目的:构建预测D2 +根治性胃腺癌切除术后病变组织检测Rictor蛋白阳性患者无进展生存（PFS）的列线图模型，并分析其预测价值。 方法:回顾性收集2005年5月至2020年12月于山西省肿瘤医院接受D2 +根治性切除术的1 366例胃腺癌患者组织样本，使用免疫组织化学SP法检测Rictor蛋白表达。Rictor阳性676例，按7∶3比例进行简单随机分组，其中训练队列496例，验证队列180例。采用多因素Cox比例风险模型分析Rictor蛋白表达情况及其他临床病理因素与Rictor阳性患者PFS的关系，确定PFS独立影响因素。根据PFS独立影响因素构建预测胃腺癌患者3年和5年PFS率的列线图。进行10 000次重复采样的内部交叉验证，检验预测模型的准确度。通过校准曲线、时间受试者工作特征（ROC）曲线下面积（AUC）和决策曲线分析（DCA）进一步评估模型的内部和外部预测能力。应用列线图模型对训练队列496例PFS进行评分，采用X-tile软件获得评分的最佳临界值，根据最佳临界值将总体队列、训练队列和验证队列病例分为低危组（≤最佳临界值）和高危组（>最佳临界值），采用Kaplan-Meier法分析各队列低危组和高危组PFS差异。 结果:多因素Cox回归分析显示，性别、年龄、pT分期、阳性淋巴结数、神经侵犯、肿瘤长径、网膜侵犯、Clavien-Dindo术后并发症分级、CGA的表达为Rictor阳性胃腺癌训练队列PFS的独立影响因素。依据上述指标构建预测Rictor阳性胃腺癌患者3年和5年PFS率的列线图。内部验证和外部验证的校准曲线显示列线图预测与实际PFS吻合较好。时间ROC曲线显示，内部验证和外部验证模型预测3年PFS率的AUC分别为0.834（95% CI 0.746~0.823）、0.799（95% CI 0.699~0.868），预测5年PFS率的AUC分别为0.817（95% CI 0.718~0.821）、0.795（95% CI 0.675~0.895）。模型整体预测的C指数为0.795（95% CI 0.764~0.825），优于美国癌症联合委员会（AJCC）第8版TNM分期的0.693（95% CI 0.662~0.723）；外部验证DCA示，模型预测的C指数为0.769（95% CI 0.718~0.821），优于AJCC第8版TNM分期的0.715（95% CI 0.669~0.760）。X-tile软件分析示训练队列模型PFS评分的最佳临界值为265.08，所有队列、训练队列和验证队列低危组分别有457、337、120例，高危组分别有219、159、60例。Kaplan-Meier生存分析显示，所有队列、训练队列和验证队列低危组中位PFS时间均未达到，高危组中位PFS时间分别为24、24、28个月，各队列低危组和高危组间PFS差异均有统计学意义（均 P<0.001）。 结论:首次成功构建了针对Rictor阳性表达的胃腺癌患者PFS预测的列线图模型，该模型能较好区分PFS风险低危和高危患者。对于Rictor表达阳性的高危胃腺癌患者，除了控制肿瘤的转移和术后并发症，还应该注意针对Rictor表达阳性的靶向治疗。

目的 观察内关穴电针预处理后急性心肌梗死小鼠(AMI)心功能、局部炎症水平及巨噬细胞M2 型极化变化,并从调控DNA-PK/Rictor/Myc信号通路角度探讨其可能机制.方法 将雄性C57BL/6J小鼠随机分为假手术组、模型组和电针组,每组 10 只.采用结扎冠状动脉左前降支制备心肌缺血模型.电针组接受双侧内关穴电针干预,疏密波,2/15 Hz,1 mA,每次20 min,每日 1 次,连续 3 d,电针干预结束后 30 min造模.采用超声心动图检测心脏射血分数(EF)和短轴收缩率(FS);HE、TUNEL染色观察小鼠心肌病理形态和心肌细胞凋亡;免疫组化和ELISA法检测梗死区心肌组织和外周血中IL-1β、TNF-α、NLRP3 的表达水平;流式细胞术检测心脏中巨噬细胞极化状态,Western blot法检测梗死心肌中DNA-PK、p-DNA-PK、Rictor、Myc的蛋白表达水平.结果 与假手术组相比,模型组的EF、FS明显降低(P<0.000 1),炎性细胞浸润明显,心肌细胞凋亡指数显著升高(P<0.001),心肌组织和血清中IL-1β、NLRP3、TNF-α表达上调(P<0.01,P<0.001),巨噬细胞百分比明显增加(P<0.001),M2 型巨噬细胞百分比下降(P<0.000 1),心肌组织中p-DNA-PK、Rictor和Myc蛋白表达水平明显降低(P<0.05,P<0.000 1);与模型组相比,电针组的EF、FS显著升高(P<0.000 1),炎性细胞浸润减少,心肌细胞凋亡指数下降(P<0.01),心肌组织和血清中IL-1β、NLRP3、TNF-α表达下调(P<0.05,P<0.01,P<0.001),巨噬细胞百分比下降(P<0.05),M2型巨噬细胞百分比上升(P<0.01),心肌组织中p-DNA-PK、Rictor和Myc蛋白表达显著升高(P<0.05,P<0.01,P<0.000 1).结论 电针预处理可能通过调控DNA-PK/Rictor/Myc信号通路,促进巨噬细胞M2 极化,减轻局部炎症,减少心肌细胞凋亡,从而提高心功能,实现心肌保护效应.

目的:探讨没药甾酮增强化疗药物替莫唑胺抗脑胶质瘤的作用及其分子机制.方法:用没药甾酮、替莫唑胺单药及其联合处理U251 细胞后,采用平板克隆形成实验、5-乙炔基-2'-脱氧尿苷(EdU)实验检测各组细胞增殖能力;采用Transwell小室实验、划痕愈合实验检测各组细胞侵袭、迁移能力;采用Western Blot检测细胞中mTOR/自噬通路关键蛋白的表达水平.结果:低氧条件下(200 μmol/L的CoCl2 诱导 48 h),没药甾酮单药(10、30、100 μmol/L)和替莫唑胺单药(6.25、12.5、25 μmol/L)能显著抑制U251 细胞克隆形成数(P<0.001);与替莫唑胺单药组(6.25、12.5 μmol/L)比较,没药甾酮(10 μmol/L)联合替莫唑胺(6.25、12.5 μmol/L)抑制U251 细胞克隆形成的作用增强,但差异无统计学意义(P>0.05).没药甾酮单药(10、30、100 μmol/L)和替莫唑胺单药(100、200、400 μmol/L)显著下调了U251 细胞EdU阳性细胞率;与替莫唑胺单药组(200、400 μmol/L)比较,没药甾酮(30、100 μmol/L)联合替莫唑胺(200、400 μmol/L)显著下调了U251 细胞EdU阳性细胞率(P<0.05 或P<0.01).与替莫唑胺单药(400 μmol/L)比较,联用没药甾酮(30 μmol/L)显著抑制U251 细胞迁移、侵袭能力(P<0.001).与替莫唑胺单药(400 μmol/L)比较,联用没药甾酮(30 μmol/L)显著下调U251 细胞中Phospho-mTOR(Ser2448)、Phospho-4E-BP1(Ser65)蛋白表达,显著上调 MAPKAP1、p-P70(S6K)蛋白表达(P<0.05 或 P<0.01),对 mTOR、Phospho-mTOR(Ser2481)、Rictor、Raptor、GβL表达的下调也有一定的增强作用,但差异无统计学意义.与替莫唑胺单药(400 μmol/L)比较,联用没药甾酮(30 μmol/L)显著上调U251 细胞中自噬相关蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、P62的表达(P<0.05～P<0.001),对Atg12-5/free-Atg12 也有上调作用,但差异无统计学意义.结论:没药甾酮可通过调控mTOR/自噬信号通路增强替莫唑胺抗脑胶质瘤作用.

目的 探讨调控哺乳动物雷帕霉素蛋白复合物2(mTORC2)/Akt信号通路对6-羟基多巴胺(6-OHDA)损伤的SH-SY5Y细胞系是否具有保护作用,并阐明其分子作用机制.方法 经维甲酸(RA)处理的SH-SY5Y细胞分别给予6-OHDA、mTORC2信号通路抑制剂PP242和激动剂A-443654,通过免疫荧光染色观察各组细胞数目的变化;提取细胞总蛋白进行Western blotting和免疫共沉淀(CoIP)实验,明确mTORC2信号通路关键蛋白的表达水平及其相互作用;采用流式细胞术检测各组细胞的凋亡率.同时制备SH-SY5Y与Bv-2细胞系共培养的帕金森病(PD)模型,运用MTT及ELISA方法检测各组细胞活力及培养上清液中肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素β(IL-1β)的含量.结果 6-0HDA损伤的PD细胞模型组酪氨酸羟化酶(TH)/增殖细胞核抗原(PCNA)/Hochest-、TH/5-溴脱氧尿嘧啶核昔(BrdU)-单标或双标阳性细胞数较正常组明显减少,凋亡率升高;Rictor、p-Akt、发育及DNA损伤反应调节蛋白1(REDD1)的表达均上升,且Rictor与p-Akt或REDD1存在相互作用;共培养模型中细胞活力明显降低且上清液中TNF-α和IL-β含量上升.A-443654组随着上述蛋白表达的进一步上调,细胞存活和凋亡以及炎性因子水平均有明显改善,而PP242组则呈现相反的变化.结论 A-443654通过使Akt磷酸化而激活mTORC2信号通路,引起Rictor和REDD1蛋白的表达增加,继而提高细胞存活率并降低凋亡率,促进SH-SY5Y细胞的增殖分化,改善了 6-0HDA引起的细胞损伤以及抑制了炎症因子的释放.

[目的]基于分子对接技术和体外细胞实验探讨姜黄素抗结直肠癌的线粒体作用机制.[方法]SwissTargetPrediction、HERB、DisGeNET、GeneCards数据库挖掘姜黄素抗结直肠癌的交集靶点后,利用cytoscapehubba_MCC、MCN方法筛选核心靶点;使用STRING、AutoDock分别构建靶点蛋白互作网络和姜黄素-核心靶点对接;体外培养细胞模型验证姜黄素线粒体功能核心靶点生物学作用.[结果]网络药理学预测共得到49个姜黄素抗结直肠癌的交集靶点,cytohubba计算互作关系获得9个核心靶点,为MMP2、IL-17A、HIF-1α、TNF、CYP19A1、CD44、BCL-2L11、RICTOR和BECN1,其中2/3的靶点是线粒体功能关联靶蛋白.分子对接结果显示姜黄素与线粒通路蛋白结合稳定.体外细胞模型验证结果表明姜黄素以剂量依赖方式抑制SW480和HCT116细胞增殖.q-PCR实验证明姜黄素导致SW480细胞SIRT1、Hsp60基因表达升高(P＜0.05),SIRT3、COX1、ND1、OPA1、MFN2、POLG、MTH1 基因表达降低(P＜0.05).Western blot结果显示姜黄素可明显抑制VDAC、COXIV蛋白的表达(P＜0.01),升高ATG7蛋白表达(P＜0.01).[结论]姜黄素可多靶点介导线粒体功能障碍,促进结直肠癌细胞凋亡.

目的 探讨雷帕霉素不敏感性伴随蛋白(Rictor)/雷帕霉素复合物2(mTORC2)对血管瘤内皮细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的作用及机制.方法 取对数生长期的血管瘤内皮细胞,设置空白对照组、阴性对照(si-NC)组和Rictor沉默(si-Rictor)组.实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)验证转染效率;采用细胞计数试剂盒8(CCK-8)法测定细胞增殖活性;抗凝血蛋白膜粘连蛋白-5/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)法检测细胞凋亡情况;细胞划痕实验和Transwell实验检测细胞迁移、侵袭情况;Western blotting法检测丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(AKT)、磷酸化AKT(p-AKT)蛋白表达水平;采用25 μmol/L AKT抑制剂MK2206处理Rictor沉默组细胞(si-Rictor+MK2206组),检测AKT、p-AKT蛋白表达水平和细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭情况.结果 血管瘤内皮细胞中Rictor mRNA表达显著高于人脐静脉内皮细胞,差异有统计学意义(t=121.510,P＜0.05).与si-NC组比较,si-Rictor-1、si-Rictor-2和si-Rictor-3组RictormRNA的表达均显著减少,差异均有统计学意义(t=9.564、10.760、22.105,P均＜0.05),其中si-Rictor-3组的沉默效果最好;因此,本次实验选择以si-Rictor-3作为干扰序列继续进行后续实验.si-Rictor组在3个时间点(48、72、96h)细胞增殖能力显著低于si-NC组,差异均有统计学意义(t=3.872、6.560、18.469,P均＜0.05);细胞迁移、侵袭能力显著弱于si-NC组,差异均有统计学意义(t=6.260、4.739,P均＜0.05);细胞凋亡率显著高于si-NC组,差异有统计学意义(t=19.624,P＜0.05);p-AKT的蛋白表达显著高于si-NC组,差异有统计学意义(t=8.981,P＜0.05).MK2206处理细胞后,与si-Rictor组比较,si-Rictor+MK2206组细胞p-AKT的蛋白表达显著下调,差异有统计学意义(t=5.399,P＜0.05);细胞增殖、迁移、侵袭能力显著增加,凋亡显著减少,差异均有统计学意义(P均＜0.05).结论 Rictor/mTORC2在血管瘤细胞中高表达,沉默Rictor抑制细胞增殖、迁移和侵袭,促进细胞凋亡,可能与AKT信号通路的激活有关.

目的 研究抑制了慢性排斥反应的大鼠模型中,T淋巴细胞中哺乳动物雷帕霉素靶蛋白-丝/苏氨酸蛋白激酶(mTOR)通路的各成分是否发生改变,探讨mTOR信号通路在抑制慢性排斥反应中的作用.方法 受体August-Copenhagen-Irish(ACI)大鼠与供体Wistar-Furth (WF)大鼠接受腹腔内异位心脏移植术.实验组大鼠给予慢性排斥反应消除处理,即术前给予经改造的Ⅰ类主要组织相容性复合物(MHC Ⅰ),并给予亚治疗量环孢素(CsA)(10 mg/kg,3d),治疗对照组于术后给予亚治疗量CsA(10 mg/kg,3 d),空白对照组不进行处理.将每组大鼠分为在术后1、3、7d处死的3个亚组,每个亚组大鼠数量为5只.分别在亚组对应天数处死大鼠,获取脾脏样本进行T细胞提取与蛋白免疫印迹(Western blot)分析.结果 蛋白免疫印迹结果表明,在消除了慢性排斥反应的移植心脏中(实验组),对雷帕霉素敏感的复合体1 (mTOR C1)的mTOR与mTOR调节相关蛋白(Raptor)下调,对雷帕霉素不敏感的复合体2(mTOR C2)的伴侣分子(Rictor)与哺乳动物应激活化蛋白激酶相互作用蛋白1 (Sin1)下调,mTOR调节因子(Deptor)与mTOR通路下游目标分子(Rac1)也受到抑制.结论 在消除了慢性排斥反应的大鼠心脏移植模型中,mTORC1和C2通路均受到影响,同时影响了细胞增殖调节(mTOR C1)和细胞运动调节(mTOR C2).因此,选择性地对T细胞肌动蛋白细胞骨架通路进行抑制,可成为新的免疫抑制剂发展方向.

目的 观察mTOR阻断剂对糖尿病肾病(DN)大鼠足细胞蛋白的影响,探讨mTOR通路在DN足细胞损伤中的可能机制.方法 以正常大鼠作为对照组(A组);STZ造模,模型组随机分为DN组(B组)、DN+FK506干预组(C组)、DN+ku0063794干预组(D组).C、D组分别予FK506、ku0063794灌胃.灌胃前1 d、灌胃4、8周分别检测各组大鼠血糖、内生肌酐清除率(Ccr)、24 h尿蛋白;4、8周时检测肾组织mTOR、Raptor、Rictor、Ezrin、α-SMA的表达.结果 4周、8周时C、D组24 h尿蛋白低于B组(P<0.05);Ccr高于B组(P<0.05);mTOR、Raptor、Rictor在B组升高,C、D组均下降(P<0.05);B组Ezrin蛋白明显低于A组(P<0.05),C、D组表达上升(P<0.05);B组α-SMA蛋白高于A组(P<0.05),C、D组降低(P<0.05);病理评分C、D组均较B组降低(P<0.05).相关性分析中Rictor与α-SMA呈正相关(P<0.05),与Ezrin呈负相关(P<0.05);Raptor与Ezrin、α-SMA均无相关性.结论 阻断mTOR通路能降低DN大鼠的尿蛋白、升高Ccr、改善肾脏病理,对肾脏有保护作用;mTORC2信号通路可能参与了DN的足细胞的Ezrin、α-SMA蛋白的表达;FK506也可能阻断mTORC2通路.

目的 探讨白藜芦醇对腺病毒介导的Rictor基因转染人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的增殖、迁移及管腔形成的影响.方法 将PCR扩增得到的目的基因Rictor定向克隆入GV314载体获得重组质粒,经AdMax包装系统与辅助包装质粒在HEK 293T细胞中重组构建Rictor过表达腺病毒载体(Ad-Rictor),不含目的基因的Ad-Null为阴性对照组.分离培养HUVECs后分别用Ad-Rictor及Ad-Null重组腺病毒感染细胞,另设空白对照组及白藜芦醇干预组Ad-Rictor+Res.感染后荧光显微镜及 Western blot 检测重组蛋白表达;CCK8、划痕实验和血管形成实验观察HUVECs增殖、迁移及血管形成能力.结果 重组腺病毒Ad-Rictor及Ad-Null构建成功.与对照组相比,Ad-Rictor感染HUVECs显著上调基因Rictor的表达,提高了HUVECs的增殖活力,迁移和体外管腔形成能力(P<0.05);白藜芦醇干预显著抑制了Rictor过表达情况下HUVECs的增殖、迁移和体外管腔形成(P<0.05).结论 白藜芦醇可以靶向mTORC2/Rictor抑制人脐静脉内皮细胞增殖、迁移及管腔形成.

目的 探讨沉默雷帕霉素靶蛋白(mTOR)雷帕霉素不敏感组分(RICTOR)表达对血管瘤细胞侵袭、迁移能力的影响及作用机制.方法 采用RNA干扰技术降低血管内皮瘤细胞EOMA中RICTOR的表达量,实验分为对照组、阴性组、转染组,Tr-answell法检测降低RICTOR表达对细胞侵袭、迁移能力的影响,Western印迹检测细胞中RICTOR、丝苏氨酸蛋白激酶(AKT)、磷酸化AKT(p-AKT)、基质金属蛋白酶(MMP)-9蛋白的表达量.结果 转染后细胞中RICTOR蛋白的表达量显著降低(P<0.05);沉默RICTOR表达可显著降低细胞的侵袭、迁移能力(P<0.05);转染组细胞中AKT蛋白的表达量没有明显变化,p-AKT、MMP-9蛋白的表达量显著低于对照组(P<0.05).结论 沉默RICTOR表达可通过降低磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/AKT信号通路和MMP-9的表达抑制血管内皮瘤细胞EOMA的侵袭、迁移能力.