目的:探讨磷脂酰胆碱特异性磷脂酶D2（phosphatidylcholine specific phospholipase D2，PLD2）通过Nrf2-NFκB途径缓解胰腺细胞损伤过程中泛凋亡的机制研究。方法:将大鼠胰腺AR42J细胞用于实验研究，采用随机数字法分为CON组（常规条件下培养的AR42J细胞）、CER组（建立体外胰腺炎模型，在AR42J细胞中加入10 nM cerulein）、CER+pcDNA组（在体外胰腺炎模型的基础上，建立非靶质粒阴性对照PcDNA）、CER+PLD2-OE组（在体外胰腺炎模型的基础上，建立了PcDNA的PLD2过表达质粒PLD2-OE）。通过RT-qPCR检测PLD2的表达。通过RT-qPCR检测细胞上清液炎症因子的水平。通过蛋白印迹分析Nrf2-NFκB信号通路的表达。通过蛋白印迹分析凋亡相关、焦亡相关和坏死相关蛋白的表达。结果:CER组（0.54±0.01）和CER+pcDNA组（0.62±0.01）PLD2 mRNA表达较CON组（1.02±0.03）降低，CER+PLD2-OE组（1.79±0.12）PLD2 mRNA表达较CON组升高。CER+PLD2-OE组的TNF- α mRNA（2.95±0.21）、IL-6 mRNA（2.35±0.18）和IL-10 mRNA（3.22±0.20）表达较CER + pcDNA组（TNF- α mRNA：4.25±0.25、IL-6 mRNA：3.64±0.21、IL-10 mRNA：3.22±0.20）降低。CER组Nrf2蛋白（0.49±0.01）表达较CON组（1.02±0.01）降低，CER组NFκB蛋白（2.52±0.21）表达较CON组（1.01±0.01）升高。CER+PLD2-OE组Nrf2蛋白（1.24±0.03）表达较CER + pcDNA组（0.50±0.01）升高，CER+PLD2-OE组NFκB蛋白（1.68±0.14）表达较CER + pcDNA组（2.46±0.22）降低。CER组Bax蛋白（1.83±0.14）表达较CON组（1.04±0.02）升高，CER组Bcl-2蛋白（0.31±0.01）表达较CON组（1.02±0.01）降低。CER+PLD2-OE组Bcl-2蛋白（0.75±0.02）表达较CER + pcDNA组（0.30±0.01）升高，CER+PLD2-OE组Bax蛋白（1.42±0.11）表达较CER + pcDNA组（1.85±0.13）降低。CER组Gasdermins蛋白（1.72±0.13）、Caspase-1蛋白（1.88±0.15）和NLRP3蛋白（1.77±0.13）表达较CON组（Gasdermins：1.13±0.04、Caspase-1：1.08±0.02、NLRP3：1.05±0.03）升高，CER+PLD2-OE组Gasdermins蛋白（1.24±0.05）、Caspase-1蛋白（1.16±0.04）和NLRP3蛋白（1.17±0.05）表达较CER+pcDNA组（Gasdermins：1.69±0.12、Caspase-1：1.75±0.13、NLRP3：1.80±0.14）降低。CER组RIPK1/RIPK3蛋白（0.52±0.01）、MLKL蛋白（0.48±0.01）和TNFR1蛋白（0.51±0.01）表达较CON组（RIPK1/RIPK3：1.04±0.02、MLKL：1.03±0.01、TNFR1：1.01±0.01）降低，CER+PLD2-OE RIPK1/RIPK3蛋白（0.65±0.02）、MLKL蛋白（0.54±0.01）和TNFR1蛋白（0.63±0.01）表达较CER+pcDNA组（RIPK1/RIPK3：1.72±0.15、MLKL：1.65±0.13、TNFR1：1.81±0.16）降低。 结论:PLD2在调节泛凋亡过程（凋亡、焦亡和坏死）中发挥关键作用，通过激活Nrf2抗氧化途径和抑制NFκB炎症途径，有效减轻胰腺细胞损伤。

目的 探讨清解化攻方调控RIPK1/RIPK3/MLKL信号通路对重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)大鼠胰腺坏死性凋亡的治疗作用及机制.方法 采用逆行胰胆管注射牛磺胆酸钠建立SAP大鼠模型,分别设置假手术组、模型组、不同剂量清解化攻方给药组和阳性对照组,不同剂量清解化攻方组予低中高剂量中药灌胃、阳性对照组予乌司他丁药物干预、假手术组和模型组予生理盐水灌胃;HE染色观察胰腺病理;ELISA检测大鼠血清α-淀粉酶、IL-1β、IL-6和TNF-α水平;免疫组化和Western blot检测大鼠胰腺组织RIPK1、RIPK3、MLKL蛋白表达;qRT-PCR检测大鼠胰腺组织RIPK1、RIPK3、MLKL mRNA转录水平.结果 与假手术组比,模型组大鼠胰腺针叶细胞弥漫性坏死、小叶间隔水肿明显、炎性细胞浸润,α-淀粉酶、IL-1β、IL-6和TNF-α水平明显升高(P＜0.01),RIPK1、RIPK3、MLKL 蛋白及 mRNA 表达水平显著升高(P＜0.01);与模型组比,清解化攻方各剂量组和阳性对照组明显改善胰腺组织病理学,减少胰腺组织坏死凋亡,降低α-淀粉酶、IL-1 β、IL-6和TNF-α表达水平(P＜0.01),降低 RIPK1、RIPK3、MLKL 蛋白及 mRNA 表达水平(P＜0.01).结论 清解化攻方可能通过调控RIPK1/RIPK3/MLKL信号通路,改善胰腺组织坏死性凋亡,从而起到保护胰腺组织的作用,减缓疾病的进展.

受体相互作用蛋白激酶1(receptor-interacting protein kinase 1,RIPK1)是一种多结构域丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶.它通过磷酸化特定的蛋白质,引起下游的信号转导和生物效应.近年来,随着对RIPK1的深入研究,学者发现其在自身免疫性疾病、神经退行性疾病,以及多种实体瘤和血液肿瘤中具有重要意义.一方面,RIPK1通过激活特定通路如核因子-κB(nuclear factor-KB,NF-κB)和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)等促进细胞存活及炎症反应.另一方面,RIPK1通过与胱天蛋白酶-8(cysteinyl aspartate specific proteinase-8,caspase-8)作用促进凋亡,或与RIPK3和混合谱系激酶结构域样假激酶(mixed lineage kinase domain-like protein,MLKL)作用促进坏死性凋亡的发生.RIPK1作为上游信号在不同肿瘤患者中表达水平不同.其支架功能和激酶活性可以调节癌症进展,也可以启动机体适应性免疫,抑制肿瘤进展;此外,还能产生免疫抑制性肿瘤微环境而促进肿瘤的发展.其双重作用在调节癌症的发生、发展及机体免疫反应方面都有所展现,可以作为新的治疗靶点控制癌症进展.该文从RIPK1的结构入手,深入探讨其功能,特别是其在调节癌症进展和免疫反应方面的功能,为癌症靶向药物的开发提供新的思路.

目的 基于RIPK1/RIPK3/MLKL信号通路探讨白头翁汤对溃疡性结肠炎小鼠肠黏膜愈合的影响及作用机制.方法 30只C57BL/6雄性小鼠随机分为对照组、模型组、白头翁汤组、英夫利西单抗组和联合组(白头翁汤+英夫利西单抗),每组6只.采用3.5%葡聚糖硫酸钠溶液自由饮用7 d建立溃疡性结肠炎小鼠模型,造模结束后,白头翁汤组每日予8 g/kg白头翁汤药液灌胃,英夫利西单抗组予5 mg/kg英夫利西单抗腹腔注射,联合组同步灌胃和腹腔注射,对照组和模型组予等体积生理盐水灌胃,连续7 d.每日记录小鼠体质量,观察粪便性状并进行疾病活动指数(DAI)评分,干预结束后测量结肠长度,ELISA检测血清白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量,HE染色观察结肠组织形态,RT-qPCR检测结肠组织受体相互作用蛋白激酶(RIPK)1、RIPK3、混合系激酶区域样蛋白(MLKL)mRNA表达,Western blot和免疫荧光染色检测结肠组织RIPK1、RIPK3、MLKL蛋白表达.结果 与对照组比较,模型组小鼠体质量降低(P<0.01),DAI评分升高(P<0.01),结肠长度缩短(P<0.01),血清IL-6、TNF-α含量升高(P<0.01);结肠黏膜破坏,隐窝及腺体结构消失,大量炎性细胞浸润,结肠组织病理评分升高(P<0.01);结肠组织RIPK1、RIPK3、MLKL mRNA和蛋白表达升高(P<0.01,P<0.05).与模型组比较,各给药组小鼠体质量增加(P<0.01),DAI评分降低(P<0.01),结肠长度增加(P<0.01),血清IL-6、TNF-α含量降低(P<0.05,P<0.01);结肠黏膜屏障破坏减轻,结肠组织病理评分降低(P<0.05);结肠组织RIPK1、RIPK3、MLKL mRNA和蛋白表达降低(P<0.05,P<0.01).结论 白头翁汤能减轻溃疡性结肠炎小鼠肠黏膜损伤、缓解炎症,其作用机制可能与抑制RIPK1/RIPK3/MLKL信号通路有关.

目的:探讨苍术素(ATR)通过调节受体相互作用蛋白激酶(RIPK)1/RIPK3/混合谱系激酶结构域样(MLKL)信号通路对非小细胞肺癌(NSCLC)A549细胞程序性死亡及裸鼠移植瘤生长的影响.方法:使用0～160 μmol/L的ATR处理A549细胞,MTT法检测细胞存活率以确定后续实验给药浓度.使用ATR和/或RIPK1抑制剂Nec-1(necrostatin-1)、caspase抑制剂Z-VAD-FMK处理A549细胞,验证ATR是否诱导A549细胞发生程序性坏死.将A549细胞分为对照组、ATR-L组、ATR-M组、ATR-H组(分别用0、10、20、40 μmol/L ATR处理)、ATR+Nec-1组(40 μmol/L ATR+50 μmol/L Nec-1处理),处理24 h后,采用PI单染及Hoechst33342/PI双染法检测细胞死亡情况、透射电镜观察细胞死亡形态、DCFH-DA荧光探针法检测细胞内ROS水平、JC-1染色法检测线粒体膜电位、WB法检测细胞中RIPK1/RIPK3/MLKL信号通路相关蛋白质的表达水平.构建A549细胞裸鼠移植瘤模型,用10 mg/kg ATR(溶于玉米油中)对裸鼠灌胃给药5周,观察ATR对移植瘤生长的影响,WB法检测移植瘤组织中RIPK1/RIPK3/MLKL信号通路相关蛋白质的表达水平.结果:10～160 μmol/L的ATR可显著抑制A549细胞增殖,选择10、20、40 μmol/L的ATR进行后续实验.ATR组A549细胞存活率显著低于对照组(P<0.01)和ATR+Nec-1组(P<0.01),而ATR+z-VAD组细胞存活率显著低于z-VAD组(P<0.01),说明ATR可诱导A549细胞发生程序性坏死而非凋亡.与对照组比较,ATR处理组A549细胞发生肿胀,线粒体内脊消失呈空泡化,细胞内容物向外泄漏,细胞核聚集,表现为坏死特征,ATR-L组、ATR-M组、ATR-H组A549细胞死亡率、ROS水平及p-RIPK1、p-RIPK3、p-MLKL表达水平均显著升高,线粒体膜电位显著降低(均P<0.01),且呈药物浓度依赖性;与ATR-H组比较,ATR+Nec-1组细胞死亡率、ROS及p-RIPK1、p-RIPK3、p-MLKL表达水平降低,线粒体膜电位显著升高(均P<0.01).裸鼠移植瘤实验结果显示,与对照组比较,ATR组裸鼠移植瘤体积、移植瘤质量均降低(P<0.05,或P<0.01),而与瘤组织中p-RIPK1、p-RIPK3、p-MLKL蛋白表达水平均显著升高(均P<0.01).结论:ATR可能通过激活RIPK1/RIPK3/MLKL信号通路诱导A549细胞发生程序性坏死,抑制A549细胞及其裸鼠移植瘤的生长.

目的 探究微小RNA(miR)-139-5p靶向受体相互作用蛋白激酶(RIPK)1/RIPK3/混合系列蛋白激酶结构域蛋白(MLKL)信号通路对慢性脑低灌注(CCH)大鼠认知障碍的影响.方法 将60只SPF级SD大鼠采用随机数字表法分为假手术组(Sham组)、模型组(Model组)、miR-NC组、miR-139-5p mimic组、miR-139-5p mimic+RIPK1抑制剂Nec-1组(miR-139-5p mimic+Nec-1组),每组12只.除Sham组外,其余组均采用永久性结扎双侧颈总动脉构建CCH模型.采用新物体识别实验、Morris水迷宫实验评价大鼠的认知功能;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测大鼠海马组织谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素6(IL-6)水平.实时荧光定量PCR(qPCR)法检测大鼠海马组织miR-139-5p及RIPK1、RIPK3、MLKL mRNA表达.Western blot法检测大鼠海马组织RIPK1、RIPK3、MLKL、突触素(SYP)、突触后密度蛋白95(PSD95)、α-突触核蛋白(α-SYN)蛋白的表达.双萤光素酶报告基因实验验证miR-139-5p和RIPK1的靶向关系.结果 与Sham组相比,Model组大鼠分辨系数降低,目标象限停留时间缩短,海马组织miR-139-5p、GSH-Px、SOD水平降低,SYP、PSD95蛋白表达降低(P＜0.05),逃避潜伏期延长,海马组织MDA、TNF-α、IL-6水平升高,RIPK1、RIPK3、MLKL mRNA和蛋白、α-SYN蛋白表达升高(P＜0.05).与Model组、miR-NC组相比,miR-139-5p mimic组相关指标的表达趋势与上述相反(P＜0.05).Nec-1进一步促进了上调miR-139-5p表达对CCH大鼠认知功能的恢复(P＜0.05).miR-139-5p和RIPK1存在结合位点.结论 上调miR-139-5p可能通过靶向抑制RIPK1/RIPK3/MLKL信号通路减轻CCH大鼠的认知障碍.

程序性细胞坏死是一种新发现的细胞死亡形式.这类死亡细胞形态类似坏死,而其死亡过程受胞内主动机制的调节,由此改变了坏死细胞不受内在机制调控的经典概念.当细胞膜上死亡受体与其配体结合,细胞内凋亡因子caspase-8被抑制时,激活受体相互作用蛋白(receptor interaction protein,RIPK1/RIPK3)激酶及关键底物——混合谱系激酶结构域样蛋白(mixed lineage kinase domain-like protein,MLKL)的信号通路,从而触发细胞发生程序性细胞坏死.后者参与多种疾病的病理过程,如肿瘤、免疫炎症、神经退行性疾病、脑缺血损伤等.本文就程序性细胞坏死的信号通路、重要调控分子及在神经损伤相关疾病致病机制进行综述,并对研究方法和分析工具药物进行了归纳总结.

目的:观察当归补血汤对糖尿病肾病(DKD)大鼠足细胞损伤及受体相互作用蛋白激酶1/受体相互作用蛋白激酶3/混合系激酶区域样蛋白(RIPK1/RIPK3/MLKL)信号通路的影响,探讨其治疗DKD的可能作用机制.方法:50只SD大鼠随机选取8只设为正常组,其余大鼠6周高糖高脂饮食结合一次性腹腔注射链脲佐菌素(STZ)0.035g·kg-1制备2型糖尿病大鼠模型.模型制备成功后随机分为模型组,当归补血汤高、低剂量(1.44,0.72 g·kg-1)组,厄贝沙坦(0.017 g·kg-1)组.药物干预20周后检测各组大鼠空腹血糖(FBG),肾重指数(KI),尿微量白蛋白与尿肌酐比值(UACR);苏木素-伊红(HE)染色观察肾组织病理形态学变化;透射电镜观察足细胞超微结构变化;酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测大鼠肾组织肿瘤坏死因子-α(TNF-α),白细胞介素-6(IL-6)水平;免疫组化法检测大鼠肾组织RIPK1,RIPK3,MLKL蛋白表达;原位末端标记法(TUNEL)检测大鼠肾脏足细胞凋亡率;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测大鼠肾组织RIPK1,RIPK3,MLKLmRNA表达水平;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测大鼠肾组织RIPK1,RIPK3,MLKL蛋白及足细胞标志蛋白肿瘤蛋白-1(WT-1)表达水平.结果:与正常组比较,模型组大鼠FBG,UACR,KI显著升高(P＜0.01),肾小球肥大,基底膜增厚,系膜外基质增多,系膜增生,足突融合或丢失,肾组织凋亡细胞明显增多,TNF-α及IL-6水平显著升高(P＜0.01),WT-1蛋白表达水平显著降低,RIPK1/RIPK3/MLKL mRNA及蛋白表达水平显著升高(P＜0.01);与模型组比较,当归补血汤高剂量组明显降低FBG,UACR,KI水平,明显改善肾组织病理学,减少足细胞的丢失,减少肾组织细胞凋亡,降低TNF-α及IL-6水平,升高WT-1蛋白表达水平,降低RIPK1/RIPK3/MLKL mRNA及蛋白表达水平(P＜0.05,P＜0.01).结论:当归补血汤可能通过调控RIPK1/R1PK3/MLKL信号通路,改善足细胞损伤,从而延缓DKD的发展进程.

该研究通过检索中国知网(CNKI)、维普(VIP)、万方(Wanfang)、Web of Science(WoS)、PubMed数据库,2005年1月1日至2021年12月31日中医药调节坏死性凋亡(necroptosis)的相关文献.文献分别导入NoteExpress进行去重及筛选,将最终纳入文献发文量导人Excel中绘制发文趋势图.根据普莱斯定律确定核心作者,采用VOSviewer 1.6.17绘制核心作者合作网络及高频关键词排序,运用CiteSpace 5.8.R3进行关键词聚类、关键词突现、时间线分布展示.最终纳入中文文献98篇,英文文献72篇.中医药调节坏死性凋亡发文量逐年增加,中国发文量位居世界前列,国内作者在该领域发挥着核心作用.中文文献以刘华发文最多,英文文献以CHEN X P(陈秀萍)发文最多,核心作者合作网络显示团队内部合作较多,团队间合作较缺乏.中、英文关键词分别形成了 10个有意义的聚类,显示中医药调节坏死性凋亡的研究热点主要集中于疾病、方药、相关因子、机制研究等.中、英文关键词分析显示,疾病治疗方面,肿瘤、缺血再灌注损伤、神经退行性疾病、炎症性疾病等研究较广泛;备受关注的中药成分是姜黄素、紫草素、丹参酮等;主要涉及的蛋白因子是Ripk1、Ripk3、Mlkl、TNF-α;主要信号通路为Ripk1/Ripk3/Mlkl通路、p53信号通路;主要集中于单味药及中药单体的研究.后续还需扩大经典中药复方的研究,深入探索其在各类疾病发生发展中的作用机制,为中医药治疗疾病提供新的思路和实验依据.

为了探究传统经方——大黄蛰虫丸(Dahuang Zhechong Pills,DHZCP)在体内改善睾丸衰老(testicular aging,TA)的作用和机制,笔者将24只雄性大鼠随机分成正常组、模型组、DHZCP组和维生素E(vitamin E,VE)组,通过D-半乳糖(D-galactose,D-gal)连续灌胃建立大鼠TA模型.在实验期间,每天经灌胃分别给予DHZCP组和VE组大鼠DHZCP混悬液和VE混悬液;此外,经灌胃给予正常组和模型组大鼠生理盐水.在D-gal和不同药物联合干预60 d后,处死全部大鼠,收集血液及睾丸组织,进而,针对模型鼠TA和睾丸细胞坏死性凋亡相关的各项指标进行检测和观察.这些指标包括各组大鼠衰老表型、睾丸总质量和睾丸指数、睾丸组织病理学特征和生精细胞数、性激素水平、睾丸组织活性氧(reactive oxygen species,ROS)产物表达特征、睾丸组织细胞周期蛋白表达水平和表达特征以及受体相互作用蛋白激酶1(receptor interacting serine/threonine protein kinase 1,RIPK1)/受体相互作用蛋白激酶 3(receptor interacting serine/threonine protein kinase 3,RIPK3)/底物混合谱系激酶样蛋白(mixed lineage kinase domain like pseudokinase,MLKL)信号通路关键信号分子蛋白表达水平.结果显示,对于TA模型鼠,DHZCP和VE都能改善衰老表型、睾丸总质量和睾丸指数、睾丸组织病理性特征和生精细胞数、血清睾酮和血清卵泡刺激素水平、睾丸组织ROS表达特征以及P21、P53蛋白表达水平和表达特征;此外,DHZCP与VE都能改善模型鼠睾丸组织RIPK1/RIPK3/MLKL信号通路关键信号分子蛋白表达水平;其中,对于RIPK3的改善作用,DHZCP优于VE.总之,在该研究中,笔者发现,DHZCP与VE相似,在体内能改善D-gal诱导的大鼠TA,其作用机制与抑制RIPK1/RIPK3/MLKL信号通路活性而减轻睾丸细胞坏死性凋亡有关.该研究为传统经方在男性健康领域的开发应用提供了初步的药理学证据.