目的:制备靶向甲型流感病毒血凝素(hemagglutinin，HA)蛋白的广谱抗体FHA3，并对其进行鉴定。方法:依据单链抗体(single-chain antibody fragment，scFv)序列信息，PCR扩增FHA3重链和轻链可变区序列，连入抗体哺乳细胞表达载体pFRT-IgG1κ，构建重组表达质粒pFRT-IgG1κ-FHA3。利用瞬时高效表达系统ExpiCHO以及亲和纯化技术获取抗体蛋白FHA3。ELISA检测FHA3与甲型流感病毒HA的结合。假病毒感染宿主细胞试验检测抗体FHA3的体外中和活性。结果:蛋白质电泳结果显示制备获取了高纯度FHA3。FHA3与甲型流感病毒H1N1 HA、H2N2 HA、H3N2 HA、H5N1 HA、H7N9 HA以及H9N2 HA均识别结合，且呈浓度依赖效应。FHA3具有较好的体外中和活性，在低浓度下(5 μg/ml)能有效阻断H5N1以及H7N9假病毒入侵靶细胞，在0.012 5 μg/ml浓度下能有效阻断H1N1假病毒入侵靶细胞。结论:获得1株具有体外中和活性的靶向甲型流感病毒HA蛋白的广谱抗体。

目的:制备1株靶向甲型流感病毒N1亚型神经氨酸酶(neuraminidase，NA)的功能性抗体FNA1，并对其进行鉴定。方法:依据单链抗体(single-chain antibody fragment，scFv)序列信息，合成FNA1重链以及轻链可变区序列，连入抗体哺乳细胞表达载体pFRT-IgG1κ，构建重组表达质粒pFRT-IgG1κ-FNA1。利用瞬时高效表达系统ExpiCHO以及亲和纯化技术获取抗体蛋白FNA1。ELISA检测FNA1与甲型流感病毒N1亚型NA抗原的结合，流式细胞术分析FNA1与细胞膜表面表达N1亚型NA抗原的结合。通过抗体抑制NA蛋白活性试验检测抗体FNA1的体外功能活性。结果:蛋白质电泳结果显示制备获取了高纯度FNA1。FNA1特异性识别结合N1亚型的NA抗原，且呈浓度依赖效应。FNA1能通过结合细胞膜表面表达的N1亚型NA蛋白，有效阻断细胞膜表面的NA活性，从而抑制包装的假病毒从细胞表面释放，继而抑制进一步的靶细胞感染。结论:获得1株具有体外功能活性的靶向甲型流感病毒N1亚型NA蛋白的抗体FNA1。

目的:以痘苗病毒中和抗体表位D8L区为重组位点进行外源基因替换，从而降低载体自身免疫原性。方法:通过同源重组技术，插入表达流感病毒血凝素(hemagglutinin，HA)序列，对D8L区进行替换，构建重组痘苗病毒流感疫苗，同时以表达相同HA的TK区重组痘苗病毒疫苗为对照。Western blot对HA的表达进行验证；小鼠实验、ELISA、血凝抑制试验检测每次免疫后2周的血清抗体效价，攻毒保护试验评价重组痘苗病毒的保护效力。结果:Western blot表明构建的重组疫苗均能正确表达HA D8L蛋白。ELISA、血凝抑制试验显示，初次免疫后，D8L区突变的重组痘苗病毒疫苗HA抗体效价略高于TK区突变的重组疫苗，并随着免疫次数的增多差异有统计学意义( P<0.05)；其免疫原性显著低于TK区突变的重组疫苗( P<0.05)，随着免疫次数增加，二者差异无统计学意义( P>0.05)。H1N1pdm攻毒后保护效力评价结果显示，D8L区突变组可完全清除病毒，且小鼠肺部炎症水平更低、组织损伤更少。 结论:通过将外源基因插入到痘苗病毒载体中和抗体表位D8L区，有助于降低载体自身的免疫原性，并提高外源基因的免疫原性，为痘苗病毒载体在疫苗或基因治疗领域作为递送工具提供了参考。

目的:探讨在肺泡上皮细胞模型中甲型H1N1流感病毒（H1N1病毒）诱导低氧诱导因子-1α（HIF-1α）核转位的分子机制。方法:体外培养人肺腺癌上皮细胞（A549细胞），选取对数生长期细胞用于实验。①实验1：采用感染复数（MOI）1.0的H1N1病毒感染细胞24 h，建立H1N1病毒感染的A549细胞模型（H1N1病毒感染组）；并设立空白对照组。采用蛋白质免疫印迹试验（Western Blot）检测细胞中核转运受体蛋白（Importin 4、Importin 7）表达，探讨HIF-1α核转位是否依赖Importin 4、Importin 7。②实验2：采用不同MOI（0、0.1、0.5、1.0、2.0、4.0）的H1N1病毒感染细胞24 h；采用MOI 1.0的H1N1病毒感染细胞0、3、6、12、18、24、36 h。采用实时荧光定量反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测细胞中胞裂蛋白9基因变异剪接体1（SEPT9_i1）mRNA表达，探讨不同MOI和感染时间对SEPT9_i1表达的影响。③实验3：采用小干扰RNA（siRNA）转染细胞24 h抑制SEPT9_i1，建立沉默SEPT9_i1的A549细胞模型（siRNA-SEPT9_i1组）；并设立空白对照组和空白载体对照组（siControl组）。3组细胞转染24 h后均给予MOI 1.0的H1N1病毒感染24 h，采用实时荧光定量RT-PCR检测细胞中SEPT9_i1 mRNA表达，以探讨siRNA对SEPT9_i1的干扰效率。④实验4：将细胞分为siControl组和siRNA-SEPT9_i1组，两组细胞转染方法同实验3。转染24 h后，两组均以MOI 1.0的H1N1病毒感染细胞，于24 h采用免疫荧光法观察细胞中HIF-1α核内外分布情况；于6、12、24、36、48 h采用实时荧光定量RT-PCR检测病毒M基因表达，以明确SEPT9_i1对HIF-1α核转位和病毒复制的影响。⑤实验5：将细胞分为空白对照组（完全培养基）、SP600125组〔100 μmol/L的c-Jun氨基末端激酶（JNK）信号通路抑制剂SP600125处理细胞2 h〕、H1N1病毒感染组（MOI 1.0的H1N1病毒感染细胞24 h）和H1N1病毒+ SP600125组（100 μmol/L的SP600125预处理2 h后，再加入MOI 1.0的H1N1病毒感染细胞24 h）。采用实时荧光定量RT-PCR检测细胞中SEPT9_i1 mRNA和病毒M基因表达，探讨JNK信号通路对SEPT9_i1表达及病毒复制的影响。结果:①实验1：与空白对照组相比，H1N1病毒感染组A549细胞中Importin 4和Importin 7蛋白表达差异均无统计学意义〔Importin 4蛋白（Importin 4/GAPDH）：1.08±0.03比1.05±0.03，Importin 7蛋白（Importin 7/GAPDH）：0.87±0.11比0.78±0.03，均 P>0.05〕。说明H1N1病毒感染A549细胞中HIF-1α核转位可能不依赖Importin 4和Importin 7。②实验2：A549细胞中SEPT9_i1 mRNA表达随H1N1病毒MOI增加及感染时间延长呈升高趋势，分别于MOI 2.0和感染18 h达峰值，与MOI为0或感染0 h比较差异均有统计学意义（2 -ΔΔCT：MOI 2.0为1.39±0.05比1.00±0.00，18 h为1.47±0.04比1.00±0.00，均 P<0.01）。说明H1N1病毒感染A549细胞中SEPT9_i1表达与病毒MOI及感染时间相关。③实验3：与空白对照组比较，siRNA-SEPT9_i1组A549细胞中SEPT9_i1 mRNA表达明显下调（2 -ΔΔCT：0.38±0.11比1.00±0.00， P<0.01），而siControl组与空白对照组比较差异无统计学意义（2 -ΔΔCT：1.03±0.16比1.00±0.00， P>0.05）。说明沉默SEPT9_i1可抑制H1N1病毒感染A549细胞中SEPT9_i1表达。④实验4：siRNA-SEPT9_i1组H1N1病毒感染A549细胞中HIF-1α核转位较siControl组明显减少。siControl组感染H1N1病毒后细胞中病毒M基因表达逐渐升高，48 h达峰值；siRNA-SEPT9_i1组A549细胞中病毒M基因表达明显下调，48 h与siControl组比较差异有统计学意义（2 -ΔΔCT：3.47±0.66比8.17±0.38， P<0.05）。说明沉默SEPT9_i1后可以抑制H1N1病毒感染A549细胞中HIF-1α核转位和病毒复制。⑤实验5：H1N1病毒感染组A549细胞中SEPT9_i1 mRNA和病毒M基因表达较空白对照组明显升高；而H1N1病毒+ SP600125组A549细胞中SEPT9_i1 mRNA和病毒M基因表达均明显低于H1N1病毒感染组（2 -ΔΔCT：SEPT9_i1 mRNA为0.12±0.10比1.53±0.14，病毒M基因为2.13±0.10比4.66±0.14，均 P<0.05）；SP600125组上述指标与空白对照组比较差异均无统计学意义。说明H1N1病毒感染A549细胞中JNK信号通路可以调控SEPT9_i1的表达，而抑制JNK信号通路可以下调SEPT9_i1的表达及抑制病毒复制。 结论:H1N1病毒通过激活JNK信号通路调控SEPT9_i1的表达，从而提高HIF-1α转运效率以及促进病毒复制。

目的:构建和制备以流感病毒为载体嵌合人偏肺病毒(human metapneumovirus, HMPV)抗原表位的重组病毒株。方法:利用8质粒系统共转染293 T/MDCK细胞，制备嵌合有HMPV抗原表位的重组流感病毒株。重组流感病毒株以A/PR/8/34的内部基因(PB1、PB2、PA、NP、NS、M、HA、NA)作为骨架，同时通过基因改造，将HMPV的B细胞表位插入HA基因中，将HMPV的CTL＋Th细胞表位插入到NA基因中。采用"7＋1"模式，利用反向遗传学制备重组流感病毒株。制备成功后，通过全基因组重测序，测定血凝素(HA)的活性、半数组织培养感染剂量(TCID 50)及生长曲线对重组病毒株进行评价。 结果:成功将HMPV的抗原表位插入到流感病毒基因组中，并制备出两株嵌合有HMPV表位的重组流感病毒株，分别命名为FLU/HMPV/B和FLU/HMPV/CTL＋Th，其中HA均为2 7，TCID 50分别为10 5.2/ml和10 5.0/ml。经SPF鸡胚传代3次，两株重组病毒株可稳定增殖。经全基因组测序鉴定，FLU/HMPV/B嵌合有HMPV的B细胞表位，FLU/HMPV/CTL＋Th嵌合有HMPV的CTL和Th细胞表位。生长曲线结果表明两株重组病毒株均可在鸡胚中有效复制。 结论:成功制备出两株嵌合有HMPV表位的重组流感病毒株，重组病毒株从生长特性以及遗传稳定性的结果来看，其符合继续开展下一步动物实验的要求，后续将通过小鼠实验对重组疫苗株的免疫原性以及免疫保护效果进行进一步的评价，最终为实现"一苗两用"或"一苗多用"提出新的思路，也为HMPV疫苗发展提供一种新的策略。

目的:采用不同的流感病毒骨架构建表达分泌荧光素酶(Gaussia luciferase，Gluc)的重组流感病毒，同时研究其生长特性、遗传稳定性、Gluc表达水平、体外抗流感药物活性。方法:在PR8NA的C端插入猪捷申病毒2A肽(porcine teschovirus-2A autocleavage peptide, P2A)自剪切位点及Gluc编码基因，其余7个质粒分别来源于A/Puerto Rico/8/34(PR8) (H1N1)和A/WSN/1933(WSN) (H1N1)，通过流感病毒反向遗传学8质粒系统拯救重组病毒，分别命名为PR8NAGluc/PR8和PR8NAGluc/WSN。检测重组病毒遗传稳定性；对比PR8NAGluc/PR8和PR8NAGluc/WSN的荧光强度；检测重组病毒的生长动力学；同时测定PR8NAGluc/WSN荧光强度与半数组织培养感染剂量(median tissue culture infective dose，TCID 50)的相关性及对奥司他韦、法匹拉韦和莲花清瘟的体外抗流感药物活性。 结果:通过反向遗传学成功拯救出以PR8和WSN为骨架表达Gluc的重组病毒。相对于PR8骨架，以WSN为骨架明显提高了Gluc的表达且遗传稳定，复制动力学比野生型稍低。PR8NAGluc/WSN荧光强度与TCID 50有较好的相关性，其对奥司他韦、法匹拉韦和莲花清瘟具有良好的敏感性。 结论:以WSN为骨架的重组病毒荧光表达强度比PR8骨架高，为高通量筛选抗流感病毒药物及研发流感病毒载体疫苗提供参考。

目的:基于重组流感病毒载体的呼吸道合胞病毒(RSV)疫苗的构建及在小鼠体内的免疫保护效果评价。方法:构建并拯救表达RSV A2型G蛋白胞外结构域(Gecto)的重组甲型流感病毒，将其命名为PR8NAGecto/WSN。体外验证重组病毒G蛋白表达与病毒生长动力学后，单剂滴鼻免疫BALB/c小鼠，并评价体液免疫、黏膜免疫与细胞免疫。免疫4周后，分别用RSV A2与RSV B9320进行攻毒，通过小鼠体重变化、肺组织病毒滴度及病理评价免疫保护效果。结果:单剂滴鼻免疫PR8NAGecto/WSN能在小鼠体内产生较强的体液免疫、黏膜免疫及细胞免疫。与对照组比较，免疫组小鼠经RSV A2或B9320两个亚型病毒攻毒后肺病毒载量与肺组织病理均明显改善。结论:单剂滴鼻免疫重组PR8NAGecto/WSN疫苗可在小鼠体内诱导较强的RSV特异免疫应答与攻毒保护。本研究为新型RSV黏膜疫苗的研发提供新的思路与实验资料。

目的 探究植物RNA作为载体RNA在病毒核酸提取过程中对目标核酸的保护效果.方法 分别提取绿萝、水稻、竹子3种常见植物中的RNA作为载体RNA,同时以商业试剂Takara载体RNA为对照,提取甲型流感病毒(Flu A)、乙型流感病毒(Flu B)、呼吸道合胞病毒A型(RSV A)核酸,并利用实时荧光定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)定量分析提取得到的病毒核酸浓度,以评估植物RNA在核酸提取中对病毒核酸的保护效果.结果 经琼脂糖凝胶电泳检测,所提取植物RNA的28S rRNA、18S rRNA条带清晰明亮,无弥散现象,所得RNA具有良好的完整性.且经验证,植物RNA对病毒核酸扩增无干扰.裂解液中分别加入0、1000、3000、5 000、7 000、9 000 ng绿萝RNA进行Flu A RNA提取时,提取物经RT-qPCR扩增后的Ct值分别为 35.06±0.14、33.01±0.42、32.45±0.33、31.95±0.34、31.74±0.28、31.92±0.24,使用 Takara 载体RNA提取核酸的Ct值为31.96±0.34.Ct值随着绿萝RNA添加量增加而降低,当添加量≥5 000 ng时,Ct值接近使用Takara载体RNA的提取组,继续提高绿萝RNA用量,Ct值趋于稳定,且与使用TaKaRa载体RNA的Ct值比较,差异无统计学意义(P＞0.05).添加5 000 ng绿萝RNA与添加0 ng绿萝RNA相比,Ct值相差3.11,根据浓度差等于2△Ct计算可知添加5 000 ng绿萝RNA提取得到的Flu A核酸浓度比不添加载体RNA高了 8.63倍.进一步研究发现,添加绿萝RNA、水稻RNA、竹子RNA及Takara载体RNA,提取得到的Flu A、Flu B和RSV A核酸经RT-qPCR扩增后得到的Ct值与不添加载体RNA比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).绿萝RNA作为载体RNA在提取Flu A、Flu B、RSV A混合病毒核酸时,对比无载体RNA的对照组,分别降低了 2.61、2.90、1.45个Ct值,即添加了绿萝RNA后提取Flu A、FluB、RSV A所得的核酸浓度分别提高了 6.11、7.46、2.73倍.且添加了水稻RNA和竹子RNA提取混合病毒核酸所得的核酸浓度也分别至少提高了 2.63倍和2.60倍.结论 在病毒核酸提取过程中植物RNA具有保护病毒核酸的作用,可以提高提取得到的目的病毒RNA浓度,可用作病毒核酸提取时的载体RNA,为核酸提取中的载体RNA选择提供更多来源.

病毒,尤其是新型冠状病毒、甲型流感病毒、艾滋病毒、登革热病毒以及乙型肝炎病毒等常见病毒,严重影响人类生命健康;同时随着人类活动空间的不断扩大,许多新突发病毒性传染病持续对人类社会造成潜在威胁.本文对病毒的侵染过程和人胞途径研究进展进行了较系统的综述,为今后病毒侵染机制、靶向病毒入胞途径的广谱抗病毒药物以及新型病毒载体研究提供重要参考.

结核分枝杆菌(MTB)引起的结核病是一种慢性呼吸道传染病,研制载体介导的ESAT-6疫苗是当前的热点之一,ESAT-6抗原是一种公认的疫苗分子.本研究概述了卡介苗、耻垢分支杆菌、母牛分支杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、格式链球菌、单核细胞增生性李斯特菌、根癌农杆菌、乳酸乳球菌、两歧双歧杆菌、毕赤酵母、流感病毒、高度减毒的牛痘病毒、腺病毒血清型5、慢病毒和昆虫杆状病毒等载体介导的结核分枝杆菌ESAT-6疫苗的研制现状.