目的:分析一个X连锁显性遗传Alport综合征家系 COL4A5基因的剪接突变位点，探索外显子特异性U1核小RNA（small nuclear RNA，snRNA）基因治疗的可能性。 方法:收集Alport综合征先证者及其家族成员临床资料，高通量测序技术检测先证者肾病系列基因全外显子组基因突变。用在线软件分析 COL4A5 c.546+5G>A变异引起的剪接位点改变及其致病性。用minigene实验验证和分析Alport综合征家系先证者 COL4A5基因突变位点c.546+5G>A及瞬时转染导入修饰过的U1 snRNA纠正剪接突变的效果。 结果:基因测序结果显示，先证者和其同母异父的兄长均存在 COL4A5基因半合子变异，变异位点为c.546+5G>A。在线软件分析剪接变异致病性的结果显示，突变后原有的Donor剪切位点检测不到，提示影响剪切可能性很大。杂交小基因检测结果验证了 COL4A5基因c.546+5G>A突变的异常剪接模式——外显子9缺失。经过修饰的U1 snRNA可部分纠正该异常的剪接突变，ExSpeU1（MT）、ExSpeU1（E9+1）、ExSpeU1（E9+9）、ExSpeU1（E9+11）对c.546+5G>A引发的外显子9缺失的纠正比例分别为0、43.81%、52.09%、48.12%。 结论:COL4A5新发剪接突变具有致病性，修饰过的U1 snRNA可部分纠正异常剪接。

目的:收集1例典型结节性硬化症患者的临床资料并检测其致病基因变异。方法:收集患者临床资料，应用二代测序法对患者进行致病基因筛查，采用Sanger测序法验证，构建迷你基因质粒转染至人肾上皮细胞系293T细胞，提取RNA进行转录分析。结果:患者临床表型包括反复癫痫发作，伴面部血管纤维瘤、甲周纤维瘤、肺淋巴管肌瘤病、肾血管平滑肌脂肪瘤及多发性骨质硬化。二代测序提示患者TSC2基因存在可疑致病变异，经Sanger测序验证，患者TSC2基因第4号外显子存在c.336_336+15delGGTAAGGCCCAGGGCG杂合突变，其父母及100名无关健康对照未检测出该位点变异。该突变位点既往未见报道。迷你基因实验显示，患者TSC2基因mRNA序列发生改变，原4号外显子剪切位点丢失，插入74 bp内含子序列，使剪切位置后移90 bp（r.336delins336+16_336+90）。结论:TSC2基因第4号外显子c.336_336+15delGGTAAGGCCCAGGGCG杂合变异可导致异常剪切，可能是该结节性硬化症患者病因。

目的:分析一例德朗热综合征1型胎儿的遗传学病因。方法:收集胎儿及其父母的临床资料，采集羊水及父母的外周血样，提取基因组DNA，通过全基因组低深度重测序、全外显子组测序(whole exome sequencing，WES)及Sanger测序筛查 NIPBL基因的变异位点，参考美国医学遗传学与基因组学学会指南判断变异的致病性，利用minigene技术分析变异对mRNA的影响。 结果:测序结果提示胎儿 NIPBL基因的内含子上存在c.5808+5G>A杂合变异，预测可能影响mRNA剪接，胎儿父母未检测到相同的变异。上述变异在ExAC、1000G、dbSNP等数据库中均未见收录，综合分析判断其为有害变异。minigene实验结果证实该变异会影响mRNA剪接，导致第31外显子的跳跃。 结论:确诊了一例德朗热综合征1型胎儿。minigene实验可以在体外验证WES检测所发现的剪接变异，可为判断这类变异的致病性提供更多的证据。

目的:探讨ATP结合盒转运蛋白B4（ABCB4）新型剪接变异的分子致病机制及临床特点。方法:回顾性总结首都医科大学附属北京儿童医院收治的1例胆汁淤积性肝病患儿的临床资料，采用全外显子组测序检测致病突变并进行Sanger测序验证，通过生物信息学预测突变位点的致病性，通过mRNA异常剪接的Minigene体外验证实验对可能致病突变进行体外功能验证，并随访患儿出院后的临床转归。结果:患儿　男，5岁，11月龄出现胆汁淤积，体格检查显示肝脾明显肿大，肝功能、腹部超声及肝脏病理等检查提示胆汁淤积性肝硬化。基因分析结果显示患儿为ABCB4基因致病性突变c.2860G>A和新发突变c.2065-8T>G的复合杂合子，突变分别来源于其父母，对c.2065-8T>G位点进行保守性预测，显示该区域高度保守并可能影响剪接。Minigene实验结果证实c.2065-8T>G突变导致内含子16滞留7 bp序列在成熟的mRNA中，在未发生无义介导的mRNA降解的情况下，氨基酸移码形成截短蛋白（p.Glu689ValfsTer19），最终确诊为进行性家族性肝内胆汁淤积症3型（PFIC3），予熊去氧胆酸（UDCA）等药物治疗，在18个月的随访期内，患儿的临床症状有所改善。结论:ABCB4基因c.2065-8T>G位点被证实影响剪接过程，与c.2860G>A构成复合杂合子，确定为PFIC3的致病原因，携带此突变的PFIC3患儿以胆汁淤积性肝病为主要表现，疾病进展相对缓慢，对UDCA治疗敏感。

目的:探讨1例具有严重智力障碍和明显行为异常的患儿的遗传学病因。方法:采集2020年12月2日就诊于武汉大学中南医院的1例具有智力障碍和行为异常患儿及其父母的外周血样，进行全外显子组测序，并通过Sanger测序对其家系成员进行共分离验证。采用短串联重复序列分析对患儿母亲携带的变异进行溯源，并通过minigene实验对剪接变异进行体外功能验证。结果:全外显子组测序发现患儿携带母源性 PAK3基因c.176-2A>G剪接变异。Sanger测序及短串联重复序列分析证实其母亲携带的变异为新发变异。Minigene实验结果证实其第2外显子存在异常剪接。根据美国医学遗传学与基因组学学会变异相关指南，该变异评级为致病性变异(PVS1+PS3+PM2_Supporting+PP3) 结论:PAK3基因c.176-2A>G变异可能是患儿的遗传学病因。上述发现丰富了 PAK3基因的变异谱，为患儿家庭的遗传咨询和产前诊断提供了依据。

目的:对2例中国汉族成骨不全症（osteogenesis imperfecta，OI）患者进行突变检测，对其候选剪接变异进行致病性鉴定。方法:采用常规酚-氯仿法从2例中国汉族OI先证者的外周血中提取基因组DNA，通过全外显子组测序（WES）进行致病突变筛查；针对检出的可能引起RNA剪接异常的疑似致病变异，构建Minigene分析变异对于剪接的影响，进而确定其致病性。结果:在先证者1中发现可能影响剪接的杂合变异：COL1A1：c.858+1_858+5delGTAAG；先证者2同时存在COL1A2的两个变异，一个为可能引起异常剪接的杂合变异c.1405-7C>T，另一个为杂合错义变异c.2972G>T（p.G991V）。Minigene实验分析证实家系1的变异导致COL1A1基因第12外显子发生跳跃，家系2变异位点c.1405-7C>T对COL1A2的转录后剪接没有影响。先证者2的COL1A2基因的G991为一个高度保守的氨基酸，经生物信息学分析c.2972G>T（p.G991V）可能为真正的OI致病变异。结论:先证者1的COL1A1剪接位点变异c.858+1_858+5delGTAAG是导致OI的致病性变异；排除先证者2中COL1A2变异c.1405-7C>T的致病性，确定COL1A2基因变异c.2972G>T（p.G991V）为先证者2的致病原因。针对WES提示的剪接变异进行Minigene分析，不仅实现了突变致病性鉴定，丰富了OI的突变谱，而且为患者产前诊断和后续机制研究奠定了基础。

目的:探讨一例Ⅲ型家族性噬血细胞综合征(familial hemophagocytic lymphohistiocytosis type Ⅲ，FHL-3)家系的致病变异及临床特点。方法:对1例确诊为FHL-3的患儿及其家系成员进行回顾性分析，通过家系全外显子及相邻内含子测序对先证者进行筛查，并对候选变异进行Sanger测序验证。以健康对照和患者的基因组DNA为模板，构建包含 UNC13D基因第23外显子、第23内含子和第24外显子的野生型和变异型minigene真核表达质粒。采用脂质体法用携带minigene的质粒转染HEK293T细胞，通过实时定量PCR检测minigene的剪接情况。 结果:家系分析和临床诊断提示先证者患有常染色体隐性遗传的FHL-3。测序发现其 UNC13D基因存在c.118-308(IVS1)C>T和c.2298+1(IVS23)G>A变异，经Sanger测序验证分别来自父亲和母亲，构成复合杂合变异，判断为致病性。Minigene实验证实 UNC13D基因c.2298+1(IVS23)G>A变异可导致第23外显子跳跃(-207nt)，产生截短蛋白。 结论:UNC13D基因c.118-308(IVS1)C>T和c.2298+1(IVS23)G>A可能是该FHL-3家系的致病变异，可导致 UNC13 D mRNA低表达和pre-mRNA的异常剪接。

目的:探讨常染色体显性遗传Alport综合征（autosomal dominant Alport syndrome，ADAS）致病基因 COL4A4杂合剪接突变的致病机制及基因型与表型的关联，以加深对 COL4A4剪接突变的认识以及对ADAS表型异质性的理解。 方法:本研究为病例系列分析。从3家医院收集5个ADAS家系先证者及家系成员的临床资料。对从先证者中经全外显子组测序（whole exome sequencing，WES）发现的 COL4A4杂合剪接变异，通过RNA体内剪接或Minigene体外实验分析其对mRNA正常剪接的影响。 结果:在此5个ADAS家系患者中经WES发现了4个 COL4A4杂合剪接变异位点。家系1、家系2、家系3和家系4中多数患者呈孤立性镜下血尿或合并微量蛋白尿，个别患者合并显性蛋白尿、进入老年期后出现肾功能轻度减退。家系5中4例患者均呈快速肾功能进展，于28～41岁进展至终末期肾病。家系1、家系2患者携带的c.735+3A>G和家系3患者携带的c.694-1G>C均可引起 COL4A4的第12号外显子跳跃导致42 bp核苷酸框内缺失（c.694_735del），家系4中发现的c.2056+3A>G可引起 COL4A4的第26号外显子跳跃导致69 bp核苷酸框内缺失（c.1988_2056del）。家系5中发现的c.2716+5G>T可引起包括第29号外显子3’端100 bp缺失、第30号外显子跳跃和第31号外显子5’端89 bp缺失的360 bp核苷酸大片段框内缺失（c.2446_2805del）。 结论:COL4A4杂合剪接突变导致不同大小核苷酸框内缺失与ADAS表型存在一定关联。通过体内或体外实验明确 COL4A4剪接突变影响mRNA剪接的具体方式可能有助于分析ADAS基因型对表型的影响。

目的:探讨1例罕见的 ABCC6基因变异所致婴儿泛发性动脉钙化(GACI)患儿的临床表现与遗传学病因。 方法:选取2022年8月26日就诊于首都医科大学附属北京儿童医院保定医院的1例44 d女性患儿作为研究对象。收集患儿的临床资料，通过核心家系全外显子组测序(Trio-WES)、全基因组拷贝数变异测序(CNV-seq)以及Minigene剪接实验对变异进行致病性分析。结果:患儿主要表现为发热、炎症指标高、抗感染治疗无效，超声显示全身大、中动脉广泛钙化、管壁增厚，考虑为GACI以及相关的动脉炎，经糖皮质激素、生物制剂治疗后发热缓解。Trio-WES发现患儿携带 ABCC6基因复合杂合变异c.4404-1G>A与c.4041＋5G>T，后者既往未见报道。根据美国医学遗传学与基因组学学会(ACMG)相关指南，两个变异被分别判定为可能致病性(PVS1＋PM2_Supporting)与临床意义不明(PM2_Supporting＋PM3＋PP3)。CNV-seq检测未见异常。Minigene剪接实验进一步验证两个变异均可影响剪接。 结论:对于不明原因及常规治疗无效的发热，需要及时完善基因检测，避免GACI的漏诊。

目的:探讨1例原发性肥大性骨关节(PHO)病患儿的遗传学病因。方法:选取2021年7月27日于武汉大学中南医院就诊的1例患儿为研究对象。采集患儿及其父母的外周血样，提取基因组DNA，进行全外显子组测序，对疑似的剪接变异进行Sanger测序家系验证，并通过minigene实验进行体外功能验证；采用长片段PCR对疑似的外显子缺失变异进行验证。本研究通过武汉大学中南医院医学伦理委员会的审查(伦理号：[2021]伦审字62号)。结果:WES结果显示患儿携带 HPGD基因复合杂合变异，包括父源性杂合缺失变异(Exon 3 del)和母源性杂合剪接变异(c.421＋1G>T)。长片段PCR验证了患儿及其父亲存在包含第3外显子在内的7 565 bp片段的杂合缺失(c.218-1304_324＋6156del)，minigene实验结果显示母源性的剪接变异导致了第4外显子的跳跃剪接。 结论:HPGD基因c.218-1304_324＋6156del杂合缺失变异和c.421＋1G>T杂合剪接变异可能是该患儿的致病原因，上述结果丰富了 HPGD基因的变异谱，为受累家庭的遗传咨询和产前诊断提供了依据。