目的:探讨1个Lesch-Nyhan综合征家系的遗传学病因。方法:选取2022年2月10日在临沂市人民医院接受遗传咨询的1个Lesch-Nyhan综合征家系作为研究对象。收集先证者的临床资料及家族史，对先证者及其父母进行家系全外显子组测序(trio-WES)，对候选变异进行Sanger测序家系验证。结果:先证者主要表现为精神及行为异常、运动发育迟缓和高尿酸血症，其表弟存在类似症状。基因检测发现先证者及其表弟均携带既往未见报道的 HPRT1基因c.385-1G>C半合子变异，先证者母亲、外祖母、大姨、小姨、表妹均携带 HPRT1基因c.385-1G>C杂合变异，家系中表型正常的男性该位点均为野生型，符合X连锁隐性遗传的特征。 结论:HPRT1基因c.385-1G>C半合子变异可能是该Lesch-Nyhan综合征家系的遗传学病因。

一些肾结石病是由单基因病所致，其中与嘌呤代谢相关的单基因病主要包括腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(APRT)缺乏症、次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖基转移酶(HPRT)缺乏症、遗传性黄嘌呤尿症(HX)以及由PRS1、SLC22A12、SLC2A9和ABCG2等基因突变所致病症。这类疾病可导致嘌呤和尿酸代谢异常，进而形成2，8-二羟基腺嘌呤结石、尿酸结石或黄嘌呤结石等。此类疾病临床罕见，不同类型的与嘌呤代谢相关的单基因肾结石病的基因型和表型有其各自特点，且不被广泛认知。目前药物治疗是此类疾病的主要治疗方法。随着基因诊断和治疗技术的进步，不断有新的致病基因和位点被发现，同时随着CRISPR/Cas9等基因编辑技术的逐步应用，与嘌呤代谢相关的单基因肾结石病在未来有望从根本上得到治愈。

目的:探讨Lesch-Nyhan综合征的病因、临床诊断和治疗策略。方法:回顾性分析2019年8月郑州市第一人民医院收治的2例严重运动障碍、智力障碍和复杂性泌尿系结石患者的病例资料。例1，男，9岁，因泌尿系多发结石入院。入院前1年因双肾多发结石、膀胱结石于外院行经尿道膀胱结石钬激光碎石取石术。术后结石成分分析结果为无水尿酸结石。术后1周复查膀胱充盈良好，未见残留结石。本次入院前1周复查彩色多普勒超声示双肾多发结石并膀胱结石。既往发育落后，智力低下。足月剖宫产，无出生缺氧、窒息及抢救史。查体：清醒状态，任何刺激均无语言反应；右侧鼻唇沟浅，口角左斜；竖头、独坐、站立等大运动丧失；躯干呈扭转性痉挛状态，四肢肌力2~3级，四肢呈痉挛性肌张力增高状态，四肢关节僵硬，双手呈握拳状，无不自主运动和肌束震颤；肱二头肌反射、膝腱反射未引出，病理反射阳性。血尿酸517μmol/L。例2，男，6岁，为例1胞弟。家属代诉例2患儿间断发热2年余，每次发热持续时间和体温表述不清，未予特殊治疗。体征和查体与例1类似。影像学检查提示双肾结石。血尿酸373μmol/L。为明确诊断，联合河南省人民医院遗传研究所会诊并行基因检测。采用全外显子测序技术对例2和其父母进行全外显子检测，采用Sanger测序技术对例2和其父母进行突变位点检测验证。查找NCBI-Homologene数据库中人HPRT1基因的同源序列，并与其他物种进行对比，分析蛋白的保守性。利用在线网站PredictProtein(http：//www.predactprotein)对HPRT1基因的二维结构进行预测。结果:基因测序结果显示，例2的HPRT1基因存在1个新发突变(c.571T>G [p.Tyr191Asp])，该突变遗传自患儿母亲。结合患儿临床表现和基因检测结果诊断为Lesch-Nyhan综合征。基因分析结果显示，191位置氨基酸Tyr和其前后氨基酸均具有高度的保守性，191位置氨基酸参与蛋白的β折叠。对例2进行最低剂量的别嘌呤醇和儿童常规剂量的枸橼酸氢钾钠颗粒治疗，并予低嘌呤饮食。治疗3个月后复查血尿酸降至255μmol/L，泌尿系结石较前未见明显增多。结论:结合患儿临床表现和HPRT1基因检测结果可诊断Lesch-Nyhan综合征。对于此类患者，最低剂量的别嘌呤醇和儿童常规剂量的枸橼酸氢钾钠颗粒治疗，结合饮食治疗的效果较好。

目的:探讨Lesch-Nyhan综合征(Lesch-Nyhan syndrome, LNS)的临床及遗传学特征。方法:收集1例LNS患儿的临床资料，并进行遗传学分析。结果:男性患儿，9月龄，反复血钾高、酸中毒8个月，运动发育异常2个月。血生化检查示高血钾、高尿酸血症。全外显子组测序发现X染色体 HPRT1基因第3外显子c.318+1 G>A变异，来源于母亲，确诊为LNS。 结论:HPRT1基因c.318+1 G>A变异可能为该家系中患儿的致病原因，基因检测结果为患儿诊疗方案的制定、家系的遗传咨询和产前诊断提供了依据。

目的:分析一个无先证者标本的Lesch-Nyhan综合征(Lesch-Nyhan syndrome，LNS)家系的 HPRT1基因变异为其提供产前诊断。 方法:该家系中所有的男性患儿均于童年夭折，无法获得任何生物学标本。根据患儿典型的神经系统功能障碍和自残倾向，推断其患有LNS。用Sanger测序对家系中的女性成员进行 HPRT1基因变异分析。针对该致病变异位点，对高危胎儿进行产前基因诊断。 结果:先证者母亲及其他3位女性成员均携带 HPRT1基因的c.500_501delGGinsC(p.Arg167fs*23)杂合致病变异，既往未见报道。产前诊断结果显示胎儿为男性，并携带上述致病变异。 结论:通过Sanger测序确定了一个无先证者标本的LNS家系的 HPRT1基因致病变异，为其遗传咨询和产前诊断提供了依据。

目的:研究C/EBPγ在肝癌中的表达水平，探讨其对肝癌细胞增殖和迁移的相关性作用。方法:自2018年10月至2019年4月，在上海市松江区中心医院中心实验室，采用体外细胞实验，pLKO.1组为对照组，shg1组和shg2组为干扰组。采用Ocomine人类肿瘤芯片数据库（https：//www.oncomine.org/resource/login.html）和荧光定量PCR比较分析C/EBPγ在肝癌组织及肝癌细胞株中的转录水平。肝癌细胞株HepG2和Hep3B采用DMEM（10% FBS）、THLE-3细胞应用BEBM加生长因子37 ℃、5%CO 2培养。构建shC/EBPγ-pLKO.1腺病毒载体，与包装载体pMD2G、pMDLG/REE和pRSV/Rev共转染293T细胞，空白载体pLKO.1作为对照，12~16 h后收集病毒上清感染HepG2细胞，重复感染4次后加入嘌呤霉素（puromycin 2 μg/mL）选择培养48~72 h，1 μg/mL嘌呤霉素维持培养，显微镜下观察细胞状态。采用生长曲线（0、2、4和6 d）检测增殖；采用无血清培养或加入抗氧化剂NAC培养0.5、1、3、6、12和24 h后，DFH-DA法检测ROS浓度，采用Real-time PCR检测氧化应激相关基因的转录水平；采用划痕实验检测细胞迁移能力。两独立样本比较采用 t检验，三组以上采用单因素方差分析，两两比较采用LSD方法。 结果:Oncomine数据库显示肝癌组织C/EBPγ mRNA水平明显高于正常肝组织，且肝癌分级越高，其基因组中C/EBPγ DNA重复序列拷贝数越高，荧光定量PCR结果显示肝癌细胞株（HepG2和Hep3B）C/EBPγ mRNA水平明显高于正常肝细胞株（THLE-3）。C/EBPγ干扰组4 d（shg1：1.93±0.70；shg2：1.28±0.40）、6 d（shg1：3.05±0.90；shg2：1.31±0.60）增殖显著低于对照组（4 d：6.18±0.80；6 d：22.41±2.56）（ F=1 507.971， P<0.05）；营养缺乏状态下，干扰组细胞活性氧（ROS）水平与对照组相比明显升高，干扰组氧化应激相关基因（HPRT1、NQO1-tv2和NQO1-tv4）转录水平12 h和24 h明显升高；划痕实验显示72 h干扰组（shg1∶174 922.58±1 239 376.00；shg2∶1 374 656.00±248 882.79）非愈合面积显著高于对照组（66 690.82±1 278 954.00）（ F=39.871， P<0.05）；加入NAC后，C/EBPγ组6 h细胞增殖率明显提高，0.5、1和3 h细胞活性氧水平显著降低（ F=7.587，4.657，3.903， P<0.05）。 结论:C/EBPγ在肝癌细胞高表达；降低C/EBPγ表达后，肝癌细胞增殖和迁移明显抑制、活性氧水平和氧化应激相关基因明显升高，提示高表达的C/EBPγ通过降低活性氧水平促进肝癌细胞的增殖和迁移。

Lesch-Nyhan综合征(Lesch-Nyhan syndrome,LNS)是一种先天性的嘌呤代谢缺陷病,次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(hypoxanthine phosphoribosyltransferase,HPRT)是其主要致病基因,临床特征表现为尿酸分泌过多、痛风、肾结石及肾脏损伤等,目前致病机制尚未被完全阐明且无有效治愈手段.动物模型在疾病致病机理研究和治疗方式探索中发挥着重要功能.本研究采用高效的CRISPR/Cas9基因编辑技术和显微注射的方式敲除家兔(Oryctolagus cuniculus)HPRT基因建立了 LNS家兔模型,以期能更好的模拟该疾病的表型.首先针对兔HPRT基因第3外显子设计一条sgRNA,将体外转录的sgRNA和Cas9mRNA共注射到兔受精卵中,注射后的胚胎移植到代孕母兔子宫中,待仔兔出生后对其基因型及表型进行鉴定与分析.共出生4只仔兔(分别编号为Rl、R2、R3和R4),测序结果显示4只仔兔都产生了不同程度的基因修饰,基因编辑效率达100％,其中R4仔兔T载体测序结果在基因编辑靶点未检测到野生型序列.通过6-硫代鸟嘌呤(6-Thioguanine,6-TG)药物测试,证明R4仔兔HPRT酶活性缺失;肾组织HE染色发现4只仔兔表现出肾小球炎细胞浸润、集合管脱落等肾脏损失.本研究成功设计了 1条能够敲除家兔HPRT基因的sgRNA,并采用CRISPR/Cas9基因编辑技术和显微注射方式成功构建了HPRT基因修饰家兔,为研究LNS综合征致病机制和治疗方式提供了新的非啮齿类动物模型.

目的:筛选头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)差异预后乳酸代谢相关基因(LRGs),构建HNSCC 的LRGs预后模型,并阐明其潜在的作用机制.方法:由癌症基因组图谱(TCGA)数据库和基因表达综合(GEO)数据库获取HNSCC基因表达及临床数据,由GeneCards数据库中获取LRGs,采用 R软件筛选 HNSCC的LRGs.采用单因素Cox回归分析得到预后相关基因,基于预后相关LRGs鉴定出 2 种不同亚型,采用Kaplan-Meier(K-M)曲线分析比较 2 组患者预后,采用CIBERSORT算法进行2组患者间的免疫相关分析.采用多因素 Cox回归分析和LASSO回归分析构建预后模型,采用受试者工作特征曲线(ROC)和 K-M生存曲线评估LRGs 与 HNSCC 患者生存和预后的关系.采用GSE27020、GSE41613 和 GSE65858数据集验证预后模型.基于风险评分进行分组,并进行免疫相关分析和肿瘤相关评分分析.结果:通过TCGA数据库从 HNSCC样本中差异分析筛选出1 196个LRGs,单因素 Cox 回归分析筛选出 27个差异表达基因(DEGs)与 HNSCC患者预后相关,根据预后相关基因鉴定出2种不同的LRGs亚型(分组1和分组2),K-M生存曲线显示分组2患者总生存期(OS)明显高于分组1,分组 2患者免疫细胞浸润水平明显高于分组1.多因素 Cox回归分析和LASSO回归分析筛选出9个LRGs,包括次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶 1(HPRT1)、淀粉样蛋白前体蛋白(APP)、糖原磷酸化酶(PYGL)、尿激酶型纤溶酶原激活物(PLAU)、大麻素受体 2(CNR2)、斯钙素2(STC2)、核苷酸结合寡聚化结构域样受体1(NLRP1)、整合素连接激酶(ILK)和叉头框蛋白B1(FOXB1),构建预后模型,K-M曲线和ROC 曲 线 显 示上述9个基因表达水平与HNSCC 患者生存和预后有关联,且均具有良好的 1、2 和 3 年生存预测作用,ROC 曲线下面积(AUC)均大于0.650,且预后模型的预后预测作用在GSE27020、GSE41613 和 GSE65858数据集中得到验证.根据风险评分分类的患者具有可区分的免疫状态.结论:基于生物信息学方法筛选出的HNSCC 差异表达LRGs与 HNSCC 患者生存和预后有关联,由 9 个LRGs构建的预后模型可预测HNSCC患者的生存情况和治疗反应.

目的 本课题组近年报道了非二噁英样多氯联苯化合物对哺乳动物细胞的致突变作用,且作用依赖于人细胞色素P450(CYP)2E1酶的代谢活化;本研究进一步探讨非二噁英样化合物2,4,4'-三氯联苯(PCB28)的致突变作用.方法 采用CCK8法、微核实验和Hprt致突变实验检测PCB28对中国仓鼠V79和重组表达人和硫酸基转移酶(SULT)1A1的V79衍生细胞(V79-hCYP2E1-hSULT1A1)的细胞毒性和遗传毒性,并利用酶抑制剂观察重组表达的酶对于受试物毒效应的影响.结果 PCB28(5～40 μmol/L)经12 h染毒、12 h恢复,对V79-Mz和V79-hCYP2E1-hSULT1A1细胞均无细胞毒作用,1-氨基苯并三唑(60 μmol/L,CYP抑制剂)和五氯苯酚(10 μmol/L,SULT1抑制剂)的与受试物同时暴露于V79-hCYP2E1-hSULT1A1细胞对细胞活力影响甚微.PCB28在5～20 μmol/L对V79-Mz细胞没有诱发微核的作用,但对V79-hCYP2E1-hSUT1A1细胞则明显增加其微核细胞率(P＜0.05),且具有浓度依赖效应;此作用可被1-氨基苯并三唑明显降低,而被五氯苯酚明显增强.PCB28(10～40 μmol/L)对V79-Mz细胞Hprt基因突变频率无影响,对V79-hCYP2E1-hSUT1A1细胞则诱发基因突变频率增加(P＜0.05),其作用呈浓度相关性.结论 PCB28可能经CYP2E1酶活化为致突变性代谢物,后者可由人SULT1A1酶代谢减毒;同其他非二噁英样多氯联苯类似,PCB28可能是一个由人CYP2E1酶活化的前致突变物.

目的 筛选不同饲料硒(selenium,Se)水平饲喂大鼠时,不同组织中稳定表达的内参基因(reference genes,RGs).方法 24只断乳雄性SD大鼠在缺Se饲养5周后,随机均分为4组,分别以Se含量＜0.01、0.25、3、5 mg/kg饲料饲喂4周后处死,取肝、睾丸、骨骼肌、脂肪组织等样品待检.以荧光定量PCR检测Actb、Atp5f1、B2m、Gapdh、Gusb、Hprt、Pgk1、Ppia、Rplp2、Rps18、Tbp、Ywhaz等12个候选内参基因的mRNA水平,以geNorm、NormFinder、BestKeeper、Delta CT和RefFinder等方法对其表达稳定性进行评价.结果 各组织中稳定性排名前4的内参基因是:肝中Ppia＞Atp5f1＞Rplp2 ＞Hprt;睾丸中Ywhaz＞Atp5f1 ＞Rplp2＞ Ppia;骨骼肌中Tbp＞Ppia＞B2m＞Rps18;脂肪组织中Hprt＞ Tbp ＞Atp5f1 ＞Pgk1;综合4种组织,则Rps18＞Hprt＞Rplp2＞Atp5f1.结论 分析不同饲料Se水平饲养大鼠的目标基因表达水平时,应根据组织类型选择适宜的内参基因.