LKB1通过DCs调控先天免疫反应和B细胞功能;FimH-ST经小鼠口腔黏膜下注射具有佐剂效应;DCs激活口腔黏膜免疫反应依赖LKB1,DCs上LKB1缺陷导致FimH-ST佐剂效应丧失.

目的 探讨肺炎克雷伯菌(KP)毒力基因检测及新型标志物对高毒力肺炎克雷伯菌(HVKP)的诊断效能.方法 从2020-2023 年住院患者中根据病史和病原学检测结果,挑选出KP阳性患者,从医院菌库里获得对应的非重复KP菌株45 株,作为HVKP组;从菌库里随机挑选血液感染患者KP菌株,并按照具体病史剔除伴有其他感染的菌株,最终获取菌株48 株,作为普通肺炎克雷伯菌(cKP)组.比较2 组血清型和高毒力基因的阳性率,计算2 组比较有统计学差异的基因诊断效能.应用多因素Logistic回归分析寻找HVKP诊断分子标志物.结果 HVKP组与cKP组相比,K1 型比较差异有统计学意义(P<0.01).HVKP组毒力基因阳性率排名前 3 种的依次是PEG344、uge、fimH,相较于cKP组,比较存在统计学差异的毒力基因分别是fimH、rmpA2、aero、iutA、kfuBC、PEG344(P<0.01).诊断效能排序:rmpA2

目的 分析临汾市中心医院肺炎克雷伯菌临床分离株的分子分群和流行病学特征(荚膜血清型、耐药基因和毒力基因),为临床诊疗提供参考.方法 收集2021年1月—2022年1月临汾市中心医院143株肺炎克雷伯菌非重复临床分离株.采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱进行菌种鉴定,采用全自动微生物分析系统结合纸片扩散法检测菌株的耐药性,采用聚合酶链反应(PCR)结合基因测序技术分析Kp分子分群和荚膜血清型,采用PCR分析肺炎克雷伯菌耐药基因和毒力基因携带情况.结果 143株肺炎克雷伯菌中有肺炎克雷伯菌(KpⅠ)135株、变栖克雷伯菌(KpⅢ)4株、类肺炎克雷伯菌(KpⅡ)4株.KpⅠ主要荚膜血清型为K1、K2和K57,KpⅡ主要为K1,KpⅢ无特定血清型.KpⅢ和KpⅡ仅携带SHV、OKP、LEN基因,KpⅠ携带多种耐药基因,耐药性较强.所有肺炎克雷伯菌菌株均检出毒力基因,3群菌株fimH、mrkD、ENT毒力基因携带率均>95%.KpⅡ和KpⅢ的KFU毒力基因携带率(100.00%)高于KpⅠ(73.33%),KpⅠ、KpⅡ、KpⅢ的YBT毒力基因携带率分别为54.81%、25.00%、0%.结论 临汾市中心医院肺炎克雷伯菌临床分离株以KpⅠ为主,不同分子分群肺炎克雷伯菌菌株血清型分布、毒力基因和耐药基因携带情况存在差异.

目的 了解尿路致病性大肠埃希菌(UPEC)1型菌毛黏附特性、耐药表型及分子流行病学特征,为临床诊疗提供理论基础.方法 收集2020年1-11月广东省中医院大学城医院临床分离的80株UPEC,利用Vitek Ⅱ细菌鉴定药敏分析仪鉴定细菌并进行药敏实验.利用PCR方法检测UPEC的1型菌毛fimH基因的携带情况,酵母细胞黏附实验检测UPEC的黏附特性,比较黏附阳性UPEC和黏附阴性UPEC菌株间的抗生素耐药差异.通过随机扩增多态性DNA(RAPD)法分析黏附阳性UPEC间的亲缘关系.结果 80株UPEC中1型菌毛fimH基因阳性菌株为74株,占94.5％,其中黏附阳性菌株为37株,占50.0％.黏附阳性UPEC头孢呋辛耐药率(45.9％)和产超广谱β内酰胺酶(ESBL)阳性率(45.9％)均高于黏附阴性UPEC(21.6％、21.6％),差异均有统计学意义(P均＜0.05).37株黏附阳性UPEC可基因聚类,分为18个基因型,其中以R010基因型为主,包含11株UPEC,占29.7％;另外R006基因型包含4株UPEC,占10.8％;其余基因型均包含1～2株菌.结论 临床分离的UPEC 1型菌毛fimH基因携带率高,黏附能力强,应用头孢呋辛抗感染治疗时应注意耐药.黏附阳性菌株虽可聚类,但未出现院内流行性感染趋势.

目的 探讨老年耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌感染的耐药机制,分析承德市中心医院高毒力荚膜基因型的分布特点.方法 收集2016年1月至2017年3月间从承德市中心医院收治的老年患者中分离出的耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌18株,鉴定菌株和药敏试验;采用改良Hodge试验、EDTA协同试验、Carba NP试验初筛碳青霉烯酶,进一步检测菌株毒力情况,PCR检测耐药基因、荚膜血清型和毒力基因.结果 碳青霉烯酶检出Kpc基因6株(33.33%),Ndm基因7株(38.89%);超广谱β-内酰胺酶中Shv检出15株(83.33%),明显高于 Ctx-M 基因10株(55.56%)、Tem基因7株(38.89%)(P<0.01);AmpC 酶中检出 DHA 基因2株(11.11%).膜孔蛋白基因检测显示,Ompk36编码基因缺失率明显高于Ompk35(P<0.05);且当Ompk35基因缺失时Ompk36也缺失.荚膜分型显示,K1型4株,K57型2株,未检出K2、5、20及54,未分型12株;rmpA阳性率明显高于Acrobactin(P<0.05);4株K1型肺炎克雷伯菌均携带rmpA基因,其中1株同时携带Acrobactin基因;2株K57型肺炎克雷伯菌均携带rmpA基因;18株耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌均携带FimH-1基因.结论 老年耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌感染的主要耐药机制为携带Kpc和Ndm基因以及超广谱β-内酰胺酶合并膜蛋白缺失;该院Kpc基因荚膜血清型菌株分离率较高,应加以重视.

目的 探讨肝脓肿相关肺炎克雷伯菌高毒力荚膜血清型及主要毒力基因分布情况,并分析菌株的同源性.方法 收集无锡市第二人民医院2016年1月至2017年8月肝脓肿相关肺炎克雷伯菌分离株12株;所有菌株进行黏液丝试验,PCR方法检测高毒力相关荚膜血清型及主要毒力基因;采用多位点序列分型(MLST)技术和脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析菌株同源性.结果 12株肝脓肿相关肺炎克雷伯菌黏液丝试验阳性率为75％;检出K1(6株)、K54(1株)和K57(5株)3种高毒力荚膜血清型.毒力基因wcaG、rmpA、ureA 、fimH、mrkD、uge、Aer和iroNB检出率均为100％;iucB检出率为83.3％;未检出cf29a基因;magA、allS和kfuBC基因仅在K1血清型菌株中检出.MLST发现ST23(4株)和ST25(3株)为主要检出型,其次为ST412(2株)以及ST1660、ST1049和ST11各1株;PFGE结果显示12株肺炎克雷伯菌分为8个型,其中3株K1型菌株属于同一克隆型.结论 分离的肝脓肿相关肺炎克雷伯菌均为高毒力菌株,ST23和ST25为主要检出ST型别,ST1049型为首次报道.PFGE结果呈现出遗传多样性,K1型肺炎克雷伯菌存在一定的流行.

目的 了解1例高黏液表型(HMV)产酸克雷伯菌致白血病患者的死亡原因.方法 采用Vitek 2 Compact全自动微生物仪进行菌株鉴定及药敏试验,黏液丝试验检测HMV表型,PCR方法及基因测序检测主要的高毒力荚膜血清型基因(K1、K2、K5、K20、K54、K57)和毒力基因(rmpA、wcaG、allS、kfu、aerobactin、mrkD、fimH、uge、wabG、cf29a),多位点序列分析(MLST)对该菌株进行分子分型.结果 白血病患者血液及肺组织分离株均为产酸克雷伯菌,MLST分型为同一型ST19,该菌株对所测药物均敏感,具有高黏液表型,只检测到wcaG毒力基因,其他毒力基因和所测荚膜血清型基因均阴性.结论 携带wcaG毒力基因是ST19产酸克雷伯菌致白血病患者死亡的主要原因,应引起临床关注.