目的 探讨miRNAs是否参与非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)的发病过程以及miR-1290对NAFLD GH/IGF1轴调控的可能机制.方法 通过GenBank GEO数据库,Targetscan、mirBase、miRanda等miRNA生物数据库以及大量文献阅读筛选出在NAFLD中异常表达的miRNAs,再通过GO和KEGG分析靶基因预测软件筛选出与GH/IGF1轴基因相关的miRNAs;利用1 nmol/L游离脂肪酸(free fatty acid,FFA)诱导人肝细胞HL-7702(L02)并建立NAFLD的细胞模型(L02 NAFLD);通过不同浓度的rhGH、rhIGF1干预L02细胞及NAFLD细胞;观察不同浓度干预后相关miRNAs的基因表达变化;使用细胞转染技术进行验证.结果 与L02 细胞相比,L02 NAFLD 细胞中 miR-16、miR-1290、miR-122 的表达上调(P＜0.05).25、250 ng/mL rhGH 及 50、500 ng/mL rhIGF1分别干预L02细胞和L02 NAFLD细胞,干预后两组细胞的TG水平均较干预前明显上调(P＜0.05);miR-1290 和 miR-16 表达受抑制,尤其是 miR-1290 表达明显下调(P＜0.05).mimics miR-1290,L02 NAFLD 组中 GHR、IGFBP3、FASN 的表达差异均有统计学意义(P=0.021、0.045、0.020,均＜0.05),PPAR-γ、SREBP-1c水平差异无统计学意义(P＞0.05).结论 miRNAs在NAFLD中表达异常,miR-1290在NAFLD中表达上调,miR-1290可能通过GH/IGF1参与NAFLD脂质代谢及胰岛素抵抗发病过程.

目的:探讨Circ PNN(Circ PNN/hsa_Circ_0101802)在肝癌细胞中的表达，对肝癌细胞增殖和凋亡影响，以及调控肝癌细胞的分子机制。方法:通过全转录组高通量测序分析肝癌患者血浆中Circ PNN差异表达。实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测肝癌细胞Huh-7、SK-HEP-1中Circ PNN表达。应用siRNA干扰技术沉默后，细胞计数试剂盒(CCK-8)检测细胞增殖、流式细胞术检测凋亡、蛋白质印迹法(Western blot)检测半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶(Caspase)-3蛋白表达。Circ Bank数据库预测Circ PNN结合的miRNA及位点。结果:Circ PNN在肝癌患者血浆中的表达量显著高于非肝癌患者[差异倍数(FC)为268.63， P<0.05]。人HCC细胞系Huh-7和SK-HEP-1中Circ PNN的表达水平明显高于人正常肝细胞系HL-7702(8.206±0.118比0.950±0.010， P<0.05；20.822±0.288比0.950±0.010， P<0.05)。在SK-HEP-1细胞中转染Circ PNN siRNA-1和siRNA-2后，siRNA-1组、siRNA-2组细胞增殖能力低于对照组(0.826±0.040比1.022±0.053， P<0.05；0.492±0.027比1.022±0.053， P<0.05)；siRNA-1组、siRNA-2组SK-HEP-1细胞凋亡能力明显高于对照组(16.633±0.404比4.800±0.608， P<0.05；27.133±0.751比4.800±0.608， P<0.05)；siRNA-1组、siRNA-2组凋亡蛋白Caspase-3的相对表达量高于对照组(1.121±0.926比0.805±0.628， P<0.05；1.372±0.161比0.805±0.628， P<0.05)，可促进细胞的凋亡能力。Circ Bank数据库生物信息学预测Circ PNN上结合的miRNA数量为10个。 结论:肝细胞癌通过增高Circ PNN表达，通过分子海绵机制作用于miRNA，下调Caspase-3表达从而促进肝癌细胞增殖、抑制凋亡，调控肝细胞癌发生、发展。

研究采用氰酸盐负荷人正常肝细胞HL-7702，结果显示，氰酸盐可引起细胞内活性氧（ROS）含量升高；细胞内的抗氧化酶如超氧化物歧化酶和过氧化氢酶在氰酸盐处理后显著下降；细胞产生的脂质过氧化反应的终产物丙二醛和高反应性自由基一氧化氮在经氰酸盐负荷后显著升高；此外，细胞内核因子E2相关因子2、血红素加氧酶1及一氧化氮合成酶蛋白水平下调、肝细胞内脂滴明显增加。由此可见，氰酸盐可以打破肝细胞内氧化应激平衡，ROS大量产生，肝细胞内脂质沉积。

目的:观察rhGLP-1（7-36）对肝细胞Akt/GSK3信号通路的影响。方法:培养人HL7702细胞系至对数生长期，将其分为实验组和空白对照组，分别用含rhGLP-1（7-36）100nM的培养基、不含rhGLP-1（7-36）的培养基培养90min。用蛋白质免疫印迹法（Western blot）检测两组Akt、糖原合成酶激酶3（glycogen synthase kinase，GSK3）、糖原合酶（glycogen synthase，GS）水平。结果:与空白对照组（1.00±0.00）比，实验组p-Akt（Thr308）蛋白相对表达水平（1.81±0.28）明显增加（ P=0.01），Akt及p-Akt（Ser473）蛋白表达水平无明显变化；实验组p-GSK3α（Ser21）（1.27±0.09）、p-GSK3β（Ser9）（1.24±0.09）蛋白表达水平明显升高（ P值分别为0.003、0.002），GSK3α及GSK3β蛋白表达水平无明显变化；实验组p-GS（Ser641）蛋白表达水平（0.70±0.16）降低（ P=0.03），GS蛋白表达水平无明显变化。 结论:GLP-1可抑制GSK3/GS信号通路，激活GS活性，促进糖原合成。

目的:探讨α-酮戊二酸/铁依赖性双加氧酶同源蛋白1(ALKBH1)基因低甲基化在肝细胞癌发病机制及病情评估中的临床价值。方法:肝癌细胞(SMMC-7721、Bel-7402、MHCC97、HepG2及Hep3B)和正常肝细胞(HL-7702)购自美国典型培养物保存中心。选择2016年6月至2018年6月90例肝细胞癌患者为研究对象。采用重亚硫酸盐基因组测序聚合酶链反应(BSP)法检测ALKBH1基因甲基化并定量，采用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)法检测ALKBH1基因甲基化。统计并比较肝细胞癌患者肿瘤组织中ALKBH1基因甲基化和未甲基化患者平均疾病进展时间及3年生存率差异。计量资料比较行 t检验，计数资料采用 χ2检验。 结果:本组肝细胞癌患者肿瘤组织ALKBH1基因甲基化定量显著低于癌旁正常组织[甲基化定量(15.6±1.7)%比(57.8±3.5)%]，差异有统计学意义( χ2＝10.245， P<0.05)。SMMC-7721、Bel-7402、MHCC97、HepG2及Hep3B肝癌细胞ALKBH1基因甲基化定量显著低于HL-7702正常肝细胞[甲基化定量(25.1±2.1)%、(19.5±1.8)%、(16.7±1.3)%、(23.6±1.9)%、(20.3±1.5)%比(62.1±4.2)%]，差异有统计学意义( χ2＝16.133， P<0.05)。本组肝细胞癌患者肿瘤组织ALKBH1基因甲基化率显著低于癌旁正常组织(25.6%比63.3%)，差异有统计学意义( χ2＝36.897， P<0.05)。肝细胞癌患者肿瘤组织ALKBH1基因甲基化率在肿瘤最大径、病灶数量、分化程度和临床分期方面存在显著差异，肿瘤最大径≥5 cm、病灶数量多发、低中分化和Ⅲ期期肝细胞癌患者肿瘤组织ALKBH1基因甲基化率显著低于肿瘤最大径<5 cm、病灶数量单发、高分化和Ⅰ期+Ⅱ期肝癌患者(甲基化率分别21.2%比38.6%、5.0%比31.4%、12.8%比35.3%、4.0%比31.9%)，差异有统计学意义( χ2＝4.328、4.406、4.745、4.881，均 P<0.05)。肿瘤组织ALKBH1基因未甲基化患者平均疾病进展时间为(23.7±2.1)个月，3年生存率为52.4%，ALKBH1基因甲基化患者平均疾病进展时间为(29.5±2.7)个月，3年生存率为78.8%，ALKBH1基因未甲基化患者平均疾病进展时间和3年生存率显著低于ALKBH1基因甲基化患者( t或 χ2＝14.233、9.788， P<0.05)。 结论:ALKBH1基因低甲基化与肝细胞癌发病机制明显相关，可作为肝细胞癌病情及预后评估的基因水平标志物。

目的:探讨Kruppel样转录因子6(KLF6)基因调控谷氨酰胺酶2(GLS2)对人肝癌细胞系Bel7404、Huh7增殖的影响。方法:采用定量聚合酶链反应(qPCR)和蛋白印迹法(Western blot)检测正常肝细胞和肝癌细胞中KLF6的mRNA和蛋白表达(上海细胞库)。沉默KLF6基因，细胞计数试剂盒(CCK-8)和细胞增殖实验(EdU)检测细胞增殖；结合前期实验基础、转录因子结合位点数据库(JASPAR)辅助筛选KLF6结合GLS2结合序列；染色质免疫共沉淀(CHIP)验证转录因子KLF6结合GLS2的序列；qPCR、Western blot检测沉默KLF6，GLS2的mRNA和蛋白的表达量。结果:KLF6在人肝癌细胞系HepG2(0.12±0.01)、HepG3B(0.11±0.02)、BEL-7404(0.44±0.02)、Huh7(0.34±0.03)中mRNA表达低于正常细胞HL7702(1.00±0.01)，具有统计学意义( t＝172.80、113.90、61.64、44.41， P<0.01)；Western blot检测KLF6在HepG2(0.57±0.02)、HepG3B(0.53±0.01)、BEL-7404(0.73±0.01)、Huh7(0.66±0.01)中蛋白表达水平低于HL7702，差异有统计学意义( t＝37.79、42.17、31.40、40.13， P<0.01)；沉默KLF6基因，CCK-8检测Huh7在0、24、48、72 h增殖能力(0.20±0.01、0.30±0.01、0.45±0.04、0.63±0.02)高于对照组(0.20±0.01、0.29±0.01、0.35±0.03、0.47±0.01)，差异有统计学意义( F＝43.46， P<0.01)；CCK-8检测Bel7404在0、24、48、72 h增殖能力(0.20±0.01、0.27±0.01、0.42±0.02、0.62±0.04)高于对照组(0.20±0.01、0.26±0.01、0.36±0.01、0.44±0.02)，差异有统计学意义( F＝141.40， P<0.01)；EdU检测Huh7中3个不同抑制剂sh-KLF6-1、sh-KLF6-2、sh-KLF6-3增殖率(56.83%、52.68%、45.43%)高于对照组(35.32%)，差异有统计学意义( t＝6.68、4.10、3.86， P<0.01)；同理检测Bel7404中3个不同抑制剂增殖率(53.61%、49.32%、42.16%)高于对照组(32.75%)，差异有统计学意义( t＝3.48、2.89、2.31， P<0.01)；沉默KLF6基因，Huh7细胞在3种不同抑制剂sh-KLF6-1、sh-KLF6-2、sh-KLF6-3中GLS2的mRNA表达(0.01±0.00、0.13±0.01、0.44±0.02)低于对照组(1.01±0.01)，差异有统计学意义( t＝94.63、23.54、27.04， P<0.01)；实验组蛋白表达(0.41±0.01、0.64±0.10、0.87±0.02)低于对照组(1.00±0.01)，差异有统计学意义( t＝15.11、9.57、3.88， P<0.01)；Bel7404细胞在sh-KLF6-1、sh-KLF6-2、sh-KLF6-3中GLS2的mRNA表达(0.04±0.01、0.29±0.10、0.33±0.02)低于对照组(1.00±0.01)，差异有统计学意义( t＝30.21、21.82、20.92， P<0.01)；实验组蛋白表达(0.36±0.01、0.66±0.10、0.72±0.02)低于对照组(1.00±0.01)，差异有统计学意义( t＝59.99、36.50、21.80， P<0.01)。 结论:KLF6介导的GLS2调控途径显著抑制肝癌细胞的增殖。

目的:检测甲磺酸盐及紫外线敏感性81号基因(Mus81)在肝细胞癌中的表达，并观察Mus81对人肝癌细胞迁移、侵袭及转移能力的影响。方法:32例组织标本选自2020年1月至2021年6月在暨南大学附属广州红十字会医院进行手术切除的肝细胞癌患者的肝癌组织及相应癌旁组织。分析Mus81在32例肝癌标本、癌症基因组图谱数据库的374例肝癌样本、人正常肝细胞系HL-7702和人肝癌细胞系JHH-7、Huh-7、Hep3B中的表达水平，构建Mus81敲减的JHH-7、Huh-7和过表达的Hep3B肝癌细胞系，通过划痕实验、Transwell迁移及侵袭实验和裸鼠尾静脉注射转移实验观察Mus81对肝癌细胞的影响。结果:Mus81在肝癌组织或细胞系中的表达量高于癌旁组织或正常肝细胞系，差异有统计学意义(均 P<0.05)。Mus81敲减的Huh-7肝癌细胞的迁移率、转移及侵袭细胞数分别为22.24%±2.16%、49.04±5.62、3.81±1.08，阴性对照组分别为26.89%±1.15%、86.81±4.79、19.78±3.30，两组比较差异有统计学意义( t＝4.24、26.59、23.92，均 P<0.01)；Mus81过表达的Hep3B肝癌细胞迁移率、转移及侵袭细胞数分别为80.57%±5.12%、18.74±8.07、33.81±8.44，均高于空载体组的64.17%±7.20%、10.96±5.32、3.04±1.13，差异有统计学意义( t＝4.15、4.18、18.78，均 P<0.01)。裸鼠尾静脉转移实验显示，注射Mus81敲减组JHH-7细胞的裸鼠总荧光量、转移瘤重量均低于对照组，且肾、脊柱、颈部、腋下及皮下的转移率均低于对照组，差异有统计学意义(均 P<0.05)。 结论:Mus81基因在肝癌中表达上调，且可促进肝癌细胞的迁移、侵袭、转移能力，提示Mus81可能是一个潜在的肝细胞癌治疗靶点。

目的:探讨miR-124-3p和miR-506-3p在蛋白C(protein C，PROC)降低中的作用及机制。方法:将PROC 3'-UTR野生型(PROCwt)和PROC 3'-UTR突变型(PROCmut)克隆构建到含萤火虫荧光素酶报告质粒中(Luc-PROCwt和Luc-PROCmut)，利用双荧光素酶报告体系检测相对荧光素酶酶活性，明确miR-124-3p和miR-506-3p与PROC的靶基因关系及其紧密性。将miR-124-3p mimics和miR-506-3p mimics及其抑制基因(inhibitor)分别转染至HL-7702细胞，检测对照组(NC)、miR-506-3p组、miR-124-3p组、miR-506-3p抑制组和miR-124-3p抑制组的细胞增殖率，PROC mRNA表达水平，PROC、COX-2、Bcl-2和Bax蛋白表达水平和细胞凋亡水平，并采用单因素和双因素方差分析比较各组间的差异。结果:双荧光素酶报告体系检测显示，NC＋Luc-PROCwt组、miR-506-3p＋Luc-PROCwt组、miR-124-3p＋Luc-PROCwt组、NC＋Luc-PROCmut组、miR-506-3p＋Luc-PROCmut组和miR-124-3p＋Luc-PROCmut组荧光素酶活性分别为6.98±0.07、2.01±0.05、2.67±0.06、8.13±0.26、6.91±0.14和8.41±0.13。与NC＋Luc-PROCwt组相比，miR-506-3p＋Luc-PROCwt组与miR-124-3p＋Luc-PROCwt组的荧光素酶活性均明显降低，差异均有统计学意义( P均<0.01)；与NC＋Luc-PROCmut组相比，miR-506-3p＋Luc-PROCmut组荧光素酶活性明显降低，miR-124-3p＋Luc-PROCmut组荧光素酶活性明显升高，组间比较，差异亦均有统计学意义( P<0.01和 P＝0.018 1)。CCK-8检测显示，NC组、miR-506-3p组、miR-124-3p组、miR-506-3p抑制组和miR-124-3p抑制组96 h时细胞增殖率分别为0.506±0.016、0.323±0.021、0.329±0.011、0.570±0.007和0.562±0.007。与NC组相比，miR-506-3p组和miR-124-3p组细胞增殖率均有所下降，组间差异均有统计学意义( P均<0.01)；miR-506-3p抑制组和miR-124-3p抑制组细胞增殖率均有所上升，组间差异亦均有统计学意义( P均<0.01)。RT-PCR检测显示，NC组、miR-506-3p组、miR-124-3p组、miR-506-3p抑制组和miR-124-3p抑制组PROC mRNA表达量分别为1.00±0.08、0.31±0.09、0.34±0.04、1.73±0.28和1.75±0.36。与NC组相比，miR-506-3p组和miR-124-3p组PROC mRNA表达水平均明显降低，组间差异均有统计学意义( P＝0.002 6和0.003 2)；miR-506-3p抑制组和miR-124-3p抑制组PROC mRNA表达水平均明显上升，组间差异亦均有统计学意义( P＝0.001 8和0.001 6)。Western-blot检测显示，与NC组相比，miR-506-3p组与miR-124-3p组PROC与Bcl-2蛋白表达水平下调，COX-2和Bax蛋白表达水平上调；miR-506-3p抑制组和miR-124-3p抑制组PROC与Bcl-2蛋白表达水平上调，COX-2和Bax蛋白表达水平下调。Annexin V-FITC/PI检测显示，NC组、miR-506-3p组、miR-124-3p组、miR-506-3p抑制组和miR-124-3p抑制组细胞凋亡率分别为(10.27±0.57)%、(21.50±1.44)%、(13.52±0.40)%、(1.12±0.08)%和(7.63±0.40)%。与NC组相比，miR-506-3p组和miR-124-3p组细胞凋亡率均明显升高，组间差异均有统计学意义( P均<0.01)；miR-506-3p抑制组和miR-124-3p抑制组细胞凋亡率均明显降低，组间差异亦均有统计学意义( P均<0.01)。 结论:PROC是miR-506-3p和miR-124-3p的靶基因，miR-506-3p和miR-124-3p可能通过抑制肝细胞增殖、促进肝细胞凋亡和抑制PROC mRNA表达引发PROC蛋白表达水平降低。

目的:探究肝癌和胱硫醚β-合成酶（cystathionine β-synthase, CBS）基因及胱硫醚γ-裂解酶（cystathionine-γ-lyase,CTH）基因的关系。方法:通过挖掘GEO（gene expression omnibus）与TCGA（the cancer genome atlas）数据库，对肝癌的临床特征与CBS及CTH基因表达进行了相关性分析。并通过对肝癌细胞系进行免疫印迹验证。结果:CBS及CTH在肿瘤中的表达较非肿瘤明显降低（ P < 0.05）。Cox回归结果显示CBS是肝细胞癌不良预后的独立危险因素（ HR = 0.65， P = 0.02）。针对CBS基因对不同肿瘤分期进行单因素 logistics回归分析，发现肝癌TNM分期II期比I期（ P =0.01， OR=0.50）、III期比I期（ P =0.03， OR=0.56）、T分期T2期比T1期（ P <0.01， OR=0.43）、T3期比T1期（ P = 0.02， OR=0.54）CBS基因显著降低。肝癌TNM分期III期比I期（ P = 0.01, OR=0.50）, Edmondson分期II期比I期（ P =0.03， OR=0.48）, III期比I期（ P <0.01， OR=0.30）, IV期比I期（ P = 0.03， OR=0.22）CTH基因表达显著降低。GSEA富集分析结果显示，与肝癌细胞CTH与CBS基因表达相关性最高的信号通路为细胞色素P450（FDR Q < 0.01，FWER P < 0.01）。免疫印迹结果显示，与人肝永生化细胞系HL-7702相比，HLE和Hep3B细胞等肝细胞癌细胞系中CTH下游蛋白CSE表达降低。 结论:肿瘤组织中的CBS及CTH基因表达低于正常组织。CBS基因是肝细胞癌不良预后的独立危险因素。与CBS及CTH基因关系最为密切的是信号通路为细胞色素P450通路。

目的:观察细丝蛋白A(FLNa)在人原发性肝细胞癌中的表达，探究其对肝癌细胞恶性生物学行为的影响。方法:采用免疫组织化学法及实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)法检测70例原发性肝癌及对应癌旁组织中FLNa表达，分析其与患者临床病理特征及预后间的相关性；RT-qPCR法检测不同肝癌细胞株(SMMC-7721、HepG2、HCCLM3、Huh7、PLC/PRF/5、Hep3B)与正常肝脏细胞株HL-7702中FLNa mRNA表达。慢病毒转染法构建过表达FLNa的Hep3B细胞株，RT-qPCR检测转染；噻唑蓝(MTT)法、平板克隆实验、Transwell实验检测细胞增殖、克隆及侵袭迁移能力变化；蛋白质印迹法(Western blot)检测细胞外调节蛋白激酶2(ERK2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、磷酸化p38丝裂原活化蛋白酶(p-p38MAPK)表达，采用单因素方差分析、 χ2检验、LSD- t检验或秩和检验对上述所得数据进行统计分析。 结果:肝癌组织中FLNa阳性表达率低于癌旁组织(14.3%比81.4%， χ2＝9.725， P<0.05)，FLNa在肝癌组织中表达水平明显低于癌旁正常组织(3.13±1.02比22.01±2.38， t＝6.520， P<0.05)，其表达与肿瘤大小、TNM分期、肿瘤分化程度、脉管浸润及淋巴结转移有关( χ2肿瘤大小＝6.400， χ2分化程度＝10.850， χ2脉管浸润＝4.055， χ2淋巴结转移＝7.256，均 P<0.05)，但与性别、年龄、肿瘤部位及AFP水平无明显相关( χ2性别＝0.000， χ2年龄＝0.010， χ2肿瘤部位＝0.038， χ2AFP＝3.276，均 P>0.05)。FLNa阳性表达患者中位生存期显著高于阴性表达者(23.3个月比10.3个月， P<0.05)。各肝癌细胞株中FLNa表达量均低于HL-7702细胞株(1.95±0.45、1.90±0.58、1.89±0.72、1.99±0.10、1.90±0.49、1.81±0.17比14.08±2.52， FSMMC-7721＝4.120， FHepG2＝4.774， FHCCLM3＝4.655， FHuh7＝4.987， FPLC/PRF/5＝3.735， FHep3B＝5.094，均 P<0.05)。过表达FLNa的Hep3B细胞增殖、克隆及侵袭迁移能力显著降低，ERK2、MMP-9、p-p38MAPK表达明显下降(均 P<0.05)。 结论:FLNa在人原发性肝癌中低表达，过表达FLNa可通过抑制MAPK/ERK信号通路活化而抑制肝癌细胞恶性生物学行为。