目的:探讨斑点型锌指结构蛋白[speckle-type POZ(pox virus and zinc finger protein) protein, SPOP]在肠道病毒71型(EV71)感染中的作用。方法:免疫共沉淀分析SPOP对EV71非结构蛋白2A蛋白酶(2A pro)泛素化水平的影响，Western blot检测干扰素调节因子3(IRF3)蛋白磷酸化水平，过表达或敲低细胞中SPOP后感染EV71，RT-qPCR分析IFN-β转录水平，RT-qPCR和Western blot检测EV71结构蛋白VP1的转录水平及蛋白质水平。 结果:过表达HA-SPOP后感染EV71，发现EV71感染RD细胞受抑，同时EV71-2A pro的泛素水平呈HA-SPOP梯度依赖增多。转染shSPOP质粒进行内源性SPOP敲低后，黑色素瘤分化相关基因5(MDA5)、接头蛋白线粒体抗病毒信号蛋白(MAVS)、磷酸化干扰素调节因子3 (p-IRF3)水平呈剂量依赖地减少，而转染HA-SPOP质粒后，MDA5、MAVS、p-IRF3蛋白质水平呈剂量依赖地增加。SPOP高、低表达促进或降低EV71感染的细胞表达IFN-β mRNA，同时抑制和增加VP1在mRNA或蛋白质水平表达。 结论:SPOP可提高EV71-2A pro的泛素化水平从而促进2A pro降解，推测SPOP可通过抑制2A pro对视黄酸诱导基因蛋白-Ⅰ(RIG-Ⅰ)样受体(RLR)信号通路中关键分子MAVS和MDA5的降解，从而上调IRF3磷酸化水平促进IFN-β释放，最终活化宿主细胞抗病毒固有免疫抑制EV71复制。

目的 研究泛素特异性蛋白酶 26(ubiquitin-specific protease 26,USP26)通过调控 RLR信号通路影响肠道病毒 71 型(EV71)感染的机制和功能,深入了解 EV71 感染及其逃逸免疫防御关系,为临床治疗 EV71 感染提供依据.方法 利用RT-PCR和Western blot分别检测EV71 感染横纹肌肉瘤细胞(RD)0、2、4、8、12、24 h后的USP26 mRNA、VP1 mRNA及其蛋白质的表达水平;在RD细胞中设置转染USP26-siRNA(实验组)和转染阴性对照siRNA(对照组),再用EV71 感染RD细胞,收集感染 8、12 和 24h时的mRNA样本,RT-PCR检测VP1 mRNA的表达情况;收集感染 8h时的蛋白质样本,Western blot检测细胞中MDA5、p-IRF3、IRF3 蛋白的表达水平并计算 p-IRF3/IRF3 的相对比值;利用空斑试验检测病毒滴度水平.结果Western blot和RT-PCR结果表明,EV71 感染过程中USP26 的表达上调(P＜0.05);RD细胞转染后实验组EV71 中VP1 mRNA的表达水平明显低于同一时间的对照组(P＜0.05),感染 8h实验组中MDA5 蛋白和p-IRF3 蛋白的表达水平均显著高于对照组(P＜0.05);两组IRF3 总蛋白的表达水平差异无统计学意义;空斑试验中实验组EV71 的病毒滴度显著低于对照组(P＜0.05).结论 USP26 可通过负性调控RLR信号通路参与抗病毒免疫反应,敲减USP26 可抑制EV71 在细胞中的复制.

目的:比较聚肌胞苷酸 Poly(I:C)、地塞米松(DEX)对小鼠胸腺的影响和RLR 通路的改变,为研究病毒感染导致胸腺受损的机制,选择合适的动物模型提供实验依据.方法:将24只8周龄C57BL/6小鼠随机分组,分别给予Poly(I:C)、DEX及生理盐水.观察胸腺指数、胸腺组织学变化、外周血中T细胞受体重排删除环(TRECs)的含量以及初始型CD4+T细胞的比例,并检测胸腺组织RLR/MAVS/IFN-α/β通路的表达情况.结果:Poly(I:C)和DEX都可以导致胸腺萎缩和组织结构破坏,DEX组更严重且皮质区细胞减少更为明显.两组的TRECs均下降.Poly(I:C)组的初始型CD4+T细胞有增加趋势;而DEX组的CD4+T细胞初始/记忆亚群比例改变不明显.DEX组RIG-Ⅰ、MDA5、LGP2和IFN-α/β表达上调明显;而Poly(I:C)组虽略有上调、但无统计学意义.结论:两种造模方法均可诱导胸腺功能受损.DEX 诱导的胸腺损伤更严重且伴有RLR——Ⅰ型IFN通路的大幅上调;而在Poly(I:C)组该通路仅轻微上调.

目的 探究ZWINT (ZW10 interacting kinetochore protein)对TBK1 (TANK-binding kinase 1)或仙台病毒(Sendai virus,SeV)诱导的RLR (RIG-I like receptor)抗病毒先天免疫信号通路的影响.方法 应用免疫共沉淀的方法检测ZWINT与RLR信号通路分子TBK1、VISA、RIG-I之间的相互作用;用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳实验验证ZWINT对TBK1或SeV诱导的IRF3二聚化的作用;利用双荧光素酶报告基因实验检测TrBK1或SeV介导下ZWINT对干扰素启动子IFN-β的激活效果;通过实时荧光定量PCR实验检测ZWINT对SeV诱导的IFN-β转录的影响.结果 ZWINT与TBK1、VISA和RIG-I都有相互作用,过表达ZWINT增强了TBK1或SeV诱导的IRF3的二聚化水平以及IFN-β启动子的活性,此外,过表达ZWINT也加强了SeV诱导的IFN-β的转录.结论 ZWINT是RLR抗病毒先天免疫信号通路中的正调控因子.

目的 进一步探究VISA介导的抗病毒信号通路.方法 利用免疫共沉淀、免疫印迹、双荧光素报告、qPCR等实验技术检测FKBP8在RLRs信号通路中的作用.结果 我们的实验证实FKBP8与VISA、TRAF3都存在互作,且FKBP8显著地抑制RNA病毒早期诱导的干扰素启动子IFN-β和核调节因子-κB (nuclear factor kappa-B,NF-κB)的活性,并增强病毒的复制.进一步的研究表明FKBP8通过作用于VISA和TBK1而负调控RLR-VISA信号转导;此外,FKBP8通过干扰VISA-TRAF3的结合而负调节病毒诱导的信号通路.结论 FKBP8是RLR抗病毒先天免疫信号通路中的负调控因子.

目的:探讨中药复方湘艾一号方(HNA-1)对地塞米松诱导的胸腺萎缩、胸腺输出功能的保护作用及胸腺RLR信号通路表达的影响.方法:将C57BL/6小鼠,随机分为正常对照组、模型组、HNA-1低、中、高剂量治疗组,左旋咪唑组.观察各组小鼠胸腺形态改变,检测外周血中T细胞受体重排删除环(TRECs)的含量、CD4+T初始亚群细胞的比例,并检测胸腺组织RLR/MAVS/IFN-α/β通路的表达情况.结果:模型组小鼠胸腺严重萎缩,组织结构破坏明显,外周血TRECs下降;RIG-Ⅰ、MDA5、LGP2和IFN-α/β表达上调明显.与模型组比较,HNA-1治疗组小鼠胸腺指数改变不显著,但胸腺细胞数量增加,以中、低剂量组较为明显;外周血TRECs含量升高,尤以低剂量组差异明显(P＜0.05).且HNA-1可明显抑制胸腺RLR信号通路的表达,以中剂量组最为明显(P＜0.05).结论:HNA-1对地塞米松诱导的胸腺萎缩小鼠具有一定的治疗作用,以中、低剂量较为明显,其机制可能与调控RLR通路的表达情况相关.

RLR[retinoic acid-inducible gene Ⅰ(RIG-Ⅰ)-like Receptors]是一类表达在胞浆中的模式识别受体,在识别细胞质中经病毒复制产生的病毒RNA后,启动一系列信号级联反应,以诱导机体Ⅰ型干扰素及干扰素诱导的抗病毒基因的表达,最后达到清除机体病毒感染的目的.由于在病毒感染时机体干扰素反应必须迅速启动,当病毒清除后干扰素反应又需要立即恢复到正常本底水平,因此RLR激活的信号转导途径受到了严格的调控,其中就包括由E3泛素连接酶参与的泛素化修饰调控和由去泛素化酶参与的去泛素化修饰调控.自2003年成功鉴定出鱼类干扰素基因以来,鱼类也被发现具有保守的RLR信号转导途径诱导干扰素抗病毒免疫反应,该信号途径同样受到泛素化修饰的调控.文章总结了近年来泛素化修饰在哺乳类和鱼类RLR介导的抗病毒免疫应答通路中的调节机制.

目的 探讨基于维甲酸诱导基因Ⅰ样受体(RLR)信号通路的去泛素化酶对肠道病毒71型(EV71)感染的调控机制.方法 将人横纹肌肉瘤细胞A-204分为空白对照组、空载质粒组、去泛素化酶组,空白对照组不作任何处理,空载质粒组转染10 nmol/L空载质粒48 h后加入EV71(MOI=0.5),去泛素化酶组转染10 nmol/L去泛素化酶USP4过表达质粒48 h后加入EV71(MOI=0.5).采用RT-PCR检测各组细胞中EV71 mRNA表达,Western blot检测各组细胞USP4、维甲酸诱导基因Ⅰ(RIG-Ⅰ)、黑色素瘤分化相关基因5(MDA5)、LGP2蛋白表达.结果 空载质粒组细胞USP4蛋白表达明显低于空白对照组(P＜0.05),去泛素化酶组细胞USP4蛋白表达明显高于空载质粒组和空白对照组(P＜0.05).空载质粒组和去泛素化酶组细胞EV71 mRNA表达明显高于空白对照组(P＜0.05),去泛素化酶组细胞EV71 mRNA表达明显低于空载质粒组(P＜0.05).空载质粒组细胞RIGⅠ、MDA5、LGP 2蛋白表达明显低于空白对照组(P＜0.05),去泛素化酶组细胞RIG-Ⅰ、MDA5、LGP-2蛋白表达明显高于空载质粒组和空白对照组(P＜0.05).结论 去泛素化酶USP4可能通过激活RLR信号通路而发挥抗EV71感染作用.

目的 探究 DUT(deoxyuridine triphosphate nucleotidohydrolase,dUTPase)对 RIG-Ⅰ(retinoic acid-inducible gene Ⅰ)介导的RLR(RIG-Ⅰ-like receptors)抗病毒先天免疫的研究.方法 采用免疫共沉淀的方法检测DUT与RIG-Ⅰ之间的相互作用以及DUT对RIG-Ⅰ介导的泛素化修饰的影响;应用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳实验验证DUT对RIG-Ⅰ或仙台病毒(Sendai virus,SeV)诱导的IRF3二聚化的作用;利用双荧光素酶报告基因实验检测RIG-Ⅰ或SeV介导的DUT对干扰素启动子IFN-β的激活效果;通过实时荧光定量PCR实验检测DUT对SeV诱导的IFN-β转录的影响.结果 DUT与RIG-Ⅰ相互作用,过表达DUT促进RIG-Ⅰ或SeV诱导的IRF3的二聚化水平以及IFN-β启动子的活性.此外,过表达DUT也加强了SeV诱导的IFN-β启动子的转录水平,研究结果还表明DUT促进RIG-Ⅰ泛素化修饰及RIG-ⅠK63泛素化修饰,并且通过与RIG-Ⅰ之间的相互作用增强RNF135、MEX3C、TRIM4介导的RIG-Ⅰ K63泛素化修饰.结论 DUT是RIG-Ⅰ介导的针对RNA病毒天然免疫应答的正调节因子.