目的:探讨Ras超家族亚群A(RhoA)/Rho关联含卷曲螺旋结合蛋白激酶1(Rock-1)在无机磷酸盐中诱导大鼠瓣膜间质细胞(VICs)成骨分化的作用机制。方法:取8只雄性大鼠(购自上海西普尔必凯动物实验有限公司)的主动脉瓣膜消化培养至第3代后免疫荧光鉴定。小干扰RNA(siRNA)-RhoA转染VICs后用无机磷酸盐成骨培养基(IP-OIM)分别诱导转染组(RNAi)，阴性对照组(NC)及空白对照组(CON)的成骨分化，并通过蛋白质印迹法(Western blot)与聚合酶链反应(PCR)评估转染后RhoA、Rock-1、Runt相关转录因子2(Runx-2)及骨钙素(OST)的变化；7 d行碱性磷酸酶(ALP)活性相关检测，14 d行钙含量相关检测评估其早期与晚期成骨分化趋势。用IP-OIM刺激转染后的VICs 60 min，并通过Western blot检测SMAD1/5/9的磷酸化变化。采用单因素方差分析。结果:鉴定后的VICs转染siRNA-RhoA并用IP-OIM培养，经过Western blot及PCR检测后可知RNAi的RhoA(Western blot：0.330±0.020；PCR：0.357±0.060)及Rock-1(Western blot：0.366±0.020；PCR：0.383±0.040)比CON均出现表达下调(RhoA Western blot： t＝36.680， P<0.05 PCR： t＝10.610， P<0.05；Rock-1 Western blot： t＝31.240， P<0.05 PCR： t＝13.210， P<0.05)，差异有统计学意义，RNAi的OST(Western blot：0.520±0.030；PCR：0.510±0.070)和Runx-2(Western blot：0.573±0.020；PCR：0.57±0.060)比CON也出现了下降(OST Western blot： t＝16.630， P<0.05；PCR： t＝6.970， P<0.05；Runx-2 Western blot： t＝21.040， P<0.05；PCR： t＝6.710， P<0.05)，差异有统计学意义。在7 d的ALP染色中RNAi的颜色最浅，ALP活性检测中RNAi [(1.005±0.101) U/mg]活性比较NC[(2.042±0.116) U/mg]和CON[(1.931±0.136) U/mg]明显下降( t＝10.570， P<0.05； t＝9.400， P<0.05)，差异有统计学意义。在14 d的相对钙含量测定中RNAi[(22.290±1.981) ng/L]钙含量比较NC[(41.100±2.440) ng/L]和CON[(41.760±1.215) ng/L]明显下降( t＝10.530， P<0.05； t＝14.510， P<0.05)，差异有统计学意义；同样茜素红钙沉积染色中，也是RNAi颜色最浅。经IP-OIM分别刺激60 min，RNAi的SMAD1/5/9的磷酸化水平(0.337±0.030)比CON明显下降( t＝25.480， P<0.05)，差异有统计学意义。 结论:无机磷酸盐可通过RhoA/Rock-1引起瓣膜间质细胞的成骨分化，SMAD1/5/9的磷酸化在此过程中起重要作用。

目的:探讨选择性环氧合酶-2抑制剂塞来昔布是否通过抑制Rho/Rho相关蛋白激酶（ROCK）通路的表达对2型糖尿病（T2DM）合并非酒精性脂肪性肝炎（NASH）大鼠肝脏具有保护作用。方法:雄性SD大鼠40只，随机等分为T2DM合并非酒精性脂肪性肝炎（T2DM-NASH）组、T2DM-NASH+塞来昔布组、对照组、对照+塞来昔布组四组，其中T2DM-NASH及T2DM-NASH+塞来昔布组予高糖高脂饲料喂养，对照组及对照+塞来昔布组予基础饲料（25 kJ/kg）喂养，4周后T2DM-NASH组及T2DM-NASH+塞来昔布组腹腔注射链脲佐菌素（STZ，30 mg/kg）诱导T2DM模型，而对照组及对照+塞来昔布组腹腔注射等体积柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，STZ注射4周后T2DM-NASH+塞来昔布组及对照+塞来昔布组予塞来昔布（10 mg·kg -1·d -1）溶于生理盐水中灌胃4周，剩余两组大鼠予等体积生理盐水灌胃4周。第12周末处死动物，取肝脏组织，行HE染色观察肝脏病理改变；免疫组织化学及蛋白质印迹法检测RhoA、Rho相关蛋白激酶1（ROCK1）及Rho相关蛋白激酶2（ROCK2）蛋白在肝脏的表达，实时定量PCR法检测RhoA、ROCK1及ROCK2 mRNA在肝脏的表达情况，并采用方差分析及 t检验对比各组间蛋白及mRNA的表达差异。 结果:与对照组及对照组+塞来昔布组相比，T2DM-NASH组及T2DM-NASH+塞来昔布组光镜下肝组织呈重度脂肪变性，部分可见炎症细胞浸润，且肝组织RhoA、ROCK1及ROCK2的蛋白及mRNA表达水平均显著升高（ P < 0.05),而T2DM-NASH+塞来昔布组较T2DM-NASH组肝细胞脂肪变性有所减轻且肝组织RhoA、ROCK1及ROCK2蛋白及mRNA表达水平均降低（ P < 0.05)。 结论:选择性环氧合酶-2抑制剂塞来昔布对T2DM-NASH大鼠肝脏具有保护作用,而其作用可能是通过抑制Rho/ROCK通路的表达而达到的。

目的:探讨RhoA/Rho激酶1(ROCK1)下调抑制肌球蛋白轻链(MLC)磷酸化在主动脉夹层(AD)形成过程中的作用。方法:检测正常(NA)和AD主动脉原代平滑肌细胞(SMC)中RhoA/ROCK1的表达与MLC的磷酸化程度。免疫荧光观察SMC中MLC磷酸化程度和结构。β-氨基丙腈(BAPN)联合应用ROCK1抑制剂Fasudil，验证RhoA/ROCK1下调在AD形成中的作用。组间比较采用 t检验或 χ2检验，Kaplan-Meier生存曲线采用非参数检验。 结果:NA组和AD组年龄( t＝－1.439， P>0.05)、性别( χ2＝0.900， P>0.05)差异无统计学意义，AD组高血压患者多于正常组( χ2＝5.562， P<0.05)。AD主动脉SMC中RhoA(NA：42 782±31 339，AD：6 975±3 130， t＝2.585， P<0.05)和ROCK1表达下调(NA：64 626±38 822，AD：13 851±961， t＝2.977， P<0.05)，MLC磷酸化减少(NA：230 193±27 749，AD：51 142±48 151， t＝6.561， P<0.01)。免疫荧光显示AD组SMC和Fasudil处理的SMC中MLC磷酸化降低，结构受损。Fasudil联合BAPN的夹层形成率(100%)高于BAPN的夹层形成率(50%， χ2＝22.780， P<0.01)。 结论:RhoA/ROCK1下调抑制MLC磷酸化促进了AD的发生。

目的:评价Rho亚家族蛋白A(RhoA)/Rho相关的卷曲连接蛋白激酶2(ROCK2)信号通路在三叶苷减轻大鼠脑缺血再灌注损伤中的作用。方法:清洁级健康雄性SD大鼠80只，6~8周龄，体重230~280 g，采用随机数字表法分为4组( n＝20)：假手术组(S组)、脑缺血再灌注组(IR组)、脑缺血再灌注+三叶苷组(T组)和脑缺血再灌注+三叶苷+RhoA/ROCK2信号通路激动剂AA组(A组)。采用大脑中动脉栓塞法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型。T组和A组大鼠于缺血前3 d给予三叶苷15 mg/kg灌胃，2次/d，连续3 d，A组大鼠于每次灌胃前腹腔注射RhoA/ROCK2信号通路激动剂AA 10 mg/kg。于再灌注24 h时行神经行为学评分，随后处死大鼠取海马组织，采用流式细胞术检测海马神经元凋亡率，TTC染色确定脑梗死体积，采用Western blot法检测磷酸化RhoA(p-RhoA)、ROCK2和裂解的caspase-3(cleaved caspase-3)的表达，透射电镜下观察海马神经元超微结构。 结果:与S组比较，IR组大鼠神经行为学评分和海马神经元凋亡率升高，脑梗死体积增加，p-RhoA、ROCK2和cleaved caspase-3表达上调( P<0.05)，海马神经元病理学损伤加重；与IR组比较，T组大鼠神经行为学评分和海马神经元凋亡率降低，脑梗死体积减少，p-RhoA、ROCK2和cleaved caspase-3表达下调( P<0.05)，海马神经元病理学损伤减轻；与T组比较，A组大鼠神经行为学评分和海马神经元凋亡率升高，脑梗死体积增加，p-RhoA、ROCK2和cleaved caspase-3表达上调( P<0.05)，海马神经元病理学损伤加重。 结论:RhoA/ROCK2信号通路参与了三叶苷减轻大鼠脑缺血再灌注损伤的过程，可能与抑制海马神经元凋亡有关。

Background::Hyperthermia in combination with DnaJA4-knockout (KO) obviously affects the anti-viral immunity of HaCaT cells. The mechanisms of this process are not yet fully explored. However, it is known that DnaJA4 interacts with actin cytoskeleton after hyperthermia. Our aim was to investigate the effects of DnaJA4 on F-actin in HaCaT cells following hyperthermia.Methods::Wild-type (WT) and DnaJA4-KO HaCaT cells were isolated at either 37°C (unheated) or 44°C (hyperthermia) for 30 min followed by testing under conditions of 37°C and assessing at 6, 12, and 24 h after hyperthermia. The cytoskeleton was observed with immunofluorescence. Flow cytometry and Western blotting were used to detect the expression of F-actin and relevant pathway protein.Results::DnaJA4-KO and hyperthermia changed the cytoskeleton morphology of HaCaT cells. F-actin expression levels were elevated in DnaJA4-KO cells compared with WT cells (6364.33 ± 989.10 vs. 4272.67 ± 918.50, P < 0.05). In response to hyperthermia, F-actin expression levels of both WT and DnaJA4-KO cells showed a tendency to decrease followed by an obvious recovery after hyperthermia (WT cells: unheated vs. 6 h after hyperthermia or 24 h after hyperthermia: 0.34 ± 0.02 vs. 0.24 ± 0.01, 0.31 ± 0.01, P < 0.001, P < 0.05; DnaJA4-KO cells: unheated vs. 6 h after hyperthermia or 24 h after hyperthermia: 0.44 ± 0.01 vs. 0.30 ± 0.01, 0.51 ± 0.02, P < 0.001, P < 0.01). WT cells restored to baseline levels observed in the unheated condition, while DnaJA4-KO cells exceeded baseline levels in the recovery. As the upstream factors of F-actin, a similar profile in rho-associated serine/threonine kinase 1 (ROCK 1) and RhoA expressions was observed after hyperthermia. While E-cadherin expression was decreased in response to hyperthermia, it was increased in DnaJA4-KO cells compared with WT cells. Conclusions::Hyperthermia affects the expression levels of F-actin in HaCaT cells. DnaJA4 knockout increases the expression of F-actin in HaCaT cells after hyperthermia. DnaJA4 regulates the expressions of F-actin and the related pathway proteins in response to hyperthermia in HaCaT cells.

目的:探讨过表达破骨细胞刺激性转膜蛋白（osteoclast stimulatory transmembrane protein，OC-STAMP）对上皮-间质转化的作用及机制。方法:于2021年4月，将小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞MLE-12细胞分为过表达对照组（NC组）、 Ocstamp过表达组（over- Ocstamp组）、法舒地尔（Fasudil）干预组（over- Ocstamp+Fasudil组）、沉默对照组（si-NC组）、 Ocstamp沉默组（si- Ocstamp组）。采用蛋白免疫印迹（Western blotting）法、免疫细胞化学染色法检测OC-STAMP、上皮标志蛋白E-钙黏蛋白（E-cadherin，E-cad）、间质标志蛋白α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、Ras基因家族成员A（Ras homolog gene family member A，RhoA）、Rho GDP解离抑制因子α（Rho GDP dissociation inhibitor α，Rho GDIα）、Rho相关蛋白激酶（Rho-associated protein kinase，ROCK）、磷酸化肌球蛋白磷酸酶（phosphate myosin phosphatase，p-MYPT）蛋白表达，采用鬼笔环肽法检测细胞骨架肌动蛋白（filamentous actin，f-actin）的变化。采用 t检验比较两组间各蛋白的相对表达量。 结果:Western blotting及免疫细胞化学染色法结果显示，与NC组比较，over- Ocstamp组E-cad蛋白表达下调，α-SMA、Rho GDIα、RhoA、ROCK、p-MYPT蛋白表达增加，F-actin表达增强，差异均有统计学意义（ P<0.05）；与si-NC组比较，si- Ocstamp组E-cad和α-SMA蛋白表达差异均无统计学意义（ P>0.05）；与over- Ocstamp组比较，over- Ocstamp+Fasudil组E-cad蛋白表达上调，α-SMA、Rho GDIα、RhoA、ROCK、p-MYPT蛋白表达下降，F-actin表达减弱，差异均有统计学意义（ P<0.05）。 结论:肺泡Ⅱ型上皮细胞过表达OC-STAMP，可能通过激活Rho GDIα/RhoA/ROCK信号通路，诱导肌动蛋白细胞骨架重塑，进而促进上皮-间质转化。

目的:探讨法舒地尔对脓毒症小鼠急性肺损伤的保护作用。方法:4~6周龄雄性C57BL小鼠45只随机（随机数字法）分为对照组（Control组）、脂多糖组（LPS组）、法舒地尔干预组（FAS+LPS组），每组15只。LPS溶液腹腔注射及气道内滴注建立脓毒症小鼠急性肺损伤模型。法舒地尔干预组分别于腹腔注射LPS前30 min和气道滴注LPS后1 h，腹腔内注射盐酸法舒地尔溶液（10 mg/kg）。造模后4 h处死小鼠取肺组织。HE染色观察病理形态学变化；测定肺组织湿重/干重比（W/D）；TBA比色法测定MDA含量及MPO活性；IHC测定caspase-3表达水平；Western Blot法检测肺组织中RhoA、ROCK1、eNOS及p-eNOS的蛋白表达水平。结果:FAS预处理后肺组织中炎性细胞浸润和红细胞渗出显著减少，间质水肿及肺泡结构破坏显著减轻。与LPS组相比，FAS+LPS组的W/D值、MDA含量及MPO活性较LPS组均显著降低( P<0.01)。FAS+LPS组的Caspase-3表达较LPS组显著下降( P<0.01)。与Control组比，LPS组的RhoA、ROCK1的蛋白表达水平增高( P<0.05)，p-eNOS的蛋白表达水平下降( P<0.05)；与LPS组比，FAS+LPS组的RhoA和ROCK1的蛋白表达下调( P<0.05)，但p-eNOS的蛋白表达上调( P<0.05)；三组的eNOS总蛋白表达水平差异无统计学意义( P>0.05)。 结论:法舒地尔可减轻脓毒症小鼠肺组织炎性细胞浸润程度，下调肺组织细胞凋亡，抑制RhoA/ROCK1信号通路活性并促进eNOS的磷酸化表达。

目的:探讨RhoA/Rho激酶1(ROCK1)参与细胞外基质(ECM)沉积对慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者肺小静脉、肺小动脉及小气道平滑肌重塑的病理生理意义。方法:本研究为病例对照研究。采用非随机抽样法，分析2019年10月至2020年12月宁夏医科大学总医院收治的因原发性肺肿瘤而接受肺切除术患者的肺组织，结合患者肺功能及临床病史分为COPD组( n＝13)，对照组( n＝12)。使用α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)抗体鉴定平滑肌细胞，选取高倍视野下结构完整的肺小静脉及肺小动脉(血管横断面外径<500 μm)、小气道(气道横断面外径<2 000 μm)，使用Image-Pro Plus测量肺小静脉、肺小动脉血管外径，小气道基底膜周长，计算肺小静脉、肺小动脉及小气道平滑肌层面积占管腔横断面面积百分比(WA%)作为评估平滑肌重塑的指标。采用免疫组织化学及蛋白免疫印迹法检测目的蛋白的表达。分析形态学和临床资料之间的相关性。 结果:COPD组肺小静脉、肺小动脉、小气道WA%均较对照组增高( P值均<0.05)。免疫组织化学检测显示COPD组肺小静脉、肺小动脉、小气道平滑肌细胞α-SMA、纤维连接蛋白(FN)、ROCK1表达中位平均光密度(AOD)值均较对照组增高( P值均<0.05)。蛋白免疫印迹法显示，COPD组肺组织α-SMA、FN、ROCK1蛋白表达灰度值分别为[(1.31±1.07)、(0.55±0.23)、(0.64±0.20)]，均较对照组增高，分别为[(0.59±0.37)、(0.26±0.16)、(0.33±0.18)， t值分别为2.30、3.86、4.06， P值均<0.05]。相关性分析显示，第1秒用力呼气容积/用力肺活量、第1秒用力呼气容积占预计之百分比与肺小静脉、肺小动脉、小气道WA%均呈负相关，与肺小静脉、肺小动脉、小气道平滑肌细胞ROCK1表达AOD值均呈负相关( P值均<0.05)。COPD组患者外周血中性粒细胞绝对值及超敏C反应蛋白较对照组升高( P值均<0.05)。 结论:轻中度稳定期COPD患者的肺小静脉、肺小动脉、小气道存在以平滑肌层增厚及ECM蛋白沉积为表现的重塑。ROCK1参与COPD患者肺小静脉、肺小动脉、小气道平滑肌重塑。炎症反应参与稳定期轻中度COPD发病。肺小静脉、肺小动脉、小气道平滑肌重塑及ROCK1蛋白表达与气流阻塞程度相关。

目的:探讨Rho激酶抑制剂对脓毒症大鼠肠损伤的影响及其可能机制。方法:将32只成年雄性SD大鼠按随机数字表法分为假手术组（Sham组）、Rho激酶抑制剂Y-27632对照组（Y+Sham组）、脓毒症模型组〔盲肠结扎穿孔术（CLP）组〕及Y-27632预处理组（Y+CLP组），每组8只。采用CLP法制备大鼠脓毒症模型；Sham组和Y+Sham组只游离拨动盲肠、不进行结扎穿孔。Y+Sham组和Y+CLP组大鼠于术前15 min腹腔注射Y-27632溶液5 mg/kg进行预处理；Sham组及CLP组大鼠则腹腔注射等量磷酸盐缓冲液（PBS）。于术后24 h取大鼠心脏血，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定血清二胺氧化酶（DAO）含量。收集小肠组织，苏木素-伊红（HE）染色后，光镜下观察肠组织病理学变化，并进行肠黏膜损伤评分（Chiu's评分）；采用免疫组化法检测肠组织Rho相关卷曲螺旋激酶1（ROCK1）和核转录因子-κB（NF-κB）阳性表达；采用ELISA法检测肠组织肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-10（IL-10）的含量。结果:Sham组和Y+Sham组肠组织结构完整，黏膜纤毛排列整齐；与Sham组相比，CLP组肠道黏膜纤毛排列紊乱，大量炎症细胞浸润，Chiu's评分显著升高（分：3.83±0.27比0.12±0.11， P<0.05），说明大鼠发生了脓毒症肠损伤；与CLP组相比，Y+CLP组大鼠肠上皮细胞坏死程度减轻，可见少量炎症细胞浸润，Chiu's评分显著降低（分：2.85±0.21比3.83±0.27， P<0.05），说明Y-27632预处理可以减轻脓毒症大鼠肠损伤。与Sham组相比，CLP组肠组织ROCK1和NF-κB阳性表达、血清DAO及肠组织TNF-α含量显著增加〔ROCK1表达（ A值）：0.19（0.18，0.22）比0.10（0.09，0.11），NF-κB表达（ A值）：0.40±0.02比0.15±0.01，DAO（ng/L）：287.81±23.31比144.92±17.72，TNF-α（ng/L）：101.08±5.62比74.81±5.56，均 P<0.05〕，而肠组织IL-10含量显著降低（μg/L：55.16±5.20比95.95±7.53， P<0.05）；与CLP组相比，Y+CLP组肠组织ROCK1和NF-κB的阳性表达、血清DAO及肠组织TNF-α的含量均显著降低〔ROCK1表达（ A值）：0.15（0.13，0.18）比0.19（0.18，0.22），NF-κB表达（ A值）：0.28±0.01比0.40±0.02，DAO（ng/L）：243.34±19.76比287.81±23.31，TNF-α（ng/L）：90.41±8.79比101.08±5.62，均 P<0.05〕，而肠组织IL-10的含量则显著增加（μg/L：66.15±5.74比55.16±5.20， P<0.05），说明Y-27632预处理对脓毒症肠损伤大鼠的保护作用可能与调节RhoA/ROCK1/NF-κB信号通路有关。 结论:Rho激酶抑制剂可以减轻脓毒症大鼠肠损伤，其机制可能与抑制肠道RhoA/ROCK1/NF-κB信号通路，减轻肠道炎症反应有关。

目的:探索微小RNA(miR)-340-5p在胰腺导管腺癌细胞(PDAC)中表达及影响其生物学行为的机制。方法:实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)检测40例胰腺导管腺癌与正常细胞中miR-340-5p的表达，研究其表达水平与临床特征之间的联系。检测不同胰腺导管腺癌细胞及人胰腺导管上皮细胞中miR-340-5p水平。miR-340-5p模拟物转染PDAC细胞株PANC-1；甲基噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖活性；划痕实验、Transwell侵袭实验检测细胞侵袭迁移能力。RT-qPCR及蛋白质印迹法(Western blot)检测N-钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的表达。双荧光素酶报告基因分析实验检测miR-340-5p对RhoA的调控功能。结果:PDAC组织中miR-340-5p水平低于正常胰腺组织(0.362 4±0.083 7、0.965 2±0.129 9， t＝21.272， P<0.01)；PDAC中miR-340-5p表达降低与胰腺癌淋巴结转移( χ2＝7.782， P<0.01)、肝转移( χ2＝17.109， P<0.01)有相关。双荧光素酶报告基因分析结果表明，野生型RhoA的荧光素酶活性在转染miR-340-5p模拟物后低于对照组(0.992 5±0.099 8比0.177 5±0.019 0， t＝18.496， P<0.01)。转染后，转染组细胞增殖活性降低(0.505 2±0.077 1比1.031 0±0.069 1、1.029 5±0.113 5， t＝38.012、7.637， P<0.01、迁移距离减少(0.753 3±0.050 1、0.725 0±0.071 5比0.338 3±0.087 7， t＝11.098、7.031， P<0.01)、迁移细胞数减少(57.000 0±4.290 0、52.666 7±5.785 0比19.833 3±2.994 0， P<0.01)。Western blot及RT-qPCR结果显示，与空白对照组(NC)及阴性对照组(Scramble)比较，miR-340-5p模拟物转染组N-cadherin(1.048 3±0.076 9、1.040 7±0.079 2比0.457 3±0.074 5， t＝11.800、11.585， P<0.01)、Vimentin(1.045 3±0.062 8、0.993 3±0.068 6比0.521 7±0.057 9， t＝10.982、9.585， P<0.05)、MMP-9(1.047 0±0.069 6、1.154 3±0.101 1比0.560 3±0.457 1， t＝32.803、18.559， P<0.01)表达显著降低，E-cadherin(1.053 3±0.100 3、0.987 7±0.083 4比1.976 0±0.154 2， t＝－29.502、－24.203， P<0.01)表达升高。 结论:胰腺导管腺癌中miR-340-5p表达降低，过表达miR-340-5p后能明显抑制PANC-1细胞的体外增殖和转移。其对RhoA信号通路介导的上皮-间充质转化(EMT)进程具有潜在抑制作用。