目的:探究多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）患者与非PCOS患者卵泡液中的差异性代谢物及其对小鼠卵母细胞体外成熟（ in vitro maturation，IVM）和体外受精（ in vitro fertilization，IVF）胚胎发育的影响。 方法:本研究的临床资料采取回顾性队列研究的研究方法获取；动物实验采取随机对照试验。收集2019年6月至2020年6月期间在上海集爱遗传与不育诊疗中心第一次接受IVF或卵胞质内单精子注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）周期的女性患者的卵泡液。根据是否为PCOS患者，分为PCOS组（ n=71）和非PCOS组（ n=70），回顾性分析两组患者的临床资料，并利用深度学习的拉曼光谱分析技术检测两组患者卵泡液的代谢谱差异。后续进行实验性研究，在PCOS患者和非PCOS患者卵泡液中进行小鼠GV期卵母细胞IVM培养，收集两组成熟的鼠卵母细胞进行IVF，进一步探讨卵泡液中差异性代谢物对鼠卵成熟及胚胎发育的影响。 结果:PCOS组患者卵母细胞成熟率［82.19%（886/1 078）］和受精第3天的有效胚胎率［51.30%（553/1 078）］显著低于非PCOS组［85.85%（625/728）， P=0.038；53.30%（388/728）， P=0.042］，两组患者的累积临床妊娠率和累积活产率差异均无统计学意义（均 P>0.05）。PCOS患者和非PCOS患者卵泡液之间存在差异性拉曼代谢光谱。两组间特征性拉曼位移主要集中在600~1 000 cm -1、1 168 cm -1、1 344 cm -1、1 440 cm -1、1 504 cm -1、1 632 cm -1、1 664 cm -1。拉曼特征位移数据库显示，两组卵泡液样本的差异代谢物主要集中蛋白质、脂质、游离核酸、葡萄糖、胆固醇、类胡萝卜素和氨基酸等物质。利用两组卵泡液行鼠卵IVM，PCOS卵泡液组的鼠卵MⅡ率［49.04%（77/157）］较非PCOS组更低［65.07%（95/146）， P=0.005］，利用小鼠MⅡ卵进行IVF，PCOS卵泡液组卵裂率［46.75%（36/77）］显著低于非PCOS组［63.16%（60/95）， P=0.031］，而两组囊胚率差异无统计学意义（ P>0.05）。 结论:PCOS患者卵泡液存在差异性拉曼代谢光谱，其差异性代谢物可能导致卵母细胞成熟障碍，并进一步影响IVF胚胎的发育，拉曼光谱为PCOS诊断和代谢组学的差异物分析提供了简便有效的方法。

目的:探讨血清和糖皮质激素诱导的蛋白激酶3(SGK3)在小鼠卵母细胞第一次减数分裂恢复中的作用,初步阐明SGK3在哺乳动物卵母细胞早期发育中的调控机制.方法:利用超排卵技术获取生发泡(GV)期小鼠卵母细胞,利用显微注射技术将表达质粒体外转录获得的SGK3 mRNA注射至GV期卵母细胞,分为对照组、Tris-EDTA缓冲液(TE)组和SGK3 mRNA组,采用Western blotting法检测各组小鼠卵母细胞中SGK3蛋白表达水平,显微注射SGK3 mRNA后1、2、3和4 h观察并计算各组卵母细胞生发泡破裂(GVBD)率,采用SGK3抗体稀释抑制实验观察各组卵母细胞形态表现,采用Western blotting法检测体外培养不同时间点卵母细胞中磷酸化SGK3(pSer48)(SGK3-pSer48)和磷酸化细胞分裂周期蛋白2(CDC2)(pTyr15)(CDC2-pTyr15)蛋白表达水平.结果:与对照组和TE组比较,SGK3 mRNA组小鼠卵母细胞中 SGK3蛋白表达水平升高(P＜0.01),显微注射后1和2h时GVBD率升高(P＜0.01).SGK3抗体稀释抑制实验,随着SGK3抗体浓度增加,各组小鼠卵母细胞GVBD率呈浓度依赖性降低.过表达SGK3后,与对照组比较,SGK3 mRNA组小鼠卵母细胞中检测不到CDC2-pTyr15蛋白表达的时间至少提前1 h.不同稀释浓度SGK3抗体作用后,与对照组比较,随着SGK3抗体浓度升高和时间的延长,小鼠卵母细胞中CDC2-pTyr15蛋白表达水平逐渐降低(P＜0.01),SGK3-pSer486蛋白表达水平逐渐升高(P＜0.01).结论:过表达SGK3可以增加小鼠卵母细胞GVBD率,加快CDC2-pTyr15的脱磷酸化,而CDC2-pTyr15的脱磷酸化晚于SGK3-Ser486的磷酸化.SGK3可能作为CDC2上游调节因子参与调控小鼠卵母细胞第一次减数分裂的恢复.

目的:评估体外成熟(in vitro maturation,IVM)培养液中添加腐胺是否可改善高龄小鼠卵母细胞质量,及腐胺对高龄小鼠卵母细胞中线粒体相关内质网膜(mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane,MAM)的影响.方法:取生发泡期(germinal vesicle,GV)小鼠卵母细胞进行体外成熟培养至减数分裂(meiosis,M)Ⅱ期,分别使用8周龄小鼠卵母细胞作为年轻对照组,40周龄小鼠卵母细胞作为老龄对照组,IVM液中添加0.5 mmol/L腐胺的40周龄小鼠卵母细胞作为老龄实验组.通过检测M Ⅱ期卵母细胞的第一极体排出率、二细胞率、囊胚率、皮质颗粒分布、纺锤体异常率和染色体异常率评估卵母细胞的质量.使用透射电镜观察MⅡ期卵母细胞的MAM,qPCR检测MAM间Ca2+传递的关键分子含量,Ca2+探针测定线粒体、内质网和胞质的Ca2+水平,并通过检测线粒体膜电位、ATP含量和活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平评估线粒体功能.结果:腐胺提高了高龄小鼠卵母细胞的第一极体排出率(P＜0.05)和囊胚率(P＜0.05),并显著降低皮质颗粒分布异常率(P＜0.01)、纺锤体异常率(P＜0.01)和染色体异常率(P＜0.05).腐胺可阻止高龄小鼠卵母细胞的MAM间距缩短变化(P＜0.001),降低其间Ca2+传递的关键分子含量(P＜0.05),缓解由MAM间Ca2+快速传递引起的线粒体钙超载(P＜0.001),从而改善线粒体功能(P＜0.05),降低细胞内ROS水平(P＜0.001).结论:体外成熟培养液中添加腐胺可显著改善高龄小鼠卵母细胞质量,且腐胺可通过影响MAM间Ca2+传递缓解线粒体钙超载,改善线粒体功能.

目的:检测小鼠各期卵母细胞中血清和糖皮质激素诱导蛋白激酶3(SGK3)mRNA和蛋白的表达及其亚细胞定位,为阐明SGK3 对小鼠卵母细胞周期变化的调控作用机制提供依据.方法:通过超排卵技术收集小鼠生发泡(GV)期、生发泡破裂(GVBD)期、第 1 次减数分裂(MⅠ)期卵母细胞和第2次减数分裂(MⅡ)期卵母细胞,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和Western blotting法检测各期小鼠卵母细胞中SGK3 mRNA和蛋白表达水平,收集GV、GVBD和MⅠ期卵母细胞后采用Western blotting法检测小鼠各期卵母细胞中Cdc25B-Ser30的磷酸化表达情况,免疫荧光法观察小鼠各期卵母细胞中SGK3亚细胞定位情况.结果:在小鼠各期卵母细胞中均有SGK3 mRNA和蛋白表达.与GV期比较,GVBD和MⅡ期卵母细胞中SGK3 mRNA和蛋白表达水平升高(P<0.01);与GVBD期比较,MⅠ期卵母细胞中SGK3 mRNA和蛋白表达水平降低(P<0.01),MⅡ期卵母细胞中SGK3 mRNA和蛋白表达水平升高(P<0.01);与MⅠ期比较,MⅡ期卵母细胞中SGK3 mRNA和蛋白表达水平升高(P<0.01).Cdc25B-Ser30在GV期被去磷酸化,在GVBD和MⅠ期被磷酸化.小鼠的GV期卵母细胞中SGK3定位于细胞核膜,在GVBD期前进入细胞核,在GVBD期定位于细胞核,MⅠ期则分布于整个细胞,在MⅡ期则由细胞浆再次进入细胞核.结论:小鼠各期卵母细胞中SGK3均呈动态表达,SGK3存在核浆穿梭,SGK3定位的动态变化可能参与了细胞周期B的激活.

目的 探究以烟酰胺(NAM)和烟酸(NA)为主要有效成分的特医食品精优能对卵巢早衰(POF)的挽救作用.方法 对3周龄ICR雌鼠进行单次白消安腹腔注射建立POF模型,对POF模型鼠连续灌胃28 d不同浓度的精优能,确定恰当的精优能处理用量(200 mg·kg-1·d-1).再按照处理不同将3周龄ICR雌鼠进行分组:空白对照组(CTRL组),给予PBS连续灌胃28 d;空白精优能处理组(C+200组),给予200 mg·kg-1·d-1精优能连续灌胃28 d;模型对照组(B组),白消安单次注射后,予PBS连续灌胃28 d;模型鼠精优能处理组(B+200组),白消安单次注射后,予200 mg·kg-1·d-1精优能连续灌胃28 d.各组处理28 d后,统计各组小鼠体重、卵巢指数、子宫指数;利用免疫组织化学染色法统计卵泡总数及各级卵泡比例;染色法采用卵母细胞体外培养技术统计卵子成熟率;并通过实时定量荧光PCR、蛋白质免疫印迹法检测卵巢内卵泡发育相关基因、蛋白及部分抗氧化酶的表达量.结果 持续200 mg·kg1·d-1的精优能灌胃28 d能够显著改善POF小鼠卵巢部分抗氧化酶(Sod2、Cat、Gpx4)的表达水平(P＜0.05),显著改善POF小鼠的卵巢和子宫指数(P＜0.05),显著增加卵泡数目(P＜0.05),显著改善卵泡发育及卵巢储备相关基因(Gdf9、Bmp15、Amh)的表达水平(P＜0.05),以及显著提高GV期卵母细胞数量和第一极体排出率(P＜0.05).结论 精优能能够提高POF小鼠卵巢的抗氧化能力,维护卵巢储备与卵母细胞成熟,缓解POF的发展.

目的 观察时差监测培养系统在人未成熟卵母细胞体外成熟(IVM)中的应用,并探讨核成熟后最佳的授精时机. 方法 收集我生殖中心促排卵周期中捐赠用于科研的240枚GV期卵母细胞,应用时差监测培养系统联合IVM技术,观察卵母细胞核成熟的动力学参数,包括GV破裂时间、第一极体排出时间、MⅠ持续和MⅡ静止的时间段.经过培养,对其中160枚卵母细胞根据第一极体排出后不同ICSI授精时间分为3组:＜3 h组、3～6h组和＞6 h组,比较各组的受精情况及胚胎发育情况. 结果 240枚GV期卵母细胞体外成熟率为73.3％,平均GV破裂时间为实施IVM后的(7.0±0.3)h,MI持续平均时间为(14.9±0.2)h,第一极体排出平均时间为(22.7±0.5)h.不同授精时间3组的正常受精率、卵裂率和可利用胚胎率比较均无显著性差异(P＞0.05). 结论 时差监测培养系统为未成熟卵母细胞IVM培养系统优化提供了新思路;第一极体排出后的3～6 h实时ICSI可用胚胎率有增高的趋势,但其具体影响及最佳授精时间仍有待进一步研究探讨.

目的 探讨体外受精-胚胎移植(IVF-ET)周期未成熟卵体外成熟培养(IVM)的临床价值. 方法 对106例不孕患者IVF/ICSI-ET治疗周期中357枚未成熟卵(MⅠ期,21 7枚;GV期,140枚)进行24 h和48 h体外培养,比较不同发育阶段未成熟卵的体外成熟率、受精率、卵裂率、优质胚胎率及囊胚形成率. 结果 MⅠ期卵24 h和48 h总成熟率均显著高于GV期卵(分别为59.91％ vs.24.29％和72.35％ vs.42.86％)(P＜0.05);体外成熟MⅡ卵平均每取卵周期可利用胚胎数只有(0.50±0.84)枚,且受精率、卵裂率和优胚率、可利用胚胎数均显著低于同一促排卵周期体内成熟MⅡ卵(P＜0.05).结论 IVF-ET周期中所获未成熟卵经IVM能发育成熟,并具备一定的受精和胚胎发育潜能,但相关指标明显低于体内成熟卵,临床应用价值有限.

目的 研究小鼠卵母细胞减数分裂进程中活化的LIMK1(pLIMK1Thr508)与Aurora-A亚细胞分布的相关性, LIMK1活性变化对Aurora-A和纺锤体组装的影响.方法 收集21日龄CB6F1小鼠卵母细胞,分别体外培养至生发泡期(GV)、生发泡破裂期(GVBD)、第1次减数分裂中期(MI)、第1次减数分裂后期(AI)和末期(Tel I)以及第2次减数分裂中期(MII),固定并利用免疫荧光染色法分析减数分裂进程中pLIMK1Thr508的亚细胞定位模式及其与纺锤体组装调控因子Aurora-A的时空相关性;利用抑制剂BMS-3处理MI期细胞,结合免疫荧光染色分析LIMK1活性缺失对于Aurora-A空间分布和纺锤体形成的影响.结果 在小鼠卵母细胞减数分裂前期(prophase)(即GV期), pLIMK1Thr508信号微弱并主要聚集于生发泡,此时 Aurora-A 在胞内没有特殊聚集;在临近减数分裂重启时, pLIMK1Thr508离开生发泡,Aurora-A 信号出现,两者呈高度致密的点状聚集并紧密重合;在生发泡完全破裂后, pLIMK1Thr508和Aurora-A又呈多个点片状聚集在凝集的染色体周围;在MI期和MII期,pLIMK1Thr508与Aurora-A共同定位于纺锤体两极;在从AI期到Tel I期进程中pLIMK1Thr508离开纺锤体两极,聚集在收缩环部位,Aurora-A在纺锤体两极有微弱聚集.LIMK1抑制剂BMS-3能够破坏 Aurora-A在纺锤体两极的聚集,并影响纺锤体结构.结论 pLIMK1Thr508在卵母细胞减数分裂中是一种微管组织中心(MTOC)相关蛋白,可能通过调控Aurora-A而参与纺锤体结构的形成和维持.

目的:探讨控制性卵巢刺激(COS)对多囊卵巢综合征(PCOS)患者和正常排卵妇女GV期卵母细胞中差异表达基因和主要信号转导通路的影响,从而筛选出影响PCOS患者卵母细胞发育的关键基因.方法:选择接受GnRH-a长方案将调的控制性超排卵的PCOS患者3例(PCOS组)和同期因男性不孕因素接受长方案将调的正常排卵妇女3人(对照组),通过酶消化法分离颗粒细胞,收集经过卵胞浆内单精子显微注射(ICSI)之后废弃的未成熟卵母细胞.构建cDNA文库,在Illumina MiSeq测序平台进行测序,并通过RT-PCR技术对测序数据进行体外验证(每组3个重复).结果:获得了510 024 82个序列读取片段(reads),包含8G碱基序列信息.通过生物信息学软件共找到63个差异表达基因,极显著上调的基因19个,极显著下调基因有44个(Fold Change＞4,FDR＜0.01).PCOS组患者血管内皮生长因子(VEGF)和脂肪酸脱氢酶1(FADS1)mRNA表达水平明显高于对照组(P＜0.05),Runt相关转录因子2(RUNX2)、趋化因子1(CXCL1)和热体克蛋白27 (Hsp27) mRNA表达水平明显低于对照组(P＜0.05),与功能验证结果一致.差异基因基于GO功能注释可分为磷酰化、细胞自噬和转录调控等多个分支,利用KEGG数据库作为参考,这些基因主要富集于磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K-Akt)、转化生长因子β(TGF-β)、Hippo、p53和过氧化物酶体增殖剂激活受体(PPAR)信号通路中.结论:PCOS患者GV期卵母细胞中差异表达的基因可能影响卵泡发育和卵母细胞成熟,从而导致胚胎质量低下.

目的 探讨Syntaxin4参与小鼠卵母细胞皮质反应及对皮质反应的影响.方法 RT-PCR和Western blot检测Syntaxin4在小鼠卵母细胞表达;免疫荧光验证Syntaxin4与皮质颗粒在卵母细胞中的定位,分析Syntaxin4对小鼠卵细胞皮质反应的影响;活细胞实时拍摄系统观察降低Syntaxin4表达后皮质反应的动态变化.结果 (1)Syntaxin4在小鼠卵母细胞中表达,且在GV期和MII期无明显变化;(2)Syntaxin4与小鼠卵细胞皮质颗粒共定位;(3)活细胞实时拍摄证实降低Syntaxin4的表达后阻碍了皮质反应的进行.结论 Syntaxin4参与小鼠卵细胞皮质反应.