目的:制备特异性抗镰刀菌鸡卵黄抗体(IgY)并检测其对温度和pH的耐受性及抗真菌作用。方法:取22周龄莱杭母鸡18只，采用随机数表法将其随机分为阴性对照组和实验组，每组9只。制备灭活镰刀菌丝悬液，将菌丝浓度2×10 7菌落形成单位(CFU)/ml的菌悬液与弗氏完全佐剂等体积混合充分乳化后，对实验组莱杭母鸡进行免疫，每只鸡注射1 ml，2周后换为弗氏不完全佐剂加强免疫。在免疫后的第5~16周每周收集卵黄，用硫酸铵盐析法制备IgY，将得到的蛋白溶液放入冻干机中制作成冻干粉，4 ℃保存。以质量分数0.9%氯化钠溶液代替菌悬液按照同样方式进行阴性对照组莱杭母鸡的注射，以制备非特异性抗体作为实验中的阴性对照。采用考马斯亮蓝法测定特异性IgY蛋白浓度，采用间接酶联免疫吸附测定(ELISA)法测定其效价。将1×10 5 CFU/ml和1×10 3 CFU/ml镰刀菌悬液与不同浓度IgY及磷酸盐缓冲液(PBS)混合培养4 d后测定吸光度( A)值，用PBS及非特异性IgY与镰刀菌悬液共孵育作为空白对照组及阴性IgY组，绘制抗镰刀菌IgY的抑菌曲线。用pH 7.4的PBS将特异性IgY溶液稀释至0.02 mg/ml，分别在30、40、50、60、70、80和90 ℃水浴中孵育30 min后冷却至室温；此外，用pH值为l、2、3、4、5、6、7、8、9、l0、11和12的PBS将特异性IgY溶液稀释至0.02 mg/ml，4 ℃下放置1 h，均采用间接ELISA法测定抗体活性，评估IgY对不同温度和pH的耐受性。取SPF级8周龄雌性C57BL/6小鼠12只，采用随机数表法将其分为PBS对照组和特异性IgY治疗组，每组6只。用镰刀菌感染小鼠右眼角膜，建立小鼠真菌性角膜炎动物模型，建模后1 d，特异性IgY治疗组用200 mg/ml特异性抗镰刀菌IgY点眼，PBS对照组用PBS点眼，于感染后1、3和5 d在裂隙灯显微镜下观察小鼠角膜，根据炎症评分表对真菌性角膜炎的严重程度进行评分。 结果:免疫后第5~16周的IgY蛋白质量浓度分别为1.57、2.89、24.98、25.09、23.89、25.78、21.57、21.37、18.98、15.78、14.67和12.67 mg/ml。特异性抗镰刀菌IgY的效价从第5周开始升高，第7周时达到最高效价，为1∶10 000，可维持至免疫后12周，12周后抗体效价逐渐下降。抑菌曲线显示，与空白对照组和阴性IgY组相比，特异性IgY治疗组镰刀菌生长缓慢。抗体效价高于1∶10 000的特异性IgY在60 ℃以下具有较好的热稳定性；在pH 4~6具有最高活性，在pH 3~9的免疫活性能够保持在70%以上，随着pH值的进一步降低或升高，其活性迅速降低。镰刀菌感染后1、3和5 d，PBS对照组角膜炎症评分分别为3.50±0.55、7.33±0.82和4.00±0.63，特异性IgY治疗组角膜炎症评分分别为3.33±0.82、4.17±0.75和2.50±0.55。2个组不同时间点炎症评分总体比较，差异均有统计学意义( F分组＝247.35， P<0.05； F时间＝23.19， P<0.05)，其中镰刀菌感染后3 d和5 d，与PBS对照组相比，特异性IgY治疗组小鼠真菌性角膜炎炎症评分降低，差异均有统计学意义(均 P<0.05)。 结论:用硫酸铵盐析法可成功制备高效价特异性抗镰刀菌IgY，其稳定性高，对温度和酸碱度均有一定的耐受性，可以在小鼠的真菌性角膜炎模型中减轻角膜溃疡的严重程度，降低炎症评分。

目的:构建和制备以流感病毒为载体嵌合人偏肺病毒(human metapneumovirus, HMPV)抗原表位的重组病毒株。方法:利用8质粒系统共转染293 T/MDCK细胞，制备嵌合有HMPV抗原表位的重组流感病毒株。重组流感病毒株以A/PR/8/34的内部基因(PB1、PB2、PA、NP、NS、M、HA、NA)作为骨架，同时通过基因改造，将HMPV的B细胞表位插入HA基因中，将HMPV的CTL＋Th细胞表位插入到NA基因中。采用"7＋1"模式，利用反向遗传学制备重组流感病毒株。制备成功后，通过全基因组重测序，测定血凝素(HA)的活性、半数组织培养感染剂量(TCID 50)及生长曲线对重组病毒株进行评价。 结果:成功将HMPV的抗原表位插入到流感病毒基因组中，并制备出两株嵌合有HMPV表位的重组流感病毒株，分别命名为FLU/HMPV/B和FLU/HMPV/CTL＋Th，其中HA均为2 7，TCID 50分别为10 5.2/ml和10 5.0/ml。经SPF鸡胚传代3次，两株重组病毒株可稳定增殖。经全基因组测序鉴定，FLU/HMPV/B嵌合有HMPV的B细胞表位，FLU/HMPV/CTL＋Th嵌合有HMPV的CTL和Th细胞表位。生长曲线结果表明两株重组病毒株均可在鸡胚中有效复制。 结论:成功制备出两株嵌合有HMPV表位的重组流感病毒株，重组病毒株从生长特性以及遗传稳定性的结果来看，其符合继续开展下一步动物实验的要求，后续将通过小鼠实验对重组疫苗株的免疫原性以及免疫保护效果进行进一步的评价，最终为实现"一苗两用"或"一苗多用"提出新的思路，也为HMPV疫苗发展提供一种新的策略。

目的 分离并鉴定鸽源产酸克雷伯菌,探究其生物学特性及致病性.方法 剖检甘肃某信鸽棚发病鸽,观察并采集病变组织,通过观察病菌形态、生化试验、16S rRNA PCR鉴定和序列分析实现对致病菌的分离鉴定,结合组织病理学观察、药敏试验和致病性试验对分离菌株进行耐药性和致病性研究.结果 病鸽肝、肺、心等多器官出血,肝脏发黄且质地脆,肺脏发生化脓;从病鸽中成功分离到一株革兰氏阴性、短杆状菌株,麦康凯琼脂培养基上为粉红色光滑、湿润、圆形菌落,靛基质试验阳性;16S rRNA扩增序列与MN330093.1同源性达100.00％,表明病鸽感染产酸克雷伯菌,并命名为GS-BY-GG;产酸克雷伯菌GS-BY-GG对青霉素、氨苄西林和呋喃唑酮等10种药物耐药,对氟苯尼考、美罗培南和庆大霉素等5种药物敏感;组织病理学观察可见病鸽多器官出血,肝脏细胞排列不规则、多处可见棕黄色色素沉积,气管黏膜上皮广泛细胞坏死和脱落、黏膜层可见大量炎性细胞浸润;接种SPF雏鸡显示分离菌具有很强的致病性.结论 本研究成功分离了鸽源产酸克雷伯菌GS-BY-GG,研究结果为产酸克雷伯的临床诊断和防治提供数据支撑.

无特定病原体(specific pathogen-free,SPF)鸡在禽病及疫苗研究中应用广泛.垂直传播性疾病以垂直传播的方式传递给雏鸡,降低雏鸡成活率、增加生产成本、给整个养殖行业带来巨大经济损失的同时,严重影响SPF鸡的培育与使用.因此,需要加强研究及管理人员对鸡垂直传播性疫病病原的认识,并制定出行之有效的监测措施.质量监测是保证SPF鸡质量的重要环节,其中病原检测是首要环节.在此基础上,应结合净化方式以及生物安全防控手段来培育合格的SPF鸡群.本文综述了包括病毒性病原、细菌性病原和支原体在内的鸡主要垂直传播性病原和这些病原的检测方法,比较美国企业标准和中国国家标准中有关SPF鸡微生物检测项目及方法的差异.结果分析显示,在两种标准中,垂直传播性病原大肠埃希菌、奇异变形杆菌以及沙门菌、禽白血病等垂直传播性疾病均未被列入SPF鸡微生物检测项目.而这些病原存在混合感染特征,一旦爆发,将严重影响鸡群健康.为生产更高质量的SPF鸡群,有必要将其列入必检项目.本文旨在帮助人们了解SPF鸡微生物监测的相关标准以及垂直传播性病原的危害和防控策略,为SPF鸡病原检测及净化提供参考.

目的 探讨微小核糖核酸-144(microRNA-144,miRNA-144)对呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)引起哮喘的模型小鼠出现气道炎症反应过程中的免疫调节和五虎汤的治疗干预作用.方法 将 40 只SPF级雄性C57 小鼠随机分为空白组、模型组、五虎汤组、西药组,每组 10 只,除空白组外,其余各组小鼠用RSV鼻腔滴入,复合鸡卵清蛋白(ovalbumin,OVA)腹腔注射诱发哮喘小鼠模型;五虎汤组灌胃五虎汤,西药组灌胃利巴韦林+生理盐水,模型组灌胃等容积生理盐水,空白组灌胃等容积生理盐水,每天1次,连续1周.实验结束后,比较各组小鼠一般情况;使用DSI Buxco PFT肺功能检测系统检测小鼠肺功能残气量与肺总量比(RV/TLC)以检测小鼠气流受限的程度;分别用HE、Masson、PAS染色方法染色观察各组肺组织病理学改变;ELISA法检测肺泡灌洗液(BALF)中白介素(IL)-10、IL-17、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和TGF-β的含量;qPCR 法检测miRNA-144 表达.结果 与空白组比较,模型组小鼠呼吸道症状明显,肺功能RV/TLC升高,提示气流受限,肺组织炎症损伤加重,BALF中炎症因子IL-10、IL-17、TNF-α和TGF-β改变,miRNA-144 表达上调(P＜0.05);与模型组比较,五虎汤组、西药组均可缓解哮喘小鼠呼吸道症状、肺功能通气受限及肺组织炎症浸润等,同时miRNA-144下降,BALF中IL-10、IL-17、TNF-α和TGF-β的含量改变(P＜0.05).结论 五虎汤可能通过降低miRNA-144 的表达,调节Th1/Th2 介导的炎症反应,达到改善RSV诱发哮喘模型小鼠的气道炎症的效果.

目的 分析2016-2023年度长沙市A(H1N1)pdm09流感病毒的血凝素(hemagglutinin,HA)基因特征,了解HA基因遗传进化趋势和氨基酸突变情况,为新形势下流感疫情的防控、流感疫苗筛选提供科学依据.方法 无特定病原(specific pathogen free,SPF)鸡胚分离法获得2016-2023年长沙市的A(H1N1)pdm09流感病毒毒株,使用Illumina公司的MiSeq对其进行二代测序测定.借助DNAStar中MegAlign软件分析HA基因的同源性,构建进化树使用Molecu-lar Evolutionary Genetics Analysis version 11(MEGA11)软件中的Neighbor Joining(NJ)法进行.结果 2016-2023年长沙市的A(H1N1)pdm09流感病毒HA基因同源性为94.8％-99.9％,HA基因同源性逐年降低.2016-2023年度长沙市A(H1N1)pdm09分离株与WHO疫苗推荐株同源性为96.8％-99.0％,流感分离株与疫苗推荐株匹配性相对较好.长沙市的A(H1N1)pdm09流感病毒HA基因进化树显示其在6B分支中进化出多个不同分支,目前已进化到6B.1A.5a.2a分支.HA 4个抗原决定簇氨基酸位点不断发生变异,目前4个抗原决定簇中的15个抗原位点氨基酸发生突变,分离株在2023年新出现的A186T抗原变异位点近期值得关注.受体结合位点在130环相对保守,220环零星发生氨基酸变异,190环氨基酸变异位点是否日趋稳定还需加强监测.以A/Califomia/07/2009(CY121680)为参考株,近年来长沙市大部分A(HlNl)pdm09分离株增加了 162 NQTY糖基化位点,减少了276 NTTC糖基化位点,目前这2个位点的糖基化变异日趋稳定.结论 长沙市A(H1N1)pdm09病毒HA基因不断进化变异,提示病毒有逃逸免疫反应可能,我们应持续加强流感监测.

目的 评价血红素氧合酶-1(HO-1)在七氟醚减轻哮喘小鼠气道损伤中的作用.方法 SPF级雌性C57BL/6小鼠40只,6～8周龄,体重20～ 25 g,采用随机数字表法分为4组(n=10):对照组(C组)、哮喘组(A组)、哮喘+七氟醚组(A+S组)和哮喘+七氟醚+锌原卟啉(ZnPP)组(A+S+Z组).采用鸡卵清蛋白致敏和激发法制备哮喘小鼠模型,A+S组小鼠于每次激发后吸入3％七氟醚1h,A+S+Z组小鼠于每次激发后、吸入七氟醚前腹腔注射ZnPP 10 mg/kg.于末次激发后24 h时测定气道反应性,收集支气管肺泡灌洗液(BALF),进行细胞分类和计数,采用ELISA法测定BALF IL-13、IL-33的浓度.取右肺组织,测定SOD活性、MDA和谷胱甘肽(GSH)含量;肺组织经HE染色行浸润评分;采用Western blot法测定肺组织HO-1的表达水平.结果 与C组比较,A组气道反应性、BALF中炎性细胞计数、IL-13和IL-33浓度、肺组织MDA含量及浸润评分升高,SOD活性和GSH含量降低,HO-1表达上调(P＜0.05);与A组比较,A+S组气道反应性、BALF中炎性细胞计数、IL-13和IL-33浓度、肺组织MDA含量及浸润评分降低,SOD活性和GSH含量升高,HO-1表达上调,A+S+Z组肺组织HO-1表达下调(P＜0.05),其余上述指标差异无统计学意义(P＞0.05);与A+S组比较,A+S+Z组气道反应性、BALF中炎性细胞计数、IL-13和IL-33浓度、肺组织MDA含量及浸润评分升高,SOD活性和GSH含量降低,HO-1表达下调(P＜0.05).结论 HO-1参与了七氟醚减轻哮喘小鼠气道损伤的病理生理机制.

以雏鸭为试验对象,研究不同来源的副粘病毒感染对雏鸭血清中抗氧化酶活性的影响.选择20日龄健康雏鸭100只,随机分成Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组,Ⅰ组为对照组,皮下注射0.5 mL/只 生理盐水,Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组分别皮下注射0.5 mL/只稀释的鸡源、鹅源及鸭源副粘病毒SPF胚液.分别在攻毒后7、14、21、28 d时,随机抽取Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组雏鸭各5只进行血液采集与血清分离,测定雏鸭血清中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)及丙二醛(MDA)的活性与含量,研究异源副粘病毒感染对雏鸭血清中抗氧化酶活性的影响,以及脂质过氧化程度与抗氧化酶活性的变化趋势.结果表明,在攻毒后不同时间内,感染异源副粘病毒的雏鸭血清中的SOD、CAT、GSH-Px活性和MDA活性与含量变化显著不同,揭示异源副粘病毒对雏鸭血清自由基代谢产生了不同程度影响,脂质过氧化程度与SOD、GSH-Px活性密切相关.

目的 分析不同周龄SJ5-SPF鸡脏器系数、肠道长度和体尺变化趋势及性别差异,为实验动物性别选择提供实验数据.方法 选用4周、20周、25周和40周SJ5-SPF鸡,分别测定体重、15个主要脏器重量、5个主要肠道长度和6个主要体尺,计算脏器系数,并对各周龄雌、雄SJ5-SPF鸡体重、脏器系数、肠道长度和体尺进行比较.结果 体重在不同周龄雌雄之间差异均有显著性(P< 0.01),所测得的脏器系数各周龄雌、雄之间均存在不同程度差异;在肠道长度中,空回肠和直肠在以上四个周龄中雌雄之间差异无显著性,其余肠道长度在部分周龄雌、雄之间有明显差异.在所测定的体尺中,体长、胫长、骨盆宽、胸深和胸宽雌、雄之间在上述四个周龄中有2个或3个周龄存在明显差异.结论 周龄和性别对SJ5-SPF鸡的脏器系数、肠道长度和体尺都有影响.

目的 对不明原因死亡的家鸭进行病原鉴定及分离,对其全基因序列进行遗传信息系统发育分析,初步揭示病原的致病性和传播特点,为进一步研究禽4型副粘病毒的致病与传播机制提供科学依据. 方法 采集病死鸭脏器,经处理后接种SPF鸡胚,分离具有血液凝集特性的病原体.通过随机聚合酶链反应,用锚定特异引物对模板进行非特异性扩增.扩增产物经纯化后克隆、测序,登录NCBI数据库进行BLAST比对以确定分离毒株种类;通过Sanger测序技术对病毒进行全基因组测序,采用MEGA7.0软件进行序列比对,通过邻近归并法(Neighbor-Joining)构建种系发生进化树分析其基因特征. 结果 分离到1株血液凝集特性的病原体(SDD01),通过电镜观察、随机聚合酶链反应及测序确定为禽4型副粘病毒.PCR扩增得到其-NP-P M-F-HN-基因全长序列以及L基因的完整CDS区.F基因氨基酸基序分析显示,蛋白切割位点为DVQPR↓F,MDT＞ 144 h,ICPI为0.系统发育分析毒株位于东半球谱系中Ib进化分支,与APMV-4/Mallard/Hubei/2014等野鸟源病毒株同源性为99.4％. 结论 在死亡家鸭脏器中分离到禽4型副粘病毒.该病毒对鸡的致病性较低,系统发育分析其F基因与野鸟源禽4型副粘病毒同源性为99.3％～99.4％,表明家鸭感染的禽4型副粘病毒可能由野鸟引入,并可在家禽和野鸟之间循环传播.