目的 优化两种中药体外抗过敏活性筛选方法,比较5个中药药对的体外抗过敏活性.方法 优化RBL-2H3(Rat basophil leukemia cells)细胞脱颗粒实验方法,通过甲苯胺蓝染色以及β-氨基己糖苷酶(β-hexosaminidase,β-HEX)和组胺(Histamine,HIS)释放3个指标比较5个药对抑制肥大细胞脱颗粒的活性;优化了透明质酸酶抑制实验,对5个中药药对的透明质酸酶抑制作用进行比较.结果 在RBL-2H3细胞脱颗粒实验中,5个中药药对中荆芥-防风、麻黄-细辛、防风-白芷、川芎-细辛均能不同程度抑制模型细胞释放β-HEX(P<0.05),苍耳子-辛夷与细胞共培养后脱颗粒模型细胞上清中β-HEX释放率显著升高(P<0.05);5个中药药对均可以降低脱颗粒模型细胞上清中HIS释放量.透明质酸酶抑制率实验中,各药对的透明质酸酶抑制率川芎-细辛>防风-白芷>荆芥-防风>麻黄-细辛,其中川芎-细辛抗过敏活性最强.结论 两种方法获得的不同药对体外抗过敏活性趋势具有一致性,说明两种方法可以用于体外抗过敏活性的筛选.

目的:利用网络药理学和实验验证探究三七总皂苷活性成分调控铁死亡干预口腔黏膜下纤维化的药效物质基础、潜在靶标及作用机制.方法:结合前期研究,通过文献检索确定网络药理学分析的三七总皂苷中的候选有效成分,并通过PubChem(有机小分子生物活性数据库,http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)检索有效成分,使用GeneCards数据库获得三七总皂苷活性成分的对应靶基因.在GeneCards、OMIM数据库中搜集口腔黏膜下纤维化的相关靶点.将三七总皂苷活性成分与口腔黏膜下纤维化的交集靶点通过Cytoscape 3.7.0软件绘制相应"活性成分-作用靶点"网络,并借助CytoHubba插件获得三七总皂苷活性成分的度值(Degree)排名,并对关键核心靶点进行分析.基因本体论(GO)功能和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析通过DA-VID数据库进行.将三七总皂苷活性成分干预口腔黏膜下纤维化的靶基因与通过FerrDb数据库获取得到的铁死亡过程中的标记基因及调控因子取交集,获得通过调控铁死亡过程干预口腔黏膜下纤维化的三七总皂苷靶基因.利用AutoDockTool1.5.7软件进行化合物和核心靶点的分子对接.人永生化角质形成细胞(HaCaT细胞系)体外培养后分为空白对照组、模型对照组、三七总皂苷12.5、25、50 μg/mL组;各组在相应不含药或含药的完全培养液中培养24 h后收集细胞;采用Western blot法检测各组细胞I型胶原(COL-Ⅰ)、低氧诱导因子-1(HIF-1α)、轻链溶质载体家族7成员11(SLC7A11)、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)蛋白表达;透射电镜观察细胞线粒体形态学变化.结果:共筛选出三七总皂苷中5个活性成分,包括人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rd、三七皂苷R1和人参皂苷Re,以及前列腺素内过氧化物合酶2(PTGS2)、一氧化氮合酶2(NOS2)等20个作用靶标.三七总皂苷中的5个活性成分与RNA聚合酶Ⅱ启动子对pri-miRNA转录的正向调控、细胞对缺氧的反应及转化生长因子受体信号通路等生物过程,核浆、胞质和胞核等细胞组成,酶结合、相同的蛋白质结合和RNA聚合酶ii序列特异性DNA结合转录因子结合等分子功能密切相关;KEGG发现其可通过介导PI3K-AKT信号通路、癌症途径、脂肪细胞因子信号通路、肿瘤中PD-L1表达和PD-1检查点等信号通路调控铁死亡,从而发挥干预口腔黏膜下纤维化的作用.细胞实验结果表明,模型对照组较空白对照组COL-Ⅰ、HIF-1α蛋白表达显著上调,SLC7A11、GPX4蛋白表达显著下调(P＜0.01);与模型对照组比较,三七总皂苷12.5、25、50 μg/mL组COL-Ⅰ、HIF-1α蛋白表达明显下调(P＜0.05),SLC7A11、GPX4蛋白表达明显上调(P＜0.05).空白对照组细胞线粒体形态结构正常;模型对照组细胞线粒体形态结构萎缩,线粒体变小,嵴明显减少,呈典型的铁死亡表现;三七总皂苷12.5、25、50 μg/mL组细胞线粒体形态结构逐渐恢复正常.结论:三七总皂苷具有多成分、多靶点、多通路干预口腔黏膜下纤维化的作用特点,下调HIF-1α信号通路抑制铁死亡可能是其抗纤维化重要机制之一.

目的 建立过敏和类过敏叠加的RBL-2H3细胞和ICR小鼠动物模型,对注射用血塞通(冻干)(XST)的过敏与类过敏反应进行评价研究.方法 体外以RBL-2H3细胞的β-氨基己糖苷酶(β-Hex)和组胺释放率为评价指标,确定抗二硝基苯单克隆抗体(DNP-IgE)、DNP-牛血清白蛋白(BSA)的剂量及与C48/80(30 μg·mL-1)作用的最佳时间,筛选过敏和类过敏叠加模型的阳性条件,随后考察XST(4、8、16mg·mL-1)对细胞活力及与DNP-IgE/BSA叠加后对细胞脱颗粒的影响.体内以ICR小鼠为实验对象,以(类)过敏反应症状分值及血浆中免疫球蛋白E(IgE)、组胺、5-羟色胺、血管内皮生长因子A(VEGF-A)、末端补体复合物(SC5b-9)含量为评价指标,筛选卵蛋白(OVA,2.5、5.0、10.0 mg·kg-1)、C48/80(1、2、4 mg·kg-1)过敏-类过敏模型阳性条件,最后对XST(60、120、240 mg·kg-1)的致敏性及是否会产生过敏、类过敏反应进行评价.结果 体外细胞实验最终确定400 ng·mL-1的 DNP-IgE致敏后用50 ng·mL-1的DNP-BSA激发的同时与C48/80共同作用30 min作为过敏与类过敏叠加阳性组;16mg·mL-1的XST与DNP-IgE/BSA联合叠加时,与单给DNP-IgE/BSA或XST组比较均促进组胺和β-Hex的释放(P＜0.01).体内小鼠实验中5、10mg·kg-1的OVA均会使小鼠体内IgE显著升高,依据过敏样反应分值和小鼠血浆内组胺、VEGF-A和SC5b-9含量最终确定5 mg·kg-1 OVA与1 mg·kg-1 C48/80建立叠加模型,耳、肺及支气管组织中可见明显的水肿及炎性细胞浸润.单纯的XST不会对小鼠致敏,但是与OVA介导的过敏反应叠加后,与单给DNP-IgE/BSA或XST组比较,会显著提高血浆中内组胺、VEGF-A和SC5b-9水平(P＜0.05、0.01),与建立的过敏-类过敏叠加模型表现出较好地一致性.结论 体外体内实验均表明IgE介导的过敏反应和C48/80引起的类过敏反应会产生叠加作用,加剧过敏介质的释放和免疫反应程度.同时此模型的建立也验证了 XST存在过敏与类过敏叠加现象,该模型可为中药注射剂的临床前安全性评价及合理用药提供参考.

目的 研究中麻黄Ephedra intermedia的化学成分.方法 采用Toyopreal HW-40C、Sephadex LH-20、硅胶和半制备高效液相等多种色谱学技术分离得到单体化合物,并根据其理化性质和波谱学数据鉴定其结构,并通过建立C48/80诱导RBL-2H3细胞脱颗粒体外模型,对中麻黄中所得单体化合物进行体外抗哮喘活性筛选.结果 从中麻黄50％丙酮提取物中分离得到21个化合物,分别鉴定为3-羟基-5-(4'-羟基苯基)戊酸乙酯(1)、3-羟基-5-(4'-羟基苯基)戊酸甲酯(2)、儿茶酚(3)、苯甲酸(4)、5-(4-羟基苯基)-2-戊烯酸(5)、(+)-rhododendrol(6)、frambinone(7)、香草乙酮(8)、4-羟基-3-甲氧基苯甲酸甲酯(9)、3,4-二羟基苯乙醇(10)、姜酮(11)、原儿茶酸(12)、3,5-二羟基-4-甲氧基苯甲酸(13)、丁香酸(14)、3-hydroxy-4-methoxy-benzene carboxylic acid(15)、香草酸(16)、丁香酸甲酯(17)、4-羟基-3-甲氧基苯丙酮(18)、去甲丁香色原酮(19)、5-(3,4-dihydroxyphenyl)-γ-valerolactone(20)、2-guaiacylpropane-1,3-diol(21).对所得单体化合物进行体外抗哮喘活性筛选,结果显示,与模型组相比,在给药10μmol/L条件下,化合物5、18、19能够显著抑制β-氨基己糖苷酶的释放(P＜0.05、0.01),化合物4、6、8、11、20、21能够轻微抑制β-氨基己糖苷酶的释放.结论 化合物1和2为2个首次确定绝对构型的新天然产物,化合物3、5～15、17～21首次从该植物中分离得到,其体外抗哮喘活性筛选结果表明,在给药10 μmol/L条件下,化合物5、18、19能够显著改善RBL-2H3脱颗粒现象,化合物4、6、8、11、20、21能够轻微改善RBL-2H3脱颗粒现象.

[目的]探究防风(Saposhnikovia divaricata,SD)提取物对大鼠嗜碱性白血病细胞RBL-2H3脱颗粒的影响及作用机制.[方法]采用噻唑蓝(methylthialazole tetrazolium,MTT)比色法检测,根据5、25、50、100、200、400 μg·mL-1SD提取物对RBL-2H3 细胞活性的影响,确定后续实验浓度.以免疫球蛋白E(immunoglobulinE,IgE)诱导建立RBL-2H3细胞脱颗粒模型.设立空白对照组、模型组、低剂量SD提取物组(5 μg·mL-1)、中剂量SD提取物组(25 μg·mL-1)、高剂量SD提取物组(50 μg·mL-1)和地塞米松(dexamethasone,DXMS)组(100 μg·mL1),干预30 min.MTT法检测低、中、高剂量SD提取物对RBL-2H3细胞脱颗粒模型活性的影响.甲苯胺蓝染色观察脱颗粒细胞形态,计算细胞脱颗粒率.免疫荧光染色测定细胞F-肌动蛋白(F-actin)表达.酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测细胞β-氨基己糖苷酶、组胺、白细胞介素-4(interleukin-4,IL-4)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)水平.免疫印迹法检测细胞磷脂酰肌醇-3-羟基激酶(phosphoinositide-3 kinase,PI3K)、磷酸化-PI3K(phosphorylation-PI3K,p-PI3K)、蛋白激酶 B(protein kinase B,AKT)、磷酸化-AKT(phosphorylation-AKT,p-AKT)、p38 丝裂原 活化蛋 白激酶(p3 8 mitogen activited protein kinaseelisa,p38MAPK)、磷酸化-p38MAPK(phosphorylation-p38MAPK,p-p38MAPK)、核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)、磷酸化-NF-κB(phosphorylation-NF-κB,p-NF-κB)、细胞外调节激酶(extracellular regulated kinases,ERK)、磷酸化-ERK(phosphorylation-ERK,p-ERK)蛋白表达.[结果]低、中、高剂量防风提取物(5、25、50 μg·mL-1)对RBL-2H3细胞活性无显著影响(P＞0.05).与空白对照组比较,模型组甲苯胺蓝染色细胞数量减少、形态变圆,细胞脱颗粒率显著上升,F-actin表达下降,β-氨基己糖苷酶、组胺、IL-4、IL-6、TNF-α 水平升高,IFN-γ 水平降低,p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-p38MAPK/p38MAPK、p-NF-KB/NF-KB、p-ERK/ERK表达升高(P＜0.01).与模型组比较,低、中、高剂量SD提取物组和DXMS组细胞F-actin表达增加,β-氨基己糖苷酶、组胺、IL-4、IL-6、TNF-α 释放显著下降(P＜0.05,P＜0.01),IFN-γ 释放显著增加(P＜0.01),p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-p38MAPK/p38MAPK、p-NF-κB/NF-κB、p-ERK/ERK表达降低(P＜0.05,P＜0.01);中、高剂量SD提取物组和 DXMS组细胞数量增加,形态多呈梭形,细胞脱颗粒率显著下降(P＜0.01).与低剂量SD提取物组比较,高剂量SD提取物组和DXMS组细胞脱颗粒率下降(P＜0.01)、F-actin表达增加(P＜0.05)、p-p38MAPK/p38MAPK表达降低(P＜0.01).[结论]SD提取物可抑制 IgE 致敏的 RBL-2H3细胞脱颗粒,降低炎性介质水平,其作用机制可能与抑制PI3K/AKT、p38MAPK/NF-κB、ERK蛋白磷酸化有关.

目的 探究款冬酮(tussilagone,TUS)对过敏性鼻炎模型(allergic rhinitis,AR)小鼠肥大细胞的抑制作用及其分子机制.方法 将BALB/c小鼠随机分为对照组、模型组、TUS组和Ly294002组,每组10只.AR小鼠模型采用腹腔注射卵清蛋白(OVA)联合鼻腔滴注OVA方法构建.造模完成后第1～7天,TUS组小鼠按照5 ml/kg的剂量每天腹腔注射8 × 10-2 mol/L款冬酮药剂;Ly294002组小鼠每天腹腔注射6.0 mg/kg的PI3K/AKT信号通路抑制剂Ly294002溶液.采用HE染色检测小鼠鼻黏膜组织病理情况,Giemsa染色检测鼻黏膜组织嗜酸性粒细胞和肥大细胞浸润;采用ELISA法检测致敏因子IgE、组胺、白三烯、IL-4、IL-5和IFN-γ水平;流式细胞术检测小鼠脾脏组织CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4+T细胞水平.Western blot分析PI3K、p-PI3K、PKB和p-PKB蛋白表达水平.将RBL-2H3细胞分为对照组、模型组、款冬酮组(C-TUS组)和Ly294002组(C-Ly294002组).采用100 ng/ml的DNP-IgE处理12 h致敏细胞后,C-TUS组细胞加入1 μl浓度为8×10-2 mol/L的款冬酮处理2 h,C-Ly294002组细胞加入10 μl浓度为25 mol/L的Ly294002溶液处理2 h.采用ELISA法检测β-己糖氨酸酶和组胺水平,采用Fura-2/AM钙离子荧光探针检测细胞内钙离子浓度,Western blot分析PI3K、p-PI3K、PKB和p-PKB蛋白表达水平.结果 与对照组比较,模型组小鼠鼻黏膜组织出现了大量炎性细胞浸润,肥大细胞和嗜酸性粒细胞数量均增加;TUS组和Ly294002组小鼠鼻黏膜组织炎性浸润较模型组显著改善,肥大细胞和嗜酸性粒细胞数量均减少.与对照组比较,模型组小鼠血清中致敏因子IgE、组胺、白三烯、IL-4和IL-5的水平均升高(P＜0.05),IFN-γ水平降低(P＜0.05),脾脏组织中CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4+T细胞比例降低(P＜0.01),鼻黏膜组织中PI3K和PKB蛋白磷酸化水平升高(P＜0.05);与模型组比较,TUS组和Ly294002组小鼠血清中致敏因子IgE、组胺、白三烯、IL-4和IL-5的水平均降低(P＜0.05),IFN-γ水平升高(P＜0.05),脾脏组织中CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4+T细胞比例升高(P＜0.05),鼻黏膜组织中PI3K和PKB蛋白磷酸化水平均降低(P＜0.05);与TUS组比较,Ly294002组各项指标比较差异无统计学意义(P＞0.05).与对照组比较,模型组RBL-2H3细胞中β-己糖氨酸酶、组胺、白三烯、IL4和IL-5的水平均升高(P＜0.01),IFN-γ水平降低(P＜0.05),Ca2+内流强度增强(P＜0.01),PI3K和PKB蛋白磷酸化水平升高(P＜0.05);与模型组比较,C-TUS组和C-Ly294002组RBL-2H3细胞中β-己糖氨酸酶、组胺、白三烯、IL4和IL-5的水平均降低(P＜0.05),IFN-γ水平升高(P＜0.05),Ca2+内流强度减弱(P＜0.05),PI3K和PKB蛋白磷酸化水平均降低(P＜0.05);与C-TUS组比较,C-Ly294002组各项指标比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 款冬酮通过抑制肥大细胞的活化和维持细胞免疫稳态,对过敏性鼻炎起到缓解作用,该机制可能与抑制PI3K/PKB信号通路激活有关.

目的 探究建立基于细胞响应谱的中药注射剂质量评控方法,以最大限度预警中药注射剂质量波动,保障中药注射剂临床用药安全.方法 收集注射用双黄连(冻干)不同批次正常样品和过期样品及临床发生不良反应样品,同时制备3批特殊样品(光照、暴露、高温).建立注射用双黄连(冻干)的细胞响应谱并提取关键参数,进行相似度、聚类分析和主成分分析,以筛检质量波动样品.结果 以大鼠嗜碱性细胞白血病RBL-2H3细胞为模式细胞,注射用双黄连(冻干)正常样品为模式药物,建立了注射用双黄连冻干细胞响应谱,并提取脱附时间(ΔT)、曲线下面积(AUC)、抑制率(I12,I24)、相似度为特征参数,进行量化分析,通过细胞响应谱法在25批注射用双黄连(冻干)样品中共检出不合格样品21批,细胞响应谱法不仅可有效区分正常样品和特殊样品,而且还能将高温组、光照组和过期样品有效区分,但是不能将开放环境组和不良反应组样品分开.结论 细胞响应谱方法能更全面、灵敏、准确地发现中药注射剂质量波动差异,可作为制剂通则检查和化学指纹谱检测的有益补充,提高中药注射剂产品质控水平.

目的 建立适宜的细胞模型对复杂基质生化药骨肽类注射剂和垂体后叶注射剂类过敏反应风险进行评估,并与类过敏反应体内评价模型实验结果的相关性进行比较.方法 采用RBL-2H3细胞脱颗粒实验,选择β-氨基己糖苷酶作为适宜的评价指标以评估骨肽类注射剂和垂体后叶注射剂对RBL-2H3细胞脱颗粒的影响;采用实验室已建立的类过敏反应体内评价模型小鼠耳郭蓝染实验,以蓝染率及伊文思蓝升高率为指标评价两种复杂基质生化药注射剂体内类过敏反应风险的相关性.结果 骨肽类注射剂可诱导β-氨基己糖苷酶的释放率增加,与阴性对照组相比差异存在统计学意义(P＜0.01),垂体后叶注射剂不可诱导β-氨基己糖苷酶的释放.小鼠耳郭蓝染实验高剂量组中,复方骨肽注射液和骨肽注射液为临床等效剂量的6.67、10倍,类过敏反应阳性率分别为100%、66.7%;随着剂量的降低,复方骨肽注射液和骨肽注射液为临床等效剂量的1.67、2倍时,类过敏反应均判定为阴性,垂体后叶注射剂类过敏反应均为阴性,与体外结果一致.结论 通过结合RBL-2H3细胞脱颗粒模型与小鼠耳郭蓝染模型可对药物类过敏反应风险进行评估和筛查,同时也可为复杂基质类生化药类过敏反应物质基础及机制的研究评价提供参考和手段.

目的:进一步明确荆防散乙酸乙酯萃取部位及其分离物的抗过敏作用,探讨其作用机制,初步揭示其有效物质基础.方法:采用C48/80刺激RBL-2H3细胞脱颗粒实验,以β-氨基己糖苷酶释放为评价指标初步筛选各分离物的抗过敏作用;采用半抗原DNFB(2,4-二硝基氟苯)诱导小鼠变应性接触性皮炎模型(ACD模型),观察荆防散乙酸乙酯萃取部位及其分离物的抗过敏作用与机制.结果:荆防散乙酸乙酯部位及其分离物对C48/80诱导的RBL-2H3细胞β-氨基己糖苷酶的释放均表现出一定的抑制作用;荆防散乙酸乙酯分离物A、C、D能抑制DNFB诱导所致的变应性接触性皮炎模型小鼠的耳肿胀度,并降低耳组织中IL-4、IFN-γ、TNF-α水平;分离物D显著降低模型小鼠血清IgE水平,分离物C对模型小鼠耳组织的病理损伤改善作用较优.荆防散乙酸乙酯萃取部位对模型小鼠耳组织中IL-4、IFN-γ及血清中IgE水平亦有降低作用.结论:荆防散乙酸乙酯萃取部位抗过敏作用明确,其分离物A、C、D为其主要有效物质,其中分离物D能显著抑制IgE生成,可能作用于过敏反应初级阶段,分离物A、C则对致敏后期相关过敏介质的释放具有抑制作用.

目的 探讨中药活性成分蛇床子素对大鼠RBL-2H3嗜碱性粒细胞脱颗粒的影响.方法 用含10％胎牛血清(FBS)的细胞培养基(Dulbecco's modified eagle medium,DMEM)传代培养RBL-2H3大鼠嗜碱性白血病细胞,并给予不同浓度的蛇床子素和佛波酯(PMA)处理;用CCK-8法测定药物处理与未处理细胞的存活率;油镜结合甲苯胺蓝染色观察细胞形态与脱颗粒变化;测定-氨基己糖苷酶活性估测细胞脱颗粒率;用透射电镜下观察细胞超微结构变化.结果 与空白对照相比,0.5 μmol/L PMA导致细胞明显变圆,胞质内嗜碱性染色(蓝色)的颗粒物减少,-氨基己糖苷酶释放率存在显著增加(P＜0.01);透射电镜也观察到PMA处理细胞内存在较多的空泡,电子致密的粗大颗粒减少,提示PMA能有效刺激RBL-2H3细胞脱颗粒.3个浓度(1,10,50 μmol/L)蛇床子素联合0.5 μmol/L PMA处理细胞,结果显示蛇床子素能剂量依赖地抑制脱颗粒.结论 蛇床子素能明显抑制RBL-2H3细胞非IgE介导脱颗粒反应,可能与其抗过敏活性有关.