目的:探讨类甲基转移酶3（METTL3）通过促进叉头框蛋白O（FOXO）3的N6-甲基腺苷修饰（m6A）及其表达参与糖尿病诱导的内皮细胞凋亡的机制。方法:构建晚期糖基化终末产物（AGE）诱导的人主动脉内皮细胞（HAEC）损伤模型，将HAEC分为6组：细胞对照组、细胞AGE组、细胞对照+阴性对照小干扰RNA（siRNA）组、细胞AGE+阴性对照siRNA组、细胞AGE+ FOXO3 siRNA组、细胞AGE+ METTL3 siRNA组，每组设置3个平行组。采用甲基化RNA免疫沉淀测序（MeRIP-Seq）及生物信息学技术检测并分析其m6A修饰谱，采用RNA结合蛋白免疫沉淀（RIP）检测 FOXO3 mRNA的m6A修饰水平，采用流式细胞术检测细胞凋亡，采用实时荧光定量PCR（RT-PCR）检测 FOXO3 mRNA表达水平，Western blotting法检测FOXO3和METTL3蛋白水平。6只6周龄载脂蛋白E基因敲除雄性小鼠按随机数字表法分为单纯动脉粥样硬化组和糖尿病动脉粥样硬化组，每组均为3只。通过Western blotting检测小鼠FOXO3、METTL3蛋白表达，采用免疫荧光共定位检测小鼠FOXO3、METTL3在内皮细胞中的表达。采用两独立样本 t检验进行组间比较。 结果:与细胞对照组相比，细胞AGE组的总m6A修饰及FOXO3的m6A修饰显著升高（ P<0.001），FOXO3和METTL3的蛋白表达显著升高（ P<0.05）。与单纯动脉粥样硬化组相比，糖尿病动脉粥样硬化组小鼠主动脉斑块区域内皮细胞的FOXO3和METTL3的蛋白表达显著升高（ P<0.05）。与细胞AGE+阴性对照siRNA组相比，细胞AGE+ FOXO3 siRNA组的凋亡显著降低（ P<0.01）。与细胞AGE+阴性对照siRNA组相比，细胞AGE+ METTL3 siRNA组FOXO3的m6A修饰（ P<0.001）及FOXO3蛋白表达均显著下降（ P<0.05），且凋亡显著降低（ P<0.001）。 结论:AGE诱导的HAEC中m6A修饰发生了显著变化，METTL3通过促进 FOXO3 mRNA的m6A修饰并调控其表达，从而参与糖尿病诱导的血管内皮细胞凋亡。

目的:探讨重组人甲基CpG结合蛋白2(MeCP2)处理的视网膜色素上皮(RPE)细胞中mRNA和N6-甲基腺嘌呤(m6A)改变及其机制。方法:将传代ARPE-19细胞贴壁培养后分为正常对照组和MeCP2组，正常对照组细胞采用正常培养液培养，MeCP2组细胞于含终质量浓度20 ng/ml重组人MeCP2蛋白培养液中，连续培养72 h。提取细胞内总RNA进行转录组测序(RNA-seq)和甲基化免疫共沉淀测序(MeRIP-seq)分析。采用edgeR软件包根据 P<0.05筛选差异表达基因(DEGs)和差异甲基化基因(DMGs)。采用基因本体论(GO)富集分析对差异基因进行生物学功能描述，采用京都基因和基因组百科全书(KEGG)进行通路富集分析。筛选出DEGs与DMGs交集的基因，采用实时荧光定量PCR技术检测各组差异基因mRNA表达水平。 结果:共筛选出DEGs 100个，DMGs 7 441个，富集分析发现DEGs与细胞外基质(ECM)－受体相互作用、细胞分裂、细胞周期和磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信号通路等相关，DMGs与微管细胞骨架、血管生成、表皮生长因子受体(ErbB)信号通路、晚期糖基化终末产物(AGEs)－糖基化终末产物受体(RAGE)信号通路、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路、Notch信号通路和转化生长因子β(TGF-β)信号通路等相关。DEGs中24个基因表达增加，76个基因表达减少；DMGs中5个基因含有高甲基化峰，7 439个基因含有低甲基化峰，注释峰后，正常对照组有7 626个基因发生m6A甲基化，MeCP2组有8 006个基因发生m6A甲基化，2个组间有7 360个交集基因。正常对照组和MeCP2组的m6A甲基化富集于转录本的CDS、内含子和3'-非翻译区(3'UTR)区域，其甲基化比例分别为23.62%/22.27%、48.53%/48.35%和23.66%/25.28%。联合分析发现2个上皮－间充质转化(EMT)相关基因 CSPG5和 RBP1的mRNA和m6A水平均降低。荧光定量PCR结果显示，MeCP2组 GSPG5、 RBP1、 ZNF484 mRNA相对表达量均明显低于正常对照组，差异均有统计学意义( t＝7.885、7.613、7.345，均 P<0.01)。 结论:RPE细胞中MeCP2对EMT的调控机制与m6A甲基化修饰相关。 CSPG5和 RBP1基因可能是m6A甲基化的靶基因，参与MeCP2调控的EMT过程。

目的:探讨SIRT7在胰腺癌细胞上皮-间充质转化（EMT）中的作用和机制。方法:使用siRNA或质粒转染将胰腺癌细胞分为siControl组、siSIRT7组、过表达SIRT7组、siSIRT7+siCOL4A1组和siSIRT7+siSLUG组。EdU实验、细胞划痕实验和Transwell实验分别检测细胞的增殖、迁移和侵袭能力，实时荧光聚合酶链反应（qRT-PCR）和Western blot法检测EMT标志物和肿瘤干细胞标志物的表达水平。对敲低SIRT7的胰腺癌细胞进行转录组测序（RNA-seq），探究SIRT7调控的信号通路和靶基因，采用qRT-PCR验证靶基因的转录水平。定量染色质免疫共沉淀实验（q-ChIP）和染色质免疫共沉淀聚合酶链反应（ChIP-PCR）鉴定SIRT7直接调控的靶基因。免疫组织化学法检测人胰腺癌组织（2013—2016年购自武汉塞维尔生物科技有限公司）中SIRT7及靶基因的表达。癌症基因组图谱（TCGA）数据库数据分析SIRT7及其靶基因的表达相关性。KM-Plotter网站用以分析SIRT7和靶基因在胰腺癌中的生存相关性。GeneMANIA、STRING和ENCORI在线工具用以分析SIRT7相关蛋白及miRNAs等。结果:EdU实验结果显示，过表达SIRT7组PANC-1和BxPC-3细胞增殖率分别为（19.33±0.35）%和（17.00±1.89）%，均低于对照组［分别为（31.60±1.37）%和（24.33±0.78）%，均 P＜0.05］；而敲低SIRT7表达组PANC-1和BxPC-3细胞增殖率［分别为（23.94±1.00）%、（27.08±0.97）%］和［（22.00±1.86）%、（25.96±1.61）%］均高于siControl组［分别为（11.80±1.86）%和（13.42±1.39）%，均 P＜0.05］。在PANC-1细胞中，细胞划痕实验结果表明，过表达SIRT7组细胞相对迁移率为（76.67±2.74）%，低于对照组细胞［（100.00±2.13）%， P＜0.05］；而抑制SIRT7表达后细胞相对迁移率［分别为（134.22±4.08）%和（199.82±9.20）%］均高于siControl组细胞［（102.24±3.13）%，均 P＜0.05］。迁移实验中（BxPC-3细胞），过表达SIRT7组细胞迁移数为（28.33±2.62）个，低于于对照组［（45.66±1.69）个， P?0.05］；敲低SIRT7表达组细胞迁移数［分别为（65.66±2.86）个、（82.00±2.94）个］均高于siControl组细胞［（33.00±0.81）个， P＜0.01］。Transwell实验结果表明，过表达SIRT7组细胞侵袭数为（16.33±2.05）个和（34.66±1.69）个，低于对照组［分别为（54.33±4.64）个和（58.66±5.90）个，均 P＜0.05］；而敲低SIRT7表达组细胞侵袭数［分别为（63.66±2.49）个、（69.33±3.29）个和（134.33±3.09）个、（181.66±4.02）个］均高于siControl组细胞［（35.33±2.49）个和（42.00±0.81）个，均 P＜0.05］。qRT-PCR和Western blot结果显示，敲低SIRT7表达后，细胞上皮标志物表达降低，间充质标志物表达增多，肿瘤干细胞标志物增多。RNA-seq分析显示，SIRT7参与调控多种恶性肿瘤相关信号通路，其中包括胰腺癌通路和EMT通路。q-ChIP和ChIP-PCR结果显示，SIRT7可直接结合到靶基因COL4A1和SLUG等的启动子区域；EdU、Transwell和Western blot实验也证明SIRT7与靶基因COL4A1和SLUG在胰腺癌细胞中的功能呈负性相关。免疫组化结果显示，SIRT7在胰腺癌组织中表达下调，COL4A1、SLUG、SOX2在胰腺癌组织中表达上调。GeneMANIA、STRING和ENCORI在线网站分析结果显示，有众多潜在的SIRT7相互作用蛋白和相关miRNA。 结论:在胰腺癌中，SIRT7可以通过抑制COL4A1和SLUG等靶基因的转录，从而抑制胰腺癌细胞的EMT，胰腺癌中SIRT7是一个潜在的肿瘤抑制基因。

目的:探讨CRL4B复合物在胰腺癌发生发展中的作用及其分子机制。方法:将胰腺癌细胞分为对照组(转染阴性对照慢病毒)、shCUL4B组(转染CUL4B慢病毒)、shDDB1组[转染DNA损伤结合蛋白1(DDB1)慢病毒]和shCUL4B+siSFRP1组[转染CUL4B慢病毒+分泌型卷曲相关蛋白1(SFRP1)-siRNA]。对敲低CUL4B和DDB1的胰腺癌细胞系进行RNA测序(RNA-seq)，寻找CRL4B复合物调控的靶基因，采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测靶基因mRNA的表达，染色质免疫共沉淀(ChIP)-PCR实验鉴定CRL4B复合物直接调控的靶基因，Western blot法检测上皮-间充质转化(EMT)标志物蛋白的表达水平，EdU细胞增殖实验检测细胞增殖能力，划痕实验和Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力。采用GEO、TCGA和GTEx数据库中胰腺癌相关肿瘤样本和正常组织样本的测序数据，分析CUL4B、DDB1和其下游靶基因的表达相关性。结果:RNA-seq结果显示，CRL4B复合物调控的靶基因涉及多种恶性肿瘤相关信号通路。qRT-PCR检测结果显示，shCUL4B和shDDB1组待验证靶基因的mRNA表达水平均高于对照组，差异有统计学意义(均 P<0.05)。ChIP-PCR实验结果显示，CRL4B复合物直接结合在NME1和SFRP1靶基因启动子区，敲低CUL4B的表达后，靶基因启动子区域组蛋白H2A第119位赖氨酸单泛素化富集减少。对照组PANC-1细胞增殖率为(32.10±3.58)%，高于shCUL4B组和shCUL4B+siSFRP1组[分别为(13.95±1.66)%和(22.38±0.77)%，均 P<0.05]；对照组AsPC-1细胞增殖率为(35.47±7.80)%，高于shCUL4B组和shCUL4B+siSFRP1组[分别为(19.60±3.58)%和(30.09±0.81)%，均 P<0.05]。细胞划痕实验显示，对照组PANC-1细胞迁移率为(53.18±3.70)%，高于shCUL4B组和shCUL4B+siSFRP1组[分别为(17.46±2.62)%和(44.99±9.18)%，均 P<0.05]。Western blot结果显示，对照组细胞上皮标志物α-catenin和γ-catenin的表达分别为1.00±0.03和1.01±0.11)，低于shCUL4B组(分别为1.44±0.01和1.21±0.06，均 P<0.05)，对照组细胞间充质标志物Fibronectin和Vimentin表达水平分别为1.01±0.14和1.02±0.18，高于shCUL4B+siSFRP1组(分别为1.53±0.13和1.22±0.07，均 P<0.05)。对照组细胞的迁移率为(100.00±3.96)%，与shCUL4B组和shCUL4B+siSFRP1组[分别为(35.49±0.34)%和(107.06±2.77)%]比较，差异均有统计学意义(均 P<0.05)。CUL4B和DDB1在胰腺癌中表达升高，且与SFRP1的表达呈负相关( r分别为-0.342和-0.264)。 结论:胰腺癌中CRL4B复合物转录抑制靶基因SFRP1进而促进胰腺癌的发生发展，且CRL4B复合物在胰腺癌中的高表达支持了其作为胰腺癌治疗的潜在靶点。

目的:采用多组学方法探究多嘧啶束结合蛋白1（PTBP1）在肾透明细胞癌中的作用以及机制。方法:通过慢病毒载体导入CRISPR-Cas9方法构建PTBP1条件性敲除的人肾透明细胞癌细胞（786-O-PTBP1 KO），该细胞系购自中国典型培养物保藏中心。细胞计数试剂盒（CCK-8），迁移和侵袭实验（Transwell）评估PTBP1敲除对于肾透明细胞癌增殖、迁移和侵袭能力的影响。对照组786-O细胞（786-O-WT）和PTBP1条件性敲除786-O细胞（786-O-PTBP1 KO）分别进行全长转录组测序（RNA-Seq）和液相色谱-质谱联用分析（LC-MS/MS），检测肾透明细胞癌细胞在敲除PTBP1后出现的差异表达基因、转录本与蛋白；交联免疫共沉淀结合高通量测序（CLIP-Seq）检测剪切因子PTBP1在肾透明细胞癌中发挥作用的结合靶点RNA。通过Human Protein Atlas和Gene card数据库分析6个靶点的临床相关性。统计分析组间比较采用独立样本 t检验。 结果:KO组迁移细胞计数明显低于WT组（116比182， t＝14.73， P<0.01）；KO组侵袭细胞计数低于WT组（199比179， t＝4.34， P<0.01）；KO组细胞增殖倍数在24、48、72、96时均低于WT组细胞（0.438比0.493， t＝2.78， P<0.05；0.831比1.070， t＝10.86， P<0.01；1.354比1.804， t＝20.15， P<0.01；2.127比2.280， t＝8.91， P<0.01），差异有统计学意义。1 876个RNA-Seq差异基因与132个质谱分析差异基因的交集基因为78个，从中筛选出在352个CLIP-Seq结合峰中有显著结合的6个靶点基因RNA；临床数据库提示6个靶标中，N-乙基马来酰亚胺敏感因子（NSF）是PTBP1发挥促癌作用的目标靶点。 结论:PTBP1明显促进肾透明细胞癌的增殖、迁移和侵袭，其机制可能与下游靶点之一的NSF及可溶性NSF附着蛋白受体（SNARE）介导的囊泡运输与自噬有关。

目的 探讨剪接型X盒结合蛋白 1(XBP1s)对小鼠肾小管上皮细胞缺氧/复氧(H/R)损伤的影响及其作用机制.方法 将小鼠肾小管上皮细胞分为腺病毒阴性对照组(Ad-shNC组)、靶向沉默XBP1s腺病毒组(Ad-shXBP1s组)、Ad-shNC+H/R组、Ad-shXBP1s+H/R组.检测各组细胞凋亡水平、线粒体活性氧活性、线粒体膜电位及线粒体钙离子水平.使用染色质免疫共沉淀测序(ChIP-seq)分析XBP1s调控肌醇 1,4,5-三磷酸受体(ITPR)家族的结合位点.检测各组XBP1s和ITPR家族信使RNA(mRNA)和蛋白表达水平.结果 与Ad-shNC组比较,Ad-shNC+H/R组细胞凋亡水平更高,线粒体活性氧水平升高,线粒体膜电位降低,线粒体钙离子水平升高;与Ad-shNC+H/R组比较,Ad-shXBP1s+H/R组细胞凋亡水平较低,线粒体活性氧水平下降,线粒体膜电位升高,线粒体钙离子水平降低(均为 P<0.05).与 Ad-shNC组比较,Ad-shXBP1s组 XBP1s、ITPR1、ITPR2和ITPR3 mRNA和蛋白相对表达量降低(均为P<0.05).与Ad-shNC组相比,Ad-shNC+H/R组XBP1s、ITPR1、ITPR2和ITPR3蛋白相对表达量升高;与Ad-shNC+H/R组相比,Ad-shXBP1s+H/R组XBP1s、ITPR1、ITPR2和ITPR3蛋白相对表达量下降(均为P<0.05).ChIP-seq结果显示,XBP1s能够结合ITPR1的启动子和外显子、ITPR2外显子和ITPR3外显子.结论 XBP1s可能通过直接调控ITPR转录和翻译而影响线粒体相关的内质网膜结构功能,下调XBP1s能够抑制ITPR表达,改善线粒体损伤.

目的 利用RNA免疫沉淀技术和深度测序方法寻找人骨肉瘤细胞U2OS中与DNA依赖蛋白激酶催化亚单位(DNA-PKcs)蛋白结合的RNA,进一步研究特定RNA的功能.方法 提取对照组及8 Gy剂量照射组的U2OS细胞核蛋白,选择DNA-PKcs蛋白进行免疫沉淀,将复合体中RNA分离纯化并进行鉴定,行高通量测序分析.通过生物信息学分析得到与DNA-PKcs蛋白结合的所有RNA种类和染色体分布,KEGG和GO分析得到RNA的功能分类.最后选取特定RNA分子,利用qRT-PCR方法分别对U2OS细胞总RNA及RIP提取的RNA进行表达验证.结果 U2OS细胞经8 Gy照射后DNA-PKcs蛋白结合的RNA与对照组相比,与细胞黏附相关的基因:整合素α3(integrinα3,ITGA3)、α5(ITGA5)和αV(ITGAV),以及白细胞分化抗原分化簇44(cluster of differentiation44,CD44)和多配体聚糖4(syndecan 4,SDC4)均有更强的富集.结论 成功获得了与U2OS细胞DNA-PKcs蛋白结合的RNA高通量测序库;通过测序寻找到了DNA-PKcs蛋白结合的特定RNA分子,为下一步研究其功能奠定了基础.

目的 探讨核内不均一核糖核蛋白(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein,HnRNPL)在肾母细胞瘤中的表达及其与肿瘤细胞增殖、凋亡的关系.方法 对3例肾母细胞瘤组织进行全转录组测序了解肿瘤差异表达基因,对差异基因进行GO分析和KEGG分析,并用qPCR检测验证HnRNPL在肾母细胞瘤中的表达情况.采用siRNA干扰肿瘤细胞HnRNPL的表达,设置转染组(转染siRNA)、空白组(不转染siRNA)及阴性对照组(转染NC-siRNA),用qPCR及Western Blot检测干扰后HnRNPL、P53和BCL2基因及蛋白的表达情况,用MTT法和流式细胞术检测干扰后肿瘤细胞的增殖及凋亡情况.采用RNA免疫共沉淀检测HnRNPL蛋白与P53 mRNA的相互作用关系.结果 全转录组测序显示肾母细胞瘤组织中有748个基因差异表达.通过GO功能显著性富集分析发现:差异基因参与的生物进程主要是生化活动调节、细胞增殖、系统分化、RNA多聚酶Ⅱ转录调节等.通过KEGG显著性富集分析发现:差异基因参与的与肿瘤进程相关的信号通路主要是白细胞跨内皮迁移信号通路、p53信号通路、肿瘤转录调控异常等.qPCR检测证实HnRNPL在肾母细胞瘤组织中表达上调,与芯片测序结果一致.HnRNPL-siRNA干扰肿瘤细胞后,qPCR检测显示转染siRNA组的HnRNPL、p53和Bcl2mRNA相对表达量分别为0.348 5±0.019 7、0.248 5±0.035 5和0.372 2±0.014 2,阴性对照组分别为1.143 1±0.071 6、0.976 1±0.118 6和0.9060±0.032 3,空白对照组分别为1.1980±0.126 3、1.008 3±0.112 3和1.013 1±0.106 7,转染组与阴性对照组和空白对照组的组间差异有统计学意义(P＜0.05及P＜0.01).Western Blot检测显示siRNA转染组中HnRNPL、p53和Bcl2蛋白相对表达量分别为0.131 5±0.005 7、0.466 2±0.043 3和0.185 1±0.0231,阴性对照组分别为0.370 2±0.006 2、0.744 4±0.0206和0.8463±0.0020,空白对照组分别为0.399 9±0.0234、0.819 3±0.0201和0.993 5±0.058 7,转染组与阴性对照组及空白对照组比较,差异有统计学意义(P均＜0.05).MTT法检测显示siRNA转染组肿瘤细胞的生长曲线24、48和72 h的吸光度分别为0.457 5±0.061 2、0.552 7±0.033 2和0.662 5±0.005 7,阴性对照组分别为0.653 3±0.011 2、0.797 4±0.002 1和0.901 1±0.014 7,空白对照组分别为0.687 9±0.013 2、0.813 4±0.0231和0.913 1±0.071 2,转染组各个时间段与阴性对照组和空白对照组之间差异均有统计学意义(P均＜0.05).流式细胞术检测结果显示,siRNA转染组肿瘤细胞凋亡率为(37.57±2.30)％,远高于空白对照组(2.01±0.33)％及阴性对照组(3.46±0.41)％,组间比较,差异有统计学意义(P＜0.05).RIP检测显示,HnRNPL蛋白能与p53 mRNA相互作用.结论 HnRNPL可能通过与p53 mRNA特异性的结合调控P53的表达,并通过p53相关信号通路参与了肿瘤细胞的增殖与抗凋亡过程.

目的 应用RIP-Seq测序技术检测小鼠MCAO/R模型中心肌素相关转录因子A(MRTF-A)结合RNA的表达差异,探讨MRTF-A潜在的作用机制.方法 将C57BL/6小鼠随机分成假手术组及I/R组,线栓法构建MCAO模型,再灌注24 h后,提取脑组织总蛋白,利用MRTF-A抗体免疫共沉淀后,进行RNA高通量测序,获得MRTF-A结合RNA的表达谱,继而对差异RNA进行GO、KEGG分析.结果 与假手术组相比,I/R组有429个RNA发生差异表达(上调203,下调226),并且在功能元件和染色体分布上均具有显著差异.GO分子功能分析显示,差异表达RNA主要富集RNA结合、Poly(A)RNA结合等注释.KEGG通路分析显示10条通路被显著富集,其中雌激素信号通路富集最显著.结论 在脑I/R损伤时MRTF-A结合RNA表达谱发生差异改变,为深入探讨MRTF-A的分子机制提供理论依据.

目的 本研究探讨肾脏纤维化过程中RNA m6A水平的变化,为深入探讨和研究RNA m6A在肾脏纤维化中的变化及作用机制提供实验基础和理论依据.方法 采用C57BL/6小鼠单侧输尿管结扎方法建立肾脏纤维化小鼠模型(unilateral ureteral obstruction,UUO).随机分为假手术(Sham)组和UUO组.首先运用质谱法检测两组肾脏RNA m6A含量变化,进一步运用RNA甲基化免疫共沉淀(methylated RNA Immunoprecipitation,MeRIP)测序方法检测两组肾脏RNA m6A具体修饰位点的变化情况.在明确纤维化肾脏存在RNA m6A异常修饰后,我们通过RT-PCR方法,进一步筛选肾脏RNA m6A相关的调控酶.结果 与Sham组相比,UUO组肾脏RNA m6A含量显著升高.MeRIP测序分析发现甲基化水平差异>1.5倍的位点共1352个,其中上调位点906个,下调位点446个,包括细胞连接、炎症反应、转分化、钙离子结合、细胞黏附等相关的基因.RT-PCR筛选结果提示甲基转移酶样蛋白(methyltransferase-like protein,METTL)14可能为关键调控酶.结论 RNA m6A表观遗传调控参与肾脏纤维化发生,METTL14可能是关键调控酶.