目的:探讨4例Rotor综合征患儿 SLCO1B1/ SLCO1B3基因的变异特点，为临床诊疗和遗传咨询提供依据。 方法:以2019年1月至2022年1月湖南省儿童医院肝病科收治的4例患儿作为研究对象，对其进行家系全外显子组测序分析，并用凝胶电泳法对长散布元件-1(LINE-1)插入变异进行验证。结果:4例患儿均表现为皮肤及巩膜黄染。基因检测提示其 SLCO1B1基因存在3处变异，分别为c.1738C>T(p.R580*)、c.757C>T(p.R253*)以及c.1622A>C(p.Q541P)； SLCO1B3基因存在2处变异，分别为c.481＋22insLINE-1及c.1747＋1G>A。3例患儿携带 SLCO1B1/ SLCO1B3基因纯合变异，1例携带复合杂合变异。Sanger测序证实了上述变异的存在，凝胶电泳实验证实4例患儿均携带 SLCO1B3基因第6内含子约6 kb的LINE-1插入变异。 结论:4例Rotor综合征患儿均由 SLCO1B1/ SLCO1B3基因的变异所致。 SLCO1B3基因LINE-1插入变异可能是中国Rotor患者中常见的变异类型。

目的 考察醋柴胡水提液(VBRB)对大鼠肝细胞BRL3A以及人胚肾细胞HEK293内多种药物转运蛋白的影响以及对相应底物的摄取,进一步确定醋柴胡引经增效的作用靶点,为全面解析醋柴胡引经增效的作用机制提供数据支撑.方法 分别选用牛磺胆酸钠为Ntcp、Oatp2的共同底物,秋水仙碱、罗丹明B作为MRP1以及Pgp的底物,通过HPLC法或流式细胞术测定细胞内各底物含量;同时采用BCA法测定蛋白浓度,按蛋白质浓度归一化法计算摄取量;另分别采用Western blot法和RT-PCR法分析VBRB对细胞中的多种转运蛋白的蛋白表达以及mRNA水平的影响.结果 VBRB促进BRL3A细胞对牛磺胆酸钠摄取,并升高摄入型转运蛋白Ntcp和Oatp2的蛋白及mRNA水平.与MRP1抑制剂MK571类似,经谷胱甘肽刺激后的HEK293细胞,VBRB显著增加细胞对秋水仙碱摄取并降低MRP1蛋白表达;同时,VBRB显著促进Pgp过表达的HEK293细胞对罗丹明B摄取,并显著抑制Pgp蛋白表达和mRNA水平.结论 醋柴胡可增强细胞对多种底物的摄取,与其同时激活细胞内多种摄取型药物转运蛋白和抑制外排型药物转运蛋白活性有关.

目的:用体外巨噬细胞实验和全基因敲除小鼠,筛选11.-1β分泌相关的胞膜转运体.方法:分化THP-1细胞株得到人源性巨噬细胞,从人外周血获取巨噬细胞.获取同性别、同年龄的FVB野生型小鼠作为MRP1全基因敲除小鼠的对照,培养小鼠腹腔和骨髓巨噬细胞.使用ABCC1/MRP1、ABCG2/BCRP、ABCB1/P-gp、OATP1B1和MATE转运体抑制剂处理细胞,再使用脂多糖和腺苷三磷酸刺激细胞,采用ELISA、Western blot和细胞免疫荧光法检测IL-1β分泌水平.结果:人和小鼠巨噬细胞抑制剂实验表明,抑制ABCC1/MRP1转运体后,IL-1β分泌显著降低,而抑制其他4类转运体无效果.在动物实验中,MRP1全基因敲除小鼠的骨髓巨噬细胞分泌IL-1β的水平显著低于对照组.结论:ABCC1/MRP1转运体是一种新发现的IL-1β分泌途径,有望成为解决细胞因子释放综合征等临床问题的新靶标.

目的:探讨加味茵陈蒿汤治疗α-萘异硫氰酸酯(ANIT)诱导的胆汁淤积小鼠肝损伤的作用机制.方法:24只雄性SPF级C57BL/6小鼠随机分为正常对照组(Normal组)、ANIT造模组(ANIT组)、加味茵陈蒿汤组(JWYCH组)、熊去氧胆酸组(UDCA组),每组6只.Normal组与ANIT组灌胃给予饮用水,持续10d;JWYCH组灌胃给予加味茵陈蒿颗粒剂水溶液,UDCA组灌胃给予熊去氧胆酸悬液,持续10d.第7天,小鼠用ANIT油溶液(50 mg/kg)造模.末次给药后,采用全自动生化仪检测小鼠血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、总胆汁酸(TBA)及总胆红素(TBiL)水平;苏木素-伊红(HE)染色观察肝组织形态学变化;采用RT-qPCR检测肝组织法尼醇X受体(FXR)、成纤维细胞生长因子15(FGF15)、FGF受体4(FGFR4)mRNA表达;Western blot检测肝组织FGF15、FXR、磷酸化FXR(p-FXR)、FGFR4、外排型转运体[胆盐输出泵(BSEP)、多药耐药相关蛋白2(MRP2)]、摄取型转运体[钠离子-牛磺胆酸共转运蛋白(NTCP)、有机阴离子转运多肽2(OATP2)]蛋白表达.结果:血清肝功能生化学指标显示,与 Normal 组相比,ANIT 组 ALT、ALP、AST、TBA、TBiL 水平明显升高(P＜0.05);JWYCH 组和 UDCA 组 ALT、ALP、AST、TBA、TBiL水平明显低于ANIT组(P＜0.05);与UDCA组相比,JWYCH组的TBA水平明显下降(P＜0.05).肝组织病理结果显示,光镜下ANIT组可见胆管内胆栓形成,其汇管区以及胆管周国可见大量炎性细胞浸润,提示造模成功;JWYCH组、UDCA组病理损伤较ANIT组有明显改善.Western blot结果显示,与Normal组比较,ANIT组FGF15、FXR、p-PXR、FGFR4、BSEP、MRP2蛋白表达均明显减少(P＜0.05),提示造模成功;与 ANIT组比较,JWYCH组和 UDCA 组 FGF15、FXR、p-PXR、FGFR4、BSEP、MRP2 蛋白表达明显增加(P＜0.05,P＜0.01),而 NTCP、OATP2表达明显减少(P＜0.05).RT-qPCR结果显示,与Normal组比较,ANIT组小鼠肝组织FXR、FGF15、FGFR4的mRNA表达明显降低(P＜0.05);与ANIT组比较,UDCA组和JWYCH组FXR、FGF15、FGFR4的mRNA表达明显增加(P＜0.05);与UDCA组相比较,JWYCH组FGF15、FGFR4的mRNA表达明显增加(P＜0.05).结论:加味茵陈蒿汤能降低总胆汁酸水平,改善胆汁淤积和肝组织损伤.其作用机制可能是通过上调肝细胞FGF15、FGFR4表达,上调FXR和p-FXR水平,从而下调其下游摄取型转运体(NTCP、OATP2)水平以及上调外排型转运体(BSEP、MRP2)水平.

目的:探讨有机阴离子转运多肽1B3(OATP1B3)在肝细胞癌(肝癌)组织中的表达及作用.方法:通过免疫组化实验和免疫印迹试验(Westernblot)检测肝癌组织及其癌旁组织中OATP1B3情况,并分析其与患者临床病理特征的相关性.采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测OATP1B3在多株肝癌细胞中的表达情况,选择表达量相对较低的人肝癌细胞(HepG2和Huh7)细胞进行过表达实验,细胞毒实验(MTT)和流式细胞术分别检测OATP1B3对细胞增殖及凋亡的影响.结果:肝癌组织中OATP1B3表达水平明显低于癌旁组织(P＜0.05),且与患者恶性肿瘤国际临床病期分类(TNM分期)、肿瘤分化程度、有无肿瘤复发显著相关(P＜0.05).过表达OATP1B3可抑制HepG2和Huh7细胞增殖,促进细胞凋亡.结论:OATP1B3在肝癌组织中低表达,上调其表达可抑制肝癌细胞增殖和促进细胞凋亡.OATP1B3可能是肝癌的抑癌基因,对肝癌的发生、发展具有重要作用.

Fexofenadine is useful in various allergic disease treatment.However,the pharmacokinetic variability information and quantitative factor identification of fexofenadine are very lacking.This study aimed to verify the validity of previously proposed genetic factors through fexofenadine population pharmaco-kinetic modeling and to explore the quantitative correlations affecting the pharmacokinetic variability.Polymorphisms of the organic-anion-transporting-polypeptide(OATP)1B1 and 2B1 have been proposed to be closely related to fexofenadine pharmacokinetic diversity.Therefore,modeling was performed using fexofenadine oral exposure data according to the OATP1B1-and 2B1-polymorphisms.OATP1B1 and 2B1 were identified as effective covariates of clearance(CL/F)and distribution volume(V/F)-CL/F,respectively,in fexofenadine pharmacokinetic variability.CL/F and average steady-state plasma con-centration of fexofenadine differed by up to 2.17-and 2.20-folds,respectively,depending on the OATP1B1 polymorphism.Among the individuals with different OATP2B1 polymorphisms,the CL/F and V/F differed by up to 1.73-and 2.00-folds,respectively.Ratio of the areas under the curves following single-and multiple-administrations,and the cumulative ratio were significantly different between OATP1B1-and 2B1-polymorphism groups.Based on quantitative prediction comparison through a model-based approach,OATP1B1 was confirmed to be relatively more important than 2B1 regarding the degree of effect on fexofenadine pharmacokinetic variability.Based on the established pharmacokinetic-pharmacodynamic relationship,the difference in fexofenadine efficacy according to genetic poly-morphisms of OATP1B1 and 2B1 was 1.25-and 0.87-times,respectively,and genetic consideration of OATP1B1 was expected to be important in the pharmacodynamics area as well.This population phar-macometrics study will be a very useful starting point for fexofenadine precision medicine.

藏药佐太(主要含β-HgS)和中药朱砂(96％ HgS)是传统医药中的配伍成分,其含重金属(汞)的安全问题和中西药合用时的相互作用问题日益受到关注.本实验就其对药物代谢基因的影响进行了研究.小鼠连续7d口服给予不同剂量佐太、HgS(10,30,100,300mg· kg-1),或氯化汞(HgCl2,33.6mg·kg-1),RT-PCR检测药物代谢酶和转运体蛋白相关基因表达.佐太和HgS对Ⅰ相(CYP1A2,CYP2B10,CYP3A11,CYP4A10)和Ⅱ相(UGT1A1,UGT2A3,SULT1A1,SULT2A1)药物代谢酶以及转运体蛋白(OATP1A1,OATP1A4,OATP1B2,OATP2B1,MRP1,MRP2,MRP3,MRP4)均无明显影响,而HgCl2显著上调CYP2B10,CYP4A10,UGT1A1,UGT2A3,SULT1A1,SULT2A1,OATP1A4,MRP1,MRP3,MRP4,对OATP1A1有抑制作用.综上,佐太和HgS在300 mg· kg-1的剂量下对肝脏代谢基因的表达没有产生明显的影响,而1/10等汞量的HgCl2则明显上调或改变Ⅰ相、Ⅱ相药物代谢基因和转运体基因的表达.

肝脏胆汁的形成过程依赖胆汁合成、微管分泌和肠肝循环时胆汁酸的重吸收.胆汁酸是胆固醇的代谢产物之一,通过肠道和肝细胞表达的多种转运体进行肠肝循环,胆汁酸在肝脏合成,通过胆管分泌入肠腔,在回肠重吸收入血,通过门静脉系统重新被肝脏摄取,仅少量胆汁酸进入体循环.在这一过程中,肝脏摄取吸收是调节循环血液中胆汁酸水平的关键环节,肝细胞从肝窦血液中摄取胆汁酸的过程有多种转运体的共同参与,这些转运体分为钠依赖性和非钠依赖性,钠依赖性的转运体主要是Na+-牛磺胆酸盐共转运多肽(NTCP),非钠依赖性的转运体则主要为有机阴离子转运多肽家族(OATP/SLCO)成员,如人OATP1B1和OATP1B3及小鼠Oatp1b2.这些载体的存在已知多年,NTCP(可溶性载体10A1,SLC10A1)是一种在肝细胞肝窦基底部高度表达的膜转运体,是肝脏从钠依赖性门静脉血液中胆盐转运到胆汁中的主要膜转运体.OA T P1B1和OATP1B3是OATPs家族中有肝脏特异性的成员,参与肝脏摄取吸收多种内源性和外源性物质过程.

目的 探讨邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯[di-(2-ethylhexyl)phthalate,DEHP]对胎盘转运甲状腺素(thyroid hormones,THs)影响胎鼠神经发育的作用.方法 在胎鼠神经管闭合(孕第9.5天,E9.5 d)至开始合成THs(E15.5 d)期间,用DEHP(0、10、50、200 mg/kg)对受孕小鼠经口灌胃染毒(每组10只),每天1次.E14d皮下注射BrdU 50 mg/kg.E15.5d麻醉下每组剖杀7只孕鼠,直接化学发光法检测孕鼠血清、羊水THs[游离三碘甲状腺原氨酸(free triiodothyronine,FT3)、游离甲状腺素(free thyroxine,FT4)、三碘甲状腺原氨酸(triiodothyronine,T3)、甲状腺素(thyuroxine,T4)]水平.蛋白免疫印迹法检测雄性胎鼠胎盘单羧酸转运体8 (monocarboxylate transporter 8,MCT8)、有机阴离子转运多肽1C1(organicanion transporting polypeptide 1C1,OATP1C1)、Ⅱ型和Ⅲ型脱碘酶(deiodinase Ⅱ & Ⅲ,DIO2,DIO3).于E18d麻醉下剖杀每组剩余3只孕鼠,取雄性胎鼠脑,BrdU免疫组化检测胎脑皮层神经细胞增殖与迁移情况.结果 各处理组孕鼠进食饮水、体重及一般活动情况未见异常,各组胎鼠体重、脑重、脑体比等也无差异.各组孕鼠血清T3、T4、FF3、FT4和羊水FT4的差异均无统计学意义(P＞0.05).与对照组比较,DEHP 50、200 mg/kg组羊水FT3水平明显下降,差异有统计学意义(P＜0.05).与对照组比较,DEHP 50、200 mg/kg组雄性胎鼠胎盘MCT8、DIO2蛋白水平下降,200 mg/kg组OATP1C1蛋白水平下降,差异有统计学意义(P＜0.05),各组间DIO3蛋白水平差异均无统计学意义(P＞0.05).与对照组比较,DEHP 200 mg/kg组雄性胎鼠大脑皮层单位面积BrdU阳性细胞数减少,56.5％分布于VZ-SVZ层,而50 mg/kg组IZ层的BrdU阳性细胞比例升高,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 孕中期染毒DEHP 50、200 mg/kg可影响发育中大脑神经细胞增殖和迁移,可能与其干扰THs经胎盘转运有关.

目的 在piggyBac(PB)转座子介导下,探索在HepG2细胞中实现多个药物代谢酶稳定共表达的策略,为建立体外药物代谢和肝毒性研究的理想细胞模型奠定基础.方法 首先选择3种目前针对大片段DNA使用较广的转染方法:Lipofectamine?LTX,GenJetTM(Ver.Ⅱ)和Neon?Transfection System,分别转染N端标记增强型绿色荧光蛋白质粒(pEGFP-N2)和2A串联重组细胞色素3A4(CYP3A4)和CYP2C19的PB转座子质粒(pPB-CYP3A4-2A-2C19)至HepG2细胞,48 h后比较不同方法的转染效率和细胞毒性,确立高效低毒的HepG2细胞转染方法.然后选择该法进行转染,将设计的3组PB重组转座子:单基因转座子(PB-CYP3A4)、2A串联多基因转座子(PB-CYP3A4-2A-2C19)、多个单基因转座子混合物〔PB-CYP3A4, PB-CYP2C8,PB-CYP2A6,有机阴离子转运多肽1B1的PB转座子(PB-OATP1B1)〕分别转染HepG2细胞,利用嘌呤霉素和GFP进行单克隆细胞筛选:挑选具有抗性且表达GFP的细胞单克隆并进行扩大培养,采用实时荧光定量PCR、Western蛋白质印迹和高效液相色谱-串联质谱联用法分别检测各组药物代谢酶mRNA、蛋白质水平及酶活性,并进行统计分析.结果 3种转染方法比较发现,GenJetTM法的转染效率显著高于其他2种(P<0.01),介导Pegfp-N2和Ppb-CYP3A4-2A-2C19的转染效率分别高达(94.2±2.5)%和(89.3±3.3)%,且该法具有较低的细胞毒性.因此选择GenJetTM法进行后续PB转座子转染.分别转染3组PB重组转座子发现,单个转座子PB-CYP3A4和PB-CYP3A4-2A-2C19转染后,筛选获得的抗性细胞克隆中各个药物代谢酶在Mrna、蛋白质及活性水平均显著提高,其中2A可实现CYP3A4和CYP2C19药物代谢酶协同稳定表达;而多个转座子混合共转染细胞中,仅有随机几个基因表达;且各药物代谢酶基因的表达不均衡,仅CYP3A4药物代谢酶基因在单克隆细胞中表达水平明显升高.结论 GenJetTM法可成为PB重组转座子转染HepG2细胞的有效方法.PB转座子可介导基因稳定表达;但在实现多基因共表达时,与病毒载体法不同,理论上可行的PB多转座子共转染方法其基因表达效率下降,且各基因表达不均衡.相比之下,应用2A串联多个基因串联重组PB单转座子可实现各基因稳定表达.