目的:探讨成纤维细胞生长因子10(FGF10)对神经元损伤的保护作用及其潜在的分子机制。方法:剥离新生SD乳鼠的脑组织并提取其中的皮层神经元，将其种植于含L-多聚赖氨酸的孔板上进行培养，并分为正常组、髓鞘碎片组和髓鞘碎片+FGF10组，其中髓鞘碎片组神经元在培养4 h后添加一定含量的髓鞘碎片溶液(终浓度为10 μg/mL)，而髓鞘碎片+FGF10组神经元同时在培养基内添加髓鞘碎片和FGF10溶液(终浓度为4.3 nmol/L)。培养1周后，应用TUNEL染色、流式细胞术检测各组神经元的凋亡情况，应用活/死细胞染色、CCK-8法检测各组神经元的生存情况，应用Western blotting、免疫荧光双标染色检测各组神经元内凋亡相关蛋白、微管相关蛋白和RAS同源基因家族成员A(Rho A)/Rho A相关蛋白激酶(ROCK)信号通路相关蛋白的表达。结果:与正常组相比，髓鞘碎片组中TUNEL染色所示神经元凋亡率明显升高，流式细胞术所示早期神经元凋亡率明显升高，活化半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)蛋白表达明显升高，Bcl-2/Bax值明显降低，活/死细胞染色所示神经元死亡率明显升高，CCK-8法所示神经元生存率明显降低，乙酰化微管蛋白/酪氨酸微管蛋白(Ace/Tyr-tubulin)值明显降低，Tau蛋白表达明显降低，Ace/Tyr-tubulin荧光强度比值明显降低，Rho A、ROCK蛋白表达明显升高，Rho A荧光强度值明显升高，差异均有统计学意义( P<0.05)。与髓鞘碎片组相比，髓鞘碎片+FGF10组中TUNEL染色所示神经元凋亡率明显降低，流式细胞术所示早期神经元凋亡率明显降低，活化caspase-3蛋白表达明显降低，Bcl-2/Bax值明显升高，活/死细胞染色所示神经元死亡率明显降低，CCK-8法所示神经元生存率明显升高，Ace/Tyr-tubulin值明显升高，Tau蛋白表达明显升高，Ace/Tyr-tubulin荧光强度比值明显升高，Rho A、ROCK蛋白表达明显降低，Rho A荧光强度值明显降低，差异均有统计学意义( P<0.05)。 结论:FGF10可能通过抑制Rho A/ROCK信号通路进而促进神经元内微管稳定，从而对抗神经元在髓鞘碎片环境下发生的凋亡并提高其生存率。

目的:探讨白细胞介素-33（IL-33）对脂多糖（LPS）诱导的大鼠心脏微血管内皮细胞（RCMECs）通透性的影响。方法:体外培养RCMECs，分为空白对照组、LPS组、IL-33组和LPS+IL-33组。用细胞计数试剂（CCK8）检测IL-33对RCMECs增殖的影响。异硫氰酸荧光素（FITC）-葡聚糖法检测4组单层RCMECs通透性。Western Blot检测4组RCMECs中血管内皮钙黏蛋白、Ras同源基因家族（Rho）成员A（RhoA）、磷酸化Rho相关含卷曲螺旋蛋白激酶（p-ROCK2）蛋白表达。高通量测序比较LPS组和LPS+IL-33组的差异基因表达，并对差异基因进行基因本体（GO）富集分析。结果:10~50 ng/ml的IL-33对RCMECs增殖无显著影响（ P>0.05）。与空白对照组比，LPS组RCMECs通透性增加（相对灰度值1.404±0.029 比 1.000±0.200， P<0.05），血管内皮钙黏蛋白表达显著下调（相对灰度值0.429 5±0.012 9 比 0.594 9±0.014 2， P<0.05）；而与LPS组比，LPS+IL-33组可降低RCMECs通透性（相对灰度值0.948±0.013， P<0.01），上调血管内皮钙黏蛋白表达（相对灰度值0.549 1±0.012 0， P<0.005）。与空白对照组比，LPS组RhoA（相对灰度值0.211 4±0.009 9 比 0.135 0±0.007 6， P<0.000 1）、p-ROCK（相对灰度值0.656 3±0.013 2 比 0.503 6±0.036 2， P<0.000 1，）蛋白表达上调；与LPS组比，LPS+IL-33组RhoA（相对灰度值 0.157 7±0.010 7， P=0.000 2）、p-ROCK（相对灰度值0.427 7±0.003 8， P<0.000 1）蛋白表达降低。高通量测序发现，LPS组、LPS+IL-33组下调的差异基因与细胞骨架及Rho信号通路相关。 结论:IL-33可能通过抑制Rho/Rho相关含卷曲螺旋蛋白激酶信号通路RhoA、p-ROCK蛋白表达，改善LPS诱导的心脏微血管内皮细胞的高通透性。

目的 探讨贝母素乙调节Ras同源基因家族成员A(RhoA)/Rho相关的卷曲螺旋激酶(ROCK)信号通路对膝骨关节炎(knee osteoarthritis,KOA)大鼠软骨损伤的影响.方法 以碘乙酸钠(MIA)法制备KOA大鼠模型,随机分为模型组、贝母素乙(3.5 mg/kg)组、贝母素乙(3.5 mg/kg)+LPA(RhoA激活剂,1 mg/kg)组,每组 10 只,另选 10 只大鼠为对照组.机械刺激法和热辐射法检测大鼠膝关节疼痛症状;检测大鼠关节肿胀度、膝关节宽度并以步态评分评测其关节功能;透射电镜检测大鼠膝关节软骨细胞超微结构;TUNEL染色检测大鼠关节软骨细胞凋亡比;酶联免疫吸附(ELISA)法检测大鼠血清和关节液促炎因子白细胞介素(IL)-18、单核细胞趋化蛋白 1(MCP-1)水平;免疫印迹检测各组大鼠关节软骨组织凋亡(Cleaved caspase-3、Bax)和RhoA/ROCK通路相关蛋白表达.结果 贝母素乙可降低KOA大鼠关节肿胀度、膝关节宽度、步态评分、软骨细胞凋亡比、血清及关节液IL-18、MCP-1水平、软骨组织Cleaved caspase-3、Bax、RhoA、ROCK1、ROCK1 蛋白表达,升高机械痛阈值、热痛阈值(P<0.05);LPA可减弱贝母素乙对KOA大鼠关节软骨损伤的改善作用.结论 贝母素乙可通过抑制RhoA/ROCK信号激活而抑制KOA大鼠关节炎症反应和关节软骨细胞凋亡,减轻软骨损伤.

目的 观察加减薯蓣丸对血管性痴呆(vascular dementia,VD)伴抑郁小鼠的疗效并探究其作用机制.方法 采用双侧颈总动脉狭窄法结合慢性不可预测温和刺激复制VD伴抑郁小鼠模型,将小鼠分为假手术组、模型组、加减薯蓣丸组以及氟西汀组.采用行为学实验检测小鼠抑郁行为,免疫荧光法检测小鼠胼胝体血小板衍生生长因子受体α(platelet-derived growth factor receptor alpha,PDGFRα)、髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein,MBP)表达水平,Western blot法检测MBP、少突胶质细胞糖蛋白(myelin oligodendrocyte glycoprotein,MOG)、髓鞘相关糖蛋白(myelin associated glycoprotein,MAG)、酪氨酸蛋白激酶EPH受体A4(Ephrin receptor A4,EphA4)、Ras同源基因家族成员-A(Ras homolog gene family,member A,RhoA)、轴突生长抑制因子-A(neurite outgrowth inhibitor-A,Nogo-A)、Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶(Rho associated coiled-coil forming protein kinase,Rock)、Nogo受体(Nogo receptor,NgR)的蛋白表达水平,劳克坚牢蓝(Luxol fast bue,LFB)染色法观察胼胝体髓鞘结构,超微透射电子显微镜观察髓鞘超微结构.结果 行为学检测结果显示,加减薯蓣丸组及氟西汀组小鼠在旷场实验中活动总路程显著增加(P<0.05),糖水偏好率显著升高(P<0.05),强迫游泳实验中不动时间明显增加(P<0.05);免疫荧光染色结果显示,加减薯蓣丸、氟西汀均可增加PDGFRα、MBP荧光强度;LFB染色结果显示,与假手术组比较,模型组小鼠LFB髓鞘染色缺失,存在脱髓鞘改变,加减薯蓣丸能改善VD抑郁小鼠髓鞘着色程度;Western blot法检测结果显示,与假手术组比较,模型组小鼠胼胝体中MBP、MOG、MAG表达水平显著下降(P<0.05),加减薯蓣丸组小鼠MBP、MOG、MAG表达水平显著升高(P<0.05);加减薯蓣丸组小鼠胼胝体中EphA4、RhoA、Rock、No-go-A、NgR蛋白表达水平显著降低(P<0.05).结论 加减薯蓣丸可能通过抑制EphA4/RhoA/Rock通路促进髓鞘再生,改善VD小鼠的抑郁状态.

目的:探讨督脉电针和高压氧对脊髓损伤大鼠脊髓神经元的作用机制.方法:选择Wistar大鼠共60只,按随机数字表法分为5组,即正常对照组、模型组、督脉电针组、高压氧组、高压氧联合督脉电针组,每组12只.正常对照组只行椎板切除,不造成脊髓损伤;其余组用脊髓横断的方法损伤大鼠胸髓背侧部位,以构建实验模型.高压氧组于造模清醒4 h后,置于高压氧舱内氧疗,持续75 min/次,治疗4次/d.督脉电针组分别于造模清醒4 h后给予干预,频率2 Hz;干预时长为20 min,频率为1次/d.高压氧联合督脉电针组使用上述两种方法相结合,对大鼠进行干预.正常对照组和模型组不予治疗.造模后的第1、3、7天分别对各组进行Basso Beattie Bresnahan(BBB)运动功能评估,记录各组大鼠行为学改变.造模后第7天处死各组大鼠,取大鼠脊髓组织,应用TUNEL法检测凋亡细胞并计算凋亡指数;免疫荧光检测Ras同源基因家族成员A(RhoA)、Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶(ROCK)通路变化;同时采用经典的RT-PCR和Western印迹测定大鼠脊髓损伤区轴突生长抑制因子A(Nogo-A)、Nogo-66受体(NgR)mRNA和蛋白的含量.结果:造模后第1、3和7天,督脉电针组、高压氧组和高压氧联合督脉电针组BBB评分均高于模型组(均P＜0.05),且高压氧联合督脉电针组评分高于督脉电针组与高压氧组(P＜0.05).TUNEL染色下模型组脊髓灰质区神经元染色明显阳性,提示细胞凋亡较多,高压氧联合督脉电针组损伤部位细胞凋亡显著减少(P＜0.05);督脉电针组、高压氧组和联合治疗组RhoA、ROCK蛋白含量、Nogo-A mRNA和蛋白表达量、NgR mRNA和蛋白表达量均低于模型组(F=34.597、39.230、14.783、12.370、21.435、50.435,均P＜0.05),且联合组的Nogo-A mRNA和蛋白表达量、NgR mRNA和蛋白表达量均低于督脉电针组和高压氧组(F=13.58、11.253、24.843、41.221,均P＜0.05).结论:督脉电针和高压氧对脊髓损伤大鼠脊髓神经元具有保护作用,其机制可能与RhoA/ROCK通路有关.

目的 基于Ras同源基因家族成员A(RhoA)/Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶(ROCK)信号通路探讨茯苓酸(PA)对慢性肾衰竭(CRF)大鼠肾功能、纤维化的影响及潜在机制.方法 以雄性SD大鼠为对象,以5/6肾切除术建立CRF大鼠模型,将造模成功的大鼠分为模型组,PA低、中、高剂量组(5、10、20 mg/kg PA)和PA高剂量+ROCK通路激活剂溶血磷脂酸(LPA)组(20 mg/kg PA+1 mg/kg LPA),每组15只;另取15只大鼠仅切口暴露肾脏但不切除,作为假手术组.各药物组大鼠灌胃和/或尾静脉注射相应药液,每天1次,连续12周.实验期间,观察各组大鼠一般情况;末次给药后,检测各组大鼠的血清肾功能指标(血尿素氮、血清肌酐、尿酸)水平,观察其肾组织病理学改变,并进行肾小管损伤评分和肾纤维化区域面积量化,检测其肾组织中氧化应激指标[丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)]、炎症因子(肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、白细胞介素6)水平,结缔组织生长因子(CTGF)、Ⅰ型胶原(collagen Ⅰ)阳性表达率,以及通路相关蛋白(RhoA、ROCK1)、纤维化相关蛋白(转化生长因子β1、裸角质层同源物2、α-平滑肌肌动蛋白)表达水平.结果 与假手术组比较,模型组大鼠饮食减少,体型瘦小,精神萎靡且反应迟钝,肾小球减少、萎缩,肾小管扩张且结构杂乱,间质可见大量炎症细胞浸润;其血清肾功能指标水平,肾小管损伤评分、肾纤维化面积占比、肾组织MDA和炎症因子水平、CTGF和collagen Ⅰ阳性表达率、通路相关蛋白和纤维化相关蛋白的表达水平均显著升高,SOD水平显著降低(P＜0.05).与模型组比较,PA各剂量组大鼠的一般情况和肾组织病理损伤均有不同程度好转,上述各定量指标均显著改善,且呈剂量依赖性(P＜0.05).LPA可显著逆转PA对上述指标的改善作用(P＜0.05).结论 PA能改善CRF大鼠肾功能并减轻肾组织纤维化,上述作用可能与抑制RhoA/ROCK信号通路的激活有关.

目的 研究黄芩苷治疗大鼠膝骨关节炎的作用机制.方法 将60只大鼠随机分为空白对照组、假手术组、模型组(用弗氏完全佐剂构建模型)、低剂量实验组(20 mg·kg-1黄芩苷)、高剂量实验组(40 mg·kg-1黄芩苷)和阳性对照组(5 mg·kg-1 Rho激酶抑制药Y-27632),每组10只,连续治疗4周.检测大鼠关节肿胀度,并评估Lequesne MG评分;收集关节液和软骨组织,用苏木精-伊红染色法观察大鼠软骨组织病理变化,用酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测关节液中白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-β(TNF-β)表达水平,用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)实验检测软骨组织中Ras同源基因家族成员A(RhoA)、Rho相关蛋白激酶1(ROCK1)、Rho相关蛋白激酶2(ROCK2)mRNA表达水平,用蛋白质印迹法检测软骨组织中RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表达水平.结果 空白对照组、假手术组、模型组、低剂量实验组、高剂量实验组和阳性对照组大鼠治疗4周后膝关节直径分别为(9.88±0.34)、(9.96±0.31)、(13.54±0.70)、(13.35±0.54)、(11.89±0.37)和(11.67±0.41)mm,IL-6 水平分别为(19.82±1.78)、(20.69±1.84)、(83.26±4.45)、(83.62±4.71)、(42.30±2.98)和(38.44±2.53)pg·mL-1,TNF-β 水平分别为(8.86±1.41)、(9.45±1.37)、(33.71±2.63)、(34.14±2.83)、(23.71±1.93)和(20.85±1.69)pg·mL-1,RhoA mRNA 表达水平分别为 1.00±0.13、1.04±0.11、1.69±0.26、1.64±0.20、1.24±0.18 和 1.14±0.17,ROCK1 mRNA表达水平分别为 1.00±0.15、1.02±0.12、1.48±0.19、1.53±0.21、1.21±0.17和 1.16±0.18,ROCK2 mRNA 表达水平分别为 1.00±0.14、1.06±0.11、1.41±0.20、1.43±0.18、1.18±0.17 和 1.15±0.16.模型组与假手术组比较,高剂量实验组与模型组或低剂量实验组比较,阳性对照组与模型组或低剂量实验组比较,上述指标在统计学上差异均有统计学意义(均P＜0.05).结论 黄芩苷可能通过抑制RhoA/ROCK信号通路减轻膝骨关节炎大鼠炎性反应.

目的:探讨苍术素(ATR)调节Ras同源基因家族成员A(RhoA)/Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶(ROCK)信号通路对弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)细胞恶性生物学行为的影响.方法:常规培养DLBCL细胞SUDHL-4,将其随机分为对照组、低浓度ATR组(ATR-L组,5 μmol/L ATR)、中浓度ATR组(ATR-M组,10 μmol/L ATR)、高浓度 ATR 组(ATR-H 组,20 μmol/L ATR)和高浓度 ATR+RhoA 激活剂 U46619 组(ATR+U46619组,20 μmol/L ATR+10 nmol/L U46619).CCK-8法测定细胞增殖活性.划痕实验检测细胞迁移能力.Transwell实验测定细胞侵袭能力.流式细胞术检测细胞凋亡率.实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法测定细胞中RhoA、ROCK1 mRNA表达.免疫印迹法(Western blot)测定各组细胞B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、RhoA、ROCK1蛋白表达.结果:与对照组比较,ATR-M组、ATR-H组SUDHL-4细胞OD45.值(48、72 h)、细胞迁移率、细胞侵袭数目、RhoA、ROCK1 mRNA和蛋白表达、Bcl-2蛋白表达降低,细胞凋亡率、Bax蛋白表达升高(均P＜0.05).RhoA激活剂U46619减弱了 ATR对DLBCL细胞恶性生物学行为的抑制作用.结论:ATR可能通过下调RhoA/ROCK信号通路抑制DLBCL细胞恶性生物学行为.

目的 探讨苦参碱(Matrine)对冠心病(coronary heart disease,CHD)大鼠辅助T细胞 17(helper T cell 17,Th17)/调节性T细胞(regulatory T cells,Treg)细胞平衡及Ras同源基因家族成员A(RhoA)-Rho相关的卷曲螺旋激酶(ROCK)信号通路的影响.方法 建立冠心病模型,将实验大鼠分为对照组、模型组、苦参碱低剂量(50 mg·kg-1)组、苦参碱高剂量(200 mg·kg-1)组及苦参碱高剂量(200 mg·kg-1)+LPA组(10 mg·kg-1).超声心动图进行大鼠心功能检测;酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)法进行白细胞介素 17(IL-17)、转化生长因子β(TGF-β)水平检测;流式细胞术检测Th17、Treg数量及Th17/Treg比值;免疫组化进行内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、内皮素 1(ET-1)蛋白表达水平检测;Masson染色进行大鼠心肌组织的病理形态变化观察;TTC染色检测各组大鼠心肌梗死情况;TUNEL染色进行心肌组织中细胞凋亡情况检测;试剂盒检测RhoA活性;Western Blot法进行半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 3(Caspase-3)、B细胞淋巴瘤因子 2(Bcl-2)、Bcl-2 相关X蛋白(Bax)、RhoA、ROCK1、ROCK2 蛋白表达水平检测.结果 与对照组比较,模型组心肌组织有大量蓝色胶原纤维沉积,左室舒张末期容积(left ventricular end-diastolic volume,LVEDV)、左室收缩末期容积(left ventricular end-systolic volume,LVESV)、IL-17、Th17、Th17/Treg、ET-1、心肌梗死面积、细胞凋亡率、TUNEL阳性率、Bax、Caspase-3、RhoA活性、RhoA、ROCK1、ROCK2 表达水平明显升高,左室射血分数(left ventricular ejection fraction,LVEF)、左室缩短分数(left ventricular shortening fraction,LVFS)、TGF-β、Treg、eNOS、Bcl-2 表达水平明显降低(P＜0.05).与模型组比较,Matrine-L组、苦参碱高剂量组心肌组织蓝色胶原纤维逐渐减少,LVEDV、LVESV、IL-17、Th17、Th17/Treg、ET-1、心肌梗死面积、细胞凋亡率、TUNEL 阳性率、Bax、Caspase-3、RhoA 活性、RhoA、ROCK1、ROCK2 表达水平依次明显降低,LVEF、LVFS、TGF-β、Treg、eNOS、Bcl-2 表达水平依次明显升高(P＜0.05).与苦参碱高剂量组比较,苦参碱高剂量+LPA组心肌组织蓝色胶原纤维增多,LVEDV、LVESV、IL-17、Th17、Th17/Treg、ET-1、心肌梗死面积、细胞凋亡率、TUNEL 阳性率、Bax、Caspase-3、RhoA 活性、RhoA、ROCK1、ROCK2 表达水平明显升高,LVEF、LVFS、TGF-β、Treg、eNOS、Bcl-2 表达水平明显降低(P＜0.05).结论 苦参碱通过抑制 RhoA-ROCK信号通路调节Th17/Treg细胞平衡,改善冠心病大鼠心肌损伤.

以Ras 同源基因家族成员C(Ras homolog gene family member C,RhoC)为靶点探讨栓菌酸(trametenolic acid,TA)对人肝癌HepG2.2.15 细胞迁移侵袭的影响及机制,为栓菌酸的利用提供依据.采用MTT法检测TA对HepG2.2.15 细胞增殖的影响;划痕实验、Transwell实验检测TA对细胞迁移、侵袭的影响;pull down实验检测TA对Ras相似物GTP 酶(Ras homo-logue GTPases,Rho GTPases)活性的影响;Western blot实验检测TA对RhoC从胞质到胞膜转运及对RhoC/Rho相关激酶 1(Rho-associated kinase 1,ROCK1)/肌球蛋白轻链(myosin light chain,MLC)/基质金属蛋白酶 2(matrix metalloprotease 2,MMP2)/基质金属蛋白酶 9(matrix metalloprotease 9,MMP9)通路相关蛋白表达的影响;采用瞬时质粒转染过表达pcDNA3.1-RhoC,激光共聚焦检测细胞骨架中F-actin的变化,并检测细胞迁移侵袭及RhoC/ROCK1/MLC/MMP2/MMP9 通路相关蛋白表达的变化,以及RhoC GTP酶活性;建立BALB/c 裸鼠皮下移植瘤模型,以索拉菲尼为阳性对照(Sora 20 mg·kg-1),测量TA低、中、高剂量组(40、80、120 mg·kg-1)瘤体积和质量,瘤组织通过Western blot检测相关蛋白的表达.结果显示,TA呈浓度依赖性抑制HepG2.2.15 细胞增殖,24、48 h的IC50 分别为 66.65、23.09 μmol·L-1.裸鼠肿瘤质量、肿瘤体积均显著降低,索拉菲尼,TA低、中、高剂量组的抑瘤率分别为 62.23%、26.48%、55.45%、62.36%.TA能显著降低HepG2.2.15 细胞迁移侵袭数,且呈浓度依赖性抑制RhoC蛋白的表达及RhoC GTP酶活性,使膜组分RhoC显著下调,减少膜结合RhoC GTP 酶的量.体内外实验证实,TA可显著抑制RhoC下游ROCK1、MLC、p-MLC、MMP2、MMP9 蛋白表达.HepG2.2.15 细胞转染pcDNA3.1-RhoC过表达RhoC后,TA能有效抑制过表达后RhoC、ROCK1、MLC、p-MLC、MMP2、MMP9 蛋白的表达水平,及RhoC GTP酶的活性,与过表达前相对抑制水平相似.综上所述,TA可抑制人肝癌HepG2.2.15 细胞迁移侵袭,其机制可能是通过靶向抑制RhoC GTP酶的活性,下调RhoC表达,从而抑制RhoC/ROCK1/MLC/MMP2/MMP9 信号通路.该研究为利用中药有效成分多靶点优势,开发以热休克蛋白 90α(heat shock protein 90α,HSP90α)为靶点的自噬调节剂,达到阻滞肝癌细胞增殖,同时抑制肝癌细胞的侵袭和转移双重作用提供了新思路和方法.