Ⅱ型鼠李半乳糖醛酸聚糖(RG-Ⅱ)是果胶结构域中的一种,其结构在不同物种之间具有高度的保守性.RG-Ⅱ的主链由约 9个半乳糖醛酸经α-1,4糖苷键连接而成,并被 6个(A-F)明确定义的侧链取代.其中二糖侧链C、D和单糖侧链E、F的结构在不同来源的RG-Ⅱ中基本保持相同.寡糖侧链A和B则存在轻微的变异性.通过相对分子质量、单糖组成和质谱分析等手段可实现RG-Ⅱ的结构表征.中药中含有RG-Ⅱ结构域的多糖具有很高的药用价值,使用内切多聚半乳糖醛酸酶(Endo-PG)和草酸青霉可将RG-Ⅱ从中药中分离并对其在多糖中的含量进行测定.从葡萄酒中可快速制备大量RG-Ⅱ标准品用于新定量方法的开发,实现对中药活性多糖的质量控制,推动中药多糖的研究进程.

目的:探讨人参皂苷Rg1对阿尔茨海默病(AD)大鼠模型脑片神经元自噬小体相关蛋白表达的影响及其分子机制。方法:选取6周龄SD大鼠断头取脑制备海马脑片，将海马脑片随机分为空白对照组、模型组及低、中、高浓度Rg1组，每组10张脑片。模型组人工脑脊液中加入Aβ 1-42(终浓度5 μmol/L)处理2 h造模，低、中、高浓度Rg1组加入Aβ 1-42(终浓度5 μmol/L)作用2 h造模后分别加入Rg1致终浓度分别为60 μmol/L、120 μmol/L、240 μmol/L作用3 h；空白对照组不给予任何干预药物。干预结束后采用苏木精-伊红(HE)染色观察各组海马脑片病理学改变情况；采用透射电镜检测各组海马脑片自噬小体情况；采用Western blot检测各组脑片自噬相关蛋白P62、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达水平以及Aβ 1-42和Shank蛋白表达水平。 结果:HE染色结果显示，模型组海马神经元排列紊乱，存在神经元死亡和缺失，Rg1各组海马神经元排列及缺失情况较模型组改善，以高浓度Rg1组改善最明显；透射电镜结果显示，模型组脑片自噬小体较空白对照组明显增多，Rg1各组脑片中自噬小体均较模型组减少。蛋白质印迹结果显示，与空白对照组比较，模型组脑片Shank1、P62和LC3-Ⅰ蛋白水平减少(均 P<0.05)，Aβ 1-42、LC3-Ⅱ蛋白水平升高(均 P<0.05)；与模型组比较，各Rg1组脑片Shank1、P62和LC3-Ⅰ蛋白表达水平均升高(均 P<0.05)、Aβ 1-42、LC3-Ⅱ蛋白水平均降低(均 P<0.05)，其中以高浓度Rg1组最明显。 结论:人参皂苷Rg1可能通过上调AD大鼠模型海马脑片Shank1、P62、LC3-Ⅰ蛋白表达，抑制自噬作用，发挥大脑神经元的保护作用。

目的:评价组蛋白去乙酰化酶3 (HDAC3)在原代大鼠心肌细胞高糖缺氧复氧损伤中的作用及其与自噬的关系。方法:将1~3 d左右的新生SD乳鼠提取原代心肌细胞，铺板。按随机数字表法分为5组( n＝24)：对照组(C组，糖浓度5.5 mmol/L)、缺氧复氧组(H/R组)、高糖组(H组，糖浓度30 mmol/L)、高糖缺氧复氧组(HH/R组)和高糖缺氧复氧+HDAC3抑制剂RGFP966组(HH/R+RG组)。采用50%葡萄糖注射液制备高糖培养基(终浓度为30 mmol/L)。H/R组细胞置于低氧环境(5%CO 2-0.9%O 2-94.1%N 2)中培养6 h，再置于常氧环境中复氧2 h制备心肌细胞缺氧复氧模型。HH/R+RG组于缺氧复氧前24 h加入RGFP966，终浓度10 μmol/L。于细胞复氧2 h时，采用CCK-8法检测细胞活力；ELISA法检测细胞上清LDH活性；自噬双标腺病毒(mRFP-GFP-LC3)转染下共聚焦显微镜检测细胞自噬水平；Western blot法检测心肌细胞HDAC3、p62、LC3Ⅱ和LC3Ⅰ的表达，计算LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值。 结果:与C组比较，H/R组和H组心肌细胞活力降低，上清液LDH活性升高，H/R组自噬小体数增加，心肌细胞HDAC3表达上调，p62表达下调，LC3 Ⅱ/I比值升高，H组自噬小体数减少，心肌细胞HDAC3和p62表达上调，LC3 Ⅱ/I比值降低( P<0.05)；与H/R组比较，HH/R组心肌细胞活力降低，上清液LDH活性升高，自噬小体数量降低，HDAC3和p62表达上调，LC3 Ⅱ/I比值降低( P<0.05)；与H组比较，HH/R组心肌细胞活力降低，上清液LDH活性升高，自噬小体数量增加，HDAC3和p62表达上调，LC3 Ⅱ/I比值升高( P<0.05)；与HH/R组比较，HH/R+RG组心肌细胞活力升高，上清液LDH活性降低，自噬小体数量增加，HDAC3和p62表达下调，LC3 Ⅱ/Ⅰ比值升高( P<0.05)。 结论:HDAC3表达上调参与了原代心肌细胞高糖缺氧复氧损伤的过程，与降低细胞自噬水平有关。

目的:利用网络药理学和实验验证探究三七总皂苷活性成分调控铁死亡干预口腔黏膜下纤维化的药效物质基础、潜在靶标及作用机制.方法:结合前期研究,通过文献检索确定网络药理学分析的三七总皂苷中的候选有效成分,并通过PubChem(有机小分子生物活性数据库,http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)检索有效成分,使用GeneCards数据库获得三七总皂苷活性成分的对应靶基因.在GeneCards、OMIM数据库中搜集口腔黏膜下纤维化的相关靶点.将三七总皂苷活性成分与口腔黏膜下纤维化的交集靶点通过Cytoscape 3.7.0软件绘制相应"活性成分-作用靶点"网络,并借助CytoHubba插件获得三七总皂苷活性成分的度值(Degree)排名,并对关键核心靶点进行分析.基因本体论(GO)功能和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析通过DA-VID数据库进行.将三七总皂苷活性成分干预口腔黏膜下纤维化的靶基因与通过FerrDb数据库获取得到的铁死亡过程中的标记基因及调控因子取交集,获得通过调控铁死亡过程干预口腔黏膜下纤维化的三七总皂苷靶基因.利用AutoDockTool1.5.7软件进行化合物和核心靶点的分子对接.人永生化角质形成细胞(HaCaT细胞系)体外培养后分为空白对照组、模型对照组、三七总皂苷12.5、25、50 μg/mL组;各组在相应不含药或含药的完全培养液中培养24 h后收集细胞;采用Western blot法检测各组细胞I型胶原(COL-Ⅰ)、低氧诱导因子-1(HIF-1α)、轻链溶质载体家族7成员11(SLC7A11)、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)蛋白表达;透射电镜观察细胞线粒体形态学变化.结果:共筛选出三七总皂苷中5个活性成分,包括人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rd、三七皂苷R1和人参皂苷Re,以及前列腺素内过氧化物合酶2(PTGS2)、一氧化氮合酶2(NOS2)等20个作用靶标.三七总皂苷中的5个活性成分与RNA聚合酶Ⅱ启动子对pri-miRNA转录的正向调控、细胞对缺氧的反应及转化生长因子受体信号通路等生物过程,核浆、胞质和胞核等细胞组成,酶结合、相同的蛋白质结合和RNA聚合酶ii序列特异性DNA结合转录因子结合等分子功能密切相关;KEGG发现其可通过介导PI3K-AKT信号通路、癌症途径、脂肪细胞因子信号通路、肿瘤中PD-L1表达和PD-1检查点等信号通路调控铁死亡,从而发挥干预口腔黏膜下纤维化的作用.细胞实验结果表明,模型对照组较空白对照组COL-Ⅰ、HIF-1α蛋白表达显著上调,SLC7A11、GPX4蛋白表达显著下调(P＜0.01);与模型对照组比较,三七总皂苷12.5、25、50 μg/mL组COL-Ⅰ、HIF-1α蛋白表达明显下调(P＜0.05),SLC7A11、GPX4蛋白表达明显上调(P＜0.05).空白对照组细胞线粒体形态结构正常;模型对照组细胞线粒体形态结构萎缩,线粒体变小,嵴明显减少,呈典型的铁死亡表现;三七总皂苷12.5、25、50 μg/mL组细胞线粒体形态结构逐渐恢复正常.结论:三七总皂苷具有多成分、多靶点、多通路干预口腔黏膜下纤维化的作用特点,下调HIF-1α信号通路抑制铁死亡可能是其抗纤维化重要机制之一.

以深度学习为代表的新一代人工智能技术已经成为推动新药研发的重要驱动力.本文创造性地提出了一种基于人工智能技术的创新药物分子设计和优化工作流程"分子工厂",该流程融合了自主研发的智能分子生成模型、高性能分子对接算法以及高精度亲和力预测方法,已作为核心模块被整合进一站式药物设计软件平台DrugFlow,为先导化合物发现和优化提供了一整套成熟的解决方案.利用"分子工厂"模块,针对Menin蛋白开展了抗耐药第 2代抑制剂的研发.通过计算和实验的结合,快速获得多个潜力化合物,其中化合物RG-10对Menin野生型、M327I突变体和T349M突变体的IC50 分别为9.681 nmol/L、233.2 nmol/L和 40.09 nmol/L;与已进入Ⅱ期临床的阳性参照分子SNDX-5613相比,其对M327I和T349M突变体的抑制活性显著提升.上述研究充分展现了"分子工厂"技术在新药研发项目中的独特优势,能快速高效地针对特定蛋白结构产生高质量的活性分子,对推动新药研发具有重大价值和深远意义.

目的 建立参黄养阴胶囊多组分定量控制的方法,探索化学模式识别及灰色关联度分析(GRA)模型在参黄养阴胶囊质量评价中的应用.方法 采用HPLC同时测定参黄养阴胶囊中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb3、人参皂苷Rd、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、美迪紫檀素、丹参素钠、丹酚酸B、丹参酮ⅡA、麦冬甲基黄烷酮A和甲基麦冬二氢高异黄酮B的含量.采用Agilent Eclipse Plus C18色谱柱,以乙腈-0.5%磷酸为流动相,梯度洗脱,检测波长分别为203、280、296 nm.通过化学模式识别和GRA对多组分含量结果进行分析,构建参黄养阴胶囊综合质量评价体系.结果 外标法方法学验证结果均符合要求.化学模式识别分析显示,丹酚酸B、芒柄花苷、丹参酮ⅡA、毛蕊异黄酮、人参皂苷Rb3和人参皂苷Rb1是影响参黄养阴胶囊产品质量的主要因子.GRA相对关联度为0.319 8～0.642 1,有利于分析产品间的差异.结论 多成分定量联合化学模式识别及GRA可用于参黄养阴胶囊的质量评价.

目的 建立同时测定启脾丸中 9 种成分含量的高效液相色谱-二极管阵列检测器(HPLC-DAD)法.方法 色谱柱为Agilent Extend C18 柱(250 mm×4.6 mm,5μm),流动相为甲醇-乙腈(1∶1,V/V)-0.08%磷酸水溶液(梯度洗脱),流速为 1.0 mL/min,检测波长分别为 237 nm(甘草苷、甘草酸铵)、283 nm(橙皮苷)、203 nm(人参皂苷Rg1、人参皂苷Re)、220 nm(白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅰ、茯苓酸),柱温为 30℃,进样量为 10μL.结果 甘草苷、甘草酸铵、橙皮苷、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅰ、茯苓酸的质量浓度分别在3.66～58.48μg/mL、6.21～99.41μg/mL、9.53～152.54μg/mL、3.06～48.89μg/mL、1.51～24.11μg/mL、2.54～40.60μg/mL、1.24～19.78μg/mL、2.10～33.64μg/mL、3.57～57.08μg/mL范围内与峰面积线性关系良好(r≥0.9995,n=6);精密度、重复性、稳定性试验结果的RSD均小于 2.0%(n=6);平均加样回收率分别为 100.34%,101.35%,101.18%,99.65%,98.73%,98.86%,100.86%,99.30%,100.86%,RSD分别为 1.43%,1.52%,0.68%,1.43%,1.00%,1.19%,1.31%,0.75%,1.36%(n=6).样品中 9 种成分的含量分别为 0.526 4～1.100 7 mg/g、0.956 2～1.700 2 mg/g、1.125 2～1.876 2 mg/g、0.5709～0.8256 mg/g、0.1014～0.5026 mg/g、0.2269～0.6117 mg/g、0.0994～0.3705 mg/g、0.1525～0.4164 mg/g、0.395 2～0.755 6 mg/g(n=3).结论 该方法操作简便、专属性强、稳定性好、结果准确,可用于启脾丸中 9 种成分含量的同时测定.

在肿瘤治疗中,中药制剂发挥减毒和抗肿瘤作用的地位同等重要.国内外尚无综合"辨识"多种治疗作用中药制剂质量标志物(Q-marker)的报道.因此笔者以艾迪注射液(Aidi Injection,AD)为例,基于"蜘蛛网"模式综合辨识AD抗肿瘤作用和心脏保护作用的质量标志物.首先基于可测性原则,对方中化学成分进行定性分析,再对方中含量较高且可定量测定的成分进行定量分析,作为可测性评价指标;基于稳定性原则,考察光照和温度因素对AD各成分含量的影响,作为稳定性的评价指标;基于配伍原则,依据其原药材在复方中的君、臣、佐、使配伍规律归属化合物;基于有效性原则,评价候选质量标志物的抗肿瘤、抗血管生成活性及其分别协同阿霉素(doxorubicin,DOX)抗肿瘤、抗血管生成和降低心肌毒性的活性,作为有效性的评价指标.建立"配伍-含量-稳定性-抗肿瘤细胞活性-协同DOX抗肿瘤活性-抗血管生成活性-协同DOX抗血管生成活性"七维度蜘蛛网和"配伍-含量-稳定性-降低DOX心脏毒性作用"四维度蜘蛛网,综合辨析AD抗肿瘤和心脏毒性保护作用的质量标志物.结果筛选出12个成分作为AD的质量标志物,其中斑蝥素、人参皂苷Re、人参皂苷Rb,、黄芪皂苷Ⅱ、隐绿原酸和人参皂苷Rg2为AD抗肿瘤的质量标志物,人参皂苷Rd、异嗪皮啶、紫丁香苷、刺五加苷E、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、王二酸作为AD心脏毒性保护作用的质量标志物.综合辨识出的12个质量标志物可覆盖全方4味药材,兼顾抗肿瘤和心脏毒性保护作用.这为AD的质量控制提供了科学依据,为辨识2种重要作用的中药制剂全面合理的质量标志物提供了有效方法.

探讨人参皂苷Rg1(ginsenoside Rg1,GRg1)对氧糖剥夺/复氧(oxygen and glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R)损伤大鼠嗜铬细胞瘤(rat adrenal pheochromocytoma,PC12)细胞的保护作用及其作用机制是否与调控肌醇需求酶 1(inositol-re-quiring enzyme 1,IRE1)-c-Jun 氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)-C/EBP 同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)信号通路有关.在PC12 细胞中建立OGD/R模型,将PC12 细胞随机分组为对照组、模型组、OGD/R+GRg1(0.1、1、10 μmol·L-1)组,OGD/R+GRg1+雷帕霉素(rapamycin,自噬激动剂)组、OGD/R+GRg1+3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA,自噬抑制剂)组、OGD/R+GRg1+衣霉素(tunicamycin,内质网应激激动剂)组、OGD/R+GRg1+4-苯基丁酸(4-phenylbutyric acid,4-PBA,内质网应激抑制剂)组、OGD/R+GRg1+3,5-二溴水杨醛(3,5-dibromosalicylaldehyde,DBSA,IRE1 抑制剂)组.除对照组外,其他组都进行OGD/R处理,即氧糖剥夺 6 h再复氧 6 h.MTT法检测细胞活力,Hoechst 33342 染色检测细胞凋亡情况,MDC法检测细胞自噬体的荧光强度.Western blot检测自噬相关蛋白 Beclin1、LC3-Ⅱ、p62 和通路相关蛋白 IRE1、p-IRE1、JNK、p-JNK、葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein 78,GRP78)、CHOP 的表达情况.结果显示,与模型组相比,0.1、1、10 μmol·L-1 GRg1 剂量依赖性地提高了 PC12 细胞的活力,降低了自噬蛋白 Beclin1、LC3-Ⅱ和通路相关蛋白 p-IRE1、p-JNK、GRP78、CHOP表达,降低了细胞凋亡率和MDC荧光强度,同时也增加了p62 蛋白表达.而分别干预自噬和内质网应激后,与OGD/R+GRg1(10 μmol·L-1)组相比,OGD/R+GRg1+rapamycin组和OGD/R+GRg1+tunicamycin组细胞凋亡率和MDC荧光强度增加,自噬蛋白Beclin1、LC3-Ⅱ和通路相关蛋白p-IRE1、p-JNK、GRP78、CHOP 表达增加,细胞相对存活率和p62 蛋白表达降低.3-MA、4-PBA和DBSA则发挥了相反作用.综上所述,GRg1 可能通过IRE1-JNK-CHOP通路抑制自噬而改善OGD/R诱导PC12 细胞的损伤.

目的:探讨人脐带间充质干细胞外分泌上清(hUMSC-CM)联合替莫唑胺(TMZ)在不同胶质瘤细胞系中的协同增敏作用及潜在机制.方法:采用2种血清剥夺法(24和48 h分批次撤血清法)收集hUMSC-CM并制备成冻干粉,设置5种浓度(0、1、3、6和9 g/L)处理大鼠恶性胶质瘤细胞系RG-2、人星形细胞瘤细胞系U251和人胶质母细胞瘤细胞系LN-428.通过CCK-8实验检测hUMSC-CM作用于胶质瘤细胞24、48和72 h后的肿瘤抑制可行性及敏感度.HE染色结合CCK-8法确定6种浓度(0、25、50、100、200和400 μmol/L)的TMZ作用于胶质瘤细胞48 h后化疗敏感性的差异.筛选出低、高2种浓度(3和9 g/L)的hUMSC-CM和低、中、高3种浓度(50、100和200 μmol/L)的TMZ配伍,作用于胶质瘤细胞后检测细胞活力和病理形态学变化.TUNEL染色检测细胞凋亡;流式细胞术分析细胞周期变化;Western blot检测凋亡相关蛋白cleaved caspase-3、cleaved caspase-8和cleaved PARP1,以及自噬相关蛋白beclin-1和LC3的表达变化,探讨hUMSC-CM与TMZ体外联合给药协同增敏的作用机制.结果:3种胶质瘤细胞系对hUMSC-CM和TMZ的敏感度为RG-2＞U251＞LN-428.hUMSC-CM(3和9 g/L)与TMZ(50、100和200 μmol/L)配伍给药对胶质瘤细胞生长的抑制作用比单独给药组显著增强(P＜0.05),且随着配伍药物剂量的增加而增强.其中,9 g/L hUMSC-CM(C9)与50 μmol/L TMZ(T50)配伍可有效抑制胶质瘤细胞生长.与C9或T50组相比,CCK-8实验显示C9+T50组细胞活力显著下降(P＜0.05),HE染色和TUNEL检测结果显示C9+T50组细胞形态变化明显,出现典型凋亡形态学特征,流式细胞术结果显示C9+T50可诱导胶质瘤细胞周期发生阻滞,Western blot结果显示C9+ T50组细胞中cleaved caspase-3、cleaved caspase-8、cleaved PARP1、beclin-1和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ水平显著升高(P＜0.01).结论:(1)hUMSC-CM与TMZ配伍给药对胶质瘤细胞的抑制作用具有广谱性,且两者之间存在增敏作用,在不同细胞系中呈现不同的增敏效果.(2)hUMSC-CM提高胶质瘤细胞对TMZ敏感度的机制可能与调节caspase-8/caspase-3/PARP1信号通路及自噬通路、诱导胶质瘤细胞发生凋亡和自噬有关.