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实时荧光逆转录重组酶介导的等温扩增技术检测寨卡病毒方法的建立
编辑人员丨5天前
目的:建立一种实时荧光逆转录重组酶介导的等温扩增(reverse transcription recombinase-aided amplification,RT-RAA)技术检测寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)的方法,以实现ZIKV的现场快速筛查及诊断。方法:通过基因组序列比对,选择ZIKV保守序列设计RT-RAA特异性引物和探针,并用系列稀释的ZIKV重组质粒与毒株核酸验证方法的灵敏性与重复性,通过检测登革病毒、基孔肯雅病毒、西尼罗病毒等其他虫媒病毒验证方法的特异性。结果:建立的RT-RAA方法可在39 ℃恒温条件下30 min内对ZIKV进行高效扩增,检测系列稀释的ZIKV重组质粒,其95%检测限可达到15拷贝/反应,特异性强,与登革病毒、基孔肯雅病毒、西尼罗病毒虫媒病毒无交叉反应,且重复性好。结论:本研究建立的ZIKV的RT-RAA等温扩增方法,具有反应迅速,无需精密仪器,操作简单等优点,适合于应急快速检测。
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编辑人员丨5天前
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重组酶介导的等温扩增技术结合CRISPR-Cas13a蛋白检测8种境外输入性病毒
编辑人员丨5天前
目的:基于重组酶介导的扩增技术(recombinase aided amplification,RAA)和CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas13a(CRISPR-associated protein 13a)检测,建立一种快速、灵敏且特异的重要境外输入性病毒检测方法。方法:以流行性乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)、黄热病毒(Yellow fever virus,YEV)、西尼罗病毒(West Nile virus,WNV)、中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV)、埃博拉病毒(Ebola virus,EBOV)、登革病毒(Dengue virus,DENV)、裂谷热病毒(Rift Valley fever virus,RVFV)、寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)为检测对象,设计特异性RAA扩增引物和CRISPR RNA(crRNA),建立RAA扩增结合CRISPR-Cas13a蛋白检测反应,评价方法的灵敏度和特异性,使用登革热疑似临床样本进行检测,并与荧光RT-PCR技术进行比较,同时检测其余7种病毒临床模拟样本。结果:RAA扩增结合CRISPR-Cas13a蛋白检测方法能在39 ℃条件下,40~52 min内检测出8种输入性传染病病原体,灵敏度达到1~10拷贝/μl,并且这8种病原体之间无交叉反应,临床样本均可100%检测出。结论:建立的RAA扩增结合CRISPR-Cas13a蛋白检测方法能够灵敏、特异且快速地检测出8种境外输入性传染病病原体。
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编辑人员丨5天前
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SARS-CoV-2棘突蛋白H146Y突变的逆转录重组酶介导的等温扩增方法建立
编辑人员丨5天前
目的:基于逆转录重组酶介导的恒温扩增(reverse transcriptional recombinase aided amplification,RT-RAA)技术,建立一种快速,灵敏,简便的SARS-CoV-2棘突蛋白(S)H146Y突变检测方法。方法:针对SARS-CoV-2棘突蛋白H146Y突变区域设计RT-RAA特异性引物和荧光探针,使用优化的RT-RAA方法进行恒温扩增检测,评价方法的灵敏度和特异性,并与二代测序技术进行比较。结果:基于荧光信号的RT-RAA方法能在39 ℃,30 min完成检测,SARS-CoV-2 S蛋白H146(S-H146)野生株和Y146(S-Y146)突变株检测限均为10 copies/μL,能够依据荧光值明显区分S-H146毒株与S-Y146毒株的重组质粒或临床样本,且和五种常见呼吸道感染病毒无交叉反应,与二代测序技术方法一致性高。结论:建立的RT-RAA荧光检测方法具有灵敏度高,特异性强,适用于SARS-CoV-2 S蛋白H146Y突变株的快速检测,为基层医疗机构提供了新的鉴定方法。
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编辑人员丨5天前
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基于CRISPR/Cas12a系统的人副流感病毒1-4型核酸等温检测方法的建立
编辑人员丨5天前
目的:建立一种基于反转录重组酶介导的等温扩增(reverse transcription recombinase-aid amplification, RT-RAA)联合CRISPR/Cas12a反应的人副流感病毒(human parainfluenza virus, HPIV)核酸检测方法。方法:根据HPIV核衣壳蛋白(nucleocapsid protein, N)基因保守区序列,设计RT-RAA所需型特异性引物及crRNA(CRISPR RNA, crRNA),应用Cas12a切割荧光标记探针产生的荧光强度筛选高敏感性HPIV1-4型特异性crRNA并优化crRNA、Cas12a和探针浓度。利用体外转录RNA及临床样本,评价RT-RAA联合CRISPR/Cas12a检测方法的检测下限及特异性。结果:从设计的crRNA中筛选出高敏感性的HPIV1-4型特异性crRNA,并建立基于荧光强度测量的RT-RAA联合CRISPR/Cas12a的HPIV核酸检测方法,该方法对各型HPIV的检测下限均可达到10拷贝/反应。采用该方法检测8种其他呼吸道病毒感染的临床样本,均未显示有交叉反应。结论:建立的HPIV 1-4型荧光法CRISPR核酸检测方法快速、特异,且可无需专业核酸检测设备。
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编辑人员丨5天前
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人偏肺病毒的逆转录重组酶介导等温扩增荧光检测方法的建立
编辑人员丨2023/10/28
目的 建立一种基于逆转录重组酶介导的等温扩增(reverse transcription recombinase-aided isothermal amplifi-cation,RT-RAA)方法的人偏肺病毒快速分子诊断技术,并对其检测效果进行初步分析.方法 从NCBI数据库中下载人偏病毒基因组序列,利用Mega软件比对分析基因组序列,确定高度保守序列作为分子检测靶标.以人偏肺病毒N蛋白基因保守序列作为靶序列,设计引物和荧光探针.并以宁波地区人偏肺病毒基因组RNA为模板,利用实时荧光定量PCR对荧光RT-RAA检测体系进行评价.以构建含有N蛋白基因序列的不同浓度重组质粒为模板进行RT-RAA荧光扩增,分析其检测灵敏性;利用建立的RT-RAA荧光法分析检测人偏肺病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒和博卡病毒基因组,评价其检测特异性.结果 成功建立了人偏肺病毒RT-RAA扩增荧光检测方法,可在30 min内完成偏肺病毒的特异性扩增检测.以重组质粒为检测模板,RT-RAA荧光检测法的最低检出限为102拷贝/μL重组质粒,且均在15 min内出现阳性特异性扩增.与实时荧光定量PCR检测一致性达98.6%,且与其他3种病毒无交叉反应特性.结论 成功建立了一种基于RT-RAA扩增的人偏肺病毒荧光检测方法,该方法灵敏度高、特异性好,在人偏病毒快速现场检测中具有潜在应用价值.
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编辑人员丨2023/10/28
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中东呼吸综合征冠状病毒重组酶介导核酸检测方法的建立
编辑人员丨2023/8/6
目的 建立快速、敏感、特异的逆转录重组酶介导(Reverse-transcription recombinase-aid assay,RT-RAA)核酸检测方法,用于中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)的检测.方法 根据MERS-CoV基因的保守序列设计并合成特异性RAA引物及探针.通过条件优化,以10倍系列稀释经第3代慢病毒载体构建的假病毒颗粒阳性标准品为模板,进行RT-RAA扩增,并进行特异性、敏感性以及临床样本检测.结果 建立的RT-RAA方法检测MERS-CoV假病毒颗粒阳性标准品的灵敏度为10拷贝/ml,高于实时荧光RT-PCR方法(102拷贝/ml);用该方法检测MERS-CoV假病毒颗粒有明显扩增,而甲型H1N1流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒等4种呼吸道病毒的检测均为阴性;检测我国首例输入性MERS病例的临床样本及1例英国QCMD协会的室间质评阳性灭活样本均能检出,与实际结果相符.检测时间(20 min)大大低于实时荧光RT-PCR (90 min).结论 建立的MERS-CoV RT-RAA检测方法灵敏、特异、快速,可用于MERS-CoV感染的现场快速检测和流行病学调查.
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编辑人员丨2023/8/6
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中东呼吸综合征冠状病毒RT-RAA快速检测方法的建立及应用
编辑人员丨2023/8/6
建立基于重组酶介导的中东呼吸综合征冠状病毒(MERSCoV)核酸检测方法.本研究设计、合成特异性中东呼吸综合征冠状病毒基因的重组酶介导检测(RAA)引物及探针,制备MERS-CoV假病毒颗粒阳性对照品,通过一系列条件优化建立了MERS-CoV的快速、灵敏、特异的RT-RAA检测方法,分别与荧光定量RT-PCR检测方法做比较,并且采用首例中国MERS-CoV韩国地区输入病例的咽拭子样品、其它类似呼吸道病毒样本以及英国QC-MD的MERS-CoV室间质评灭活样本做临床验证.结果显示:建立的RT-RAA方法检测中东呼吸综合征冠状病毒灵敏度为10拷贝,高于本实验室建立的荧光RT-PCR方法灵敏度(100拷贝),且检测时间(4.8~13.6min)大大低于荧光RT-PCR检测时间(90min);用该方法检测中东呼吸综合征冠状假病毒颗粒为阳性,而检测其他8种对照呼吸道病毒均呈阴性;检测临床阳性样本也与实际结果相符.本研究建立的中东呼吸综合征冠状病毒RT-RAA检测方法灵敏、特异、快速,可用于中东呼吸综合征冠状病毒感染的现场快速诊断和流行病学调查.
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编辑人员丨2023/8/6
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甲型流感病毒的逆转录重组酶介导核酸扩增快速检测方法研究
编辑人员丨2023/8/6
目的 利用逆转录重组酶介导核酸扩增技术(RT-RAA)建立检测甲型流感病毒的快速方法.方法 通过使用逆转录酶,将甲流病毒RNA逆转录为cDNA,根据NCBI基因库中甲型流感病毒保守序列设计引物及探针,用cDNA作模板,进行RT-RAA检测甲型流感病毒;构建携带甲型流感病毒的质粒,检测已知样本,分析该方法的灵敏度和特异性.结果 采用甲型流感病毒通用型引物和探针,能有效扩增出相应病毒的核酸,而对其他非甲流病毒无交叉反应;RT-RAA反应过程均在39℃恒温条件下完成,用时30min即可得到扩增结果,反应体系中最低扩增拷贝数为100 copies.结论 建立的RT-RAA检测甲型流感病毒方法灵敏度和特异性高,反应快速、操作简单,适用于甲型流感病毒通用型的快速检测.
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编辑人员丨2023/8/6
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逆转录重组酶介导扩增技术快速检测基孔肯雅热病毒
编辑人员丨2023/8/6
本研究通过使用逆转录酶,将基孔肯雅热病毒RNA首先逆转录为cDNA.选取基孔肯雅热病毒保守序列设计引物及探针,建立基孔肯雅热病毒重组酶介导一步法等温核酸扩增RT-RAA (Reverse transcription recombinase aided amplification, RT-RAA) 快速检测法,并分析其灵敏度及特异性.结果显示,该方法整个过程在39 ℃进行,检测时间短 ( <20 min),检测下限可达100 copy,并与黄热病毒、日本乙型脑炎病毒、西尼罗病毒、登革病毒I型等蚊媒病毒不存在交叉反应.本文建立的基孔肯雅热病毒RT-RAA检测法,灵敏度高、特异性强、操作简便,适应于口岸基层基孔肯雅热病毒的快速检测.
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编辑人员丨2023/8/6
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病毒学实验室资质认定中非标方法的确认研究
编辑人员丨2023/8/6
中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所的各实验室自行研究建立了一系列实验方法,这些方法相比国标方法,行标方法等具有独特的优势,如何让这些方法通过一定法律程序成为公共产品,以便更广泛的为疾病预防控制服务,是作为国家级病毒学实验室义不容辞的任务.本文通过对“RT-RAA法检测EV71/ CA16等病毒”方法的实证研究,探索基于实验室资质认定条件下病毒学非标方法建立、确认、验证、核查等一系列问题.
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编辑人员丨2023/8/6
