目的:了解2019年云南省曲靖地区手足口病（HFMD）病原学特征。方法:采集曲靖地区2019年HFMD患儿的粪便样本，从粪便悬液中直接提取病毒RNA，先用MD91/OL68-1引物扩增肠道病毒（EV）VP4区基因并测序，序列在GenBank确定病毒型别，用各型病毒的相关引物扩增病毒VP1区全序并测序，通过肠道病毒在线定型工具（Enterovirus Genotyping Tool Version 0.1）进行病毒型别初步鉴定，之后计算与原型株的核苷酸相似性并进行基因进化树分析定型。结果:470份样本中共检测到62株EV毒株，总阳性检出率为13.19%，其中EV-A组病毒42株（8.94%），EV-B组病毒9株（1.91%），EV-C组病毒11株（2.34%），全为脊灰病毒1型疫苗株（Sabin株），未检测到肠道病毒71型（EV-A71）和EV-D组病毒。检出率较高的病毒依次为柯萨奇病毒A10型（CV-A10，4.47%，21株）、柯萨奇病毒A16型（CV-A16，2.55%，12株）、脊髓灰质炎病毒1型疫苗株（2.34%，11株）和CV-A6（1.70%，8株）。结论:2019年云南省曲靖地区儿童HFMD病例的主要病原是CV-A10、CV-A16和CV-A6，未检出EV-A71。与往年国内其他省份相比，曲靖地区2019年HFMD病原体已经发生改变，今后要加强对CV-A10、CV-A16和CV-A6等病原的实验室监测工作。

目的:比较脊髓灰质炎（脊灰）疫苗3种接种程序基础免疫后的免疫原性。方法:选择≥2月龄健康婴儿为研究对象，采用完全随机化分组方法分成3组，应用Sabin株含有Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型的脊灰灭活疫苗（sIPV）和口服含有Ⅰ型和Ⅲ型的脊灰减毒疫苗（bOPV），按照1剂sIPV+2剂bOPV（1sIPV+2bOPV组）、2剂sIPV+1剂bOPV（2sIPV+1bOPV组）和全程sIPV（3sIPV组）3种程序完成基础免疫，分别采集3组基础免疫前和基础免疫后28~42 d双份血清，应用细胞微量中和试验测定脊灰中和抗体。采用方差分析、秩和检验以及χ2检验进行组间比较。结果:3组共205名受试者完成脊灰疫苗基础免疫后血清脊灰中和抗体Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型阳转率均高于97.00%、阳性率均高于98.00%、几何平均滴度（GMT）较基础免疫前均大幅度升高，3组Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型基础免疫前后阳性率、GMT差异均有统计学意义（ P<0.05），3组免疫后GMT均为Ⅰ型最高，Ⅲ型次之，Ⅱ型最低，Ⅱ型GMT水平 2sIPV+1bOPV组、3sIPV组均高于1sIPV+2bOPV 组。 结论:3组基础免疫后血清脊灰中和抗体均处于高水平，对脊灰病毒形成了有效的免疫屏障，均具有较好的免疫原性，但不同程序基础免疫后脊灰中和抗体水平存在一定差异，2sIPV+1bOPV组、3sIPV组对Ⅱ型脊灰病毒的免疫原性优于1sIPV+2bOPV组。

目的 探讨脊髓灰质炎疫苗猴体神经毒力试验毒力返强对神经免疫反应的影响及病理机制.方法 Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗(Vero细胞)的原液(≥7000 lgCCID50/L)以及10-1稀释各型脊髓灰质炎疫苗采用脑内法进行神经毒力试验,观察脊髓灰质炎的病理变化,并利用免疫组织化学法检测脊髓灰质炎病毒受体CD155以及CD4+T淋巴细胞、CD20+B淋巴细胞和CD68+小胶质细胞的分布.结果 发生脊髓灰质炎的猴体出现脊髓炎症细胞浸润,少量神经元变性,脊髓神经元变性坏死、卫星现象、噬神经细胞现象、血管周围炎症细胞袖套状浸润和胶质细胞增生;主要为CD4+T淋巴细胞、CD20+B淋巴细胞和CD68+小胶质细胞大量浸润在血管袖套和增生的胶质结节中;在发生和未发生脊髓灰质炎的猴体中,CD155分布未见明显差别,均表达在神经元和胶质细胞,而血管内皮细胞未见表达.结论 脊髓灰质炎疫苗毒力返强导致典型病毒性脑脊髓炎.

目的 建立牛多抗对兔多抗夹心ELISA方法检测Sabin株脊灰病毒灭活疫苗(Sabin strain inactivated poliovirus vaccine,sIPV)D抗原含量,并对建立的方法进行验证.方法 分别采用Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型sIPV疫苗原液作为抗原制备兔多抗,并通过间接ELISA法检测其效价及特异性.以牛多抗为包被抗体、兔多抗为显示抗体建立检测D抗原含量的双抗体夹心ELISA方法,并对方法的准确度、精密度及D抗原专属性进行验证.用建立的方法检测国内5家企业sIPV疫苗样品.结果 制备获得型别特异性好、效价高的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型兔多抗,并成功建立了双抗体夹心ELISA方法.采用四参数拟合,3型别标准曲线均具有良好的线性关系,R2均＞0.99.Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型各试验加标回收率均为80％～120％,各浓度平均回收率分别为98.11％、97.41％、98.66％;重复性与中间精密度CV均＜10％;能够对D/C抗原进行区分.建立的方法对5家企业生产的sIPV疫苗均能够进行D抗原定量检测.结论 成功建立了检测sIPV疫苗D抗原含量的双抗体夹心ELISA方法,该方法准确度、精密度良好,具有一定的D抗原特异性,能够对不同厂家生产的疫苗进行检测.

目的 比较Ⅰ+Ⅲ型脊髓灰质炎减毒活疫苗(人二倍体细胞)(bOPV)糖丸和液体剂型与Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗(sIPV)联合序贯免疫接种在≥2月龄婴儿中的免疫原性和安全性.方法于2015年9月至2016年6月,采用随机、盲法、单中心、平行对照设计,选择广西柳州市≥2月龄的婴儿为研究对象,将其分为1sIPV+2bOPV和2sIPV+1bOPV组,每种序贯免疫程序按bOPV剂型不同再分为糖丸剂型组与液体剂型组,即1sIPV+2bOPV糖丸组、1sIPV+2bOPV液体组、2sIPV+1bOPV糖丸组、2sIPV+1bOPV液体组,每组100名,按照0、28、56 d的免疫程序,共接种3剂.记录至少接种1剂次受试者(399名)不良反应事件;全程免疫后28 d,采集排除脱落者和违背试验方案者(共350名)血样,采用细胞培养微量中和试验测定抗脊灰病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型中和抗体滴度(GMT),计算抗体阳转率,并对其进行统计学分析.结果1sIPV+2bOPV糖丸组、1sIPV+2bOPV液体组、2sIPV+1bOPV糖丸组、2sIPV+1bOPV液体组全部不良反应发生率分别为79%(79/100)、76%(76/100)、80%(79/99)和74%(74/100) (χ2=1.23,P=0.747);严重不良反应发生率分别为6%(6/100)、5%(5/100)、6%(6/99)和4%(4/100)(χ2=0.57,P=0.903).全程免疫后,1sIPV+2bOPV糖丸组、1sIPV+2bOPV液体组、2sIPV+1bOPV糖丸组、2sIPV+1bOPV液体组Ⅰ型脊灰抗体阳转率分别为99%(86/87)、100%(83/83)、99%(87/88)、99%(91/92)(χ2=0.94,P=0.815),Ⅱ型分别为47%(41/87)、57%(47/83)、80%(70/88)、79%(73/92)(χ2=31.56,P<0.001),Ⅲ型分别为100%(87/87)、99%(82/83)、100%(88/88)、99%(91/92)(χ2=2.02,P=0.568);Ⅰ型脊灰抗体GMT分别为4539.68、6243.43、6819.53、7916.29(F=25.87,P<0.001),Ⅱ型分别为12.98、10.54、63.75、84.21(F=8.68,P=0.034),Ⅲ型分别为1172.55、1416.03、2648.89、3250.75(F=14.50,P=0.002).结论 相同序贯免疫程序中,bOPV糖丸剂型与液体剂型在≥2月龄的婴儿中均具有良好的安全性和免疫原性;相同剂型不同免疫程序中,2sIPV组较1sIPV组产生更高的血清中和抗体水平,尤其表现在Ⅱ型、Ⅲ型免疫后抗体GMT水平.

目的 阐述大连市1例脊髓灰质炎疫苗高变异株病例的流行病学调查与分析.方法 按照相关要求,对疫情开展病例个案调查、病毒传播风险评估、应急处置等相关工作,由省级AEFI调查诊断专家组对病例进行诊断.结果 2016年,大连市发现1例口服第1剂二价脊髓灰质炎减毒活疫苗后高变异株病例,国家脊灰实验室对病例所分离到的脊灰病毒进行核苷酸序列测定时发现,与Sabin株相比变异数为7.结论 该病例诊断为疫苗相关麻痹型脊髓灰质炎病例,按照相关要求采取措施,有效地控制了疫情的扩大和蔓延.

目的 使用CY5荧光标记引物建立定量检测Ⅰ型Sabin株脊髓灰质炎病毒480-A和525-C突变率的MA-PREC.方法 提取Ⅰ型Sabin株脊髓灰质炎病毒样品RNA,反转录合成cDNA后,进行非对称PCR扩增以生成单链DNA,之后采用CY5荧光标记引物进行一步扩增反应以合成双链产物,以DNA内切酶Dde Ⅰ和Nci Ⅰ酶切后电泳分离,获取荧光信号,计算样品的突变率.检测4个国际标准品(100％ DNA突变标准品、IS DNA标准品、LMVR标准品和HMVR标准品)的突变率,重复5次,验证方法的准确性和精密度,并进行初步应用.结果 使用CY5荧光标记引物,建立了定量检测Ⅰ型Sabin株脊髓灰质炎病毒480-A和525-C突变率的MAPREC.100％ DNA突变标准品、IS DNA标准品、LMVR标准品以及HMVR标准品的标示值分别为100.00％、2.00％、1.84％、2.56％,检测结果分别为95.09％、2.06％、1.45％、1.92％,各标准品的实验间CV值均＜15％.Ⅰ型Sabin株口服脊髓灰质炎减毒活疫苗工作种子、单次收获液和原液的突变率为1.05％～1.22％,批间一致性良好.结论 初步建立了基于荧光素标记的MAPREC,可以代替同位素法进行Ⅰ型Sabin株脊髓灰质炎病毒突变率的定量检测.

目的:使用荧光标记代替同位素标记,建立定量检测Ⅲ型Sabin株脊髓灰质炎病毒472位U到C突变比例的MAPREC(mutant analysis by PCR and restriction enzyme cleavage)法.方法:提取病毒样品RNA,反转录合成cDNA后进行非对称PCR反应以生成单链DNA扩增产物,之后采用荧光标记引物进行扩增,合成双链产物,以突变位点敏感的限制性内切酶作用后电泳分离,并分析样品的突变比例.结果:采用建立的方法对4个国际标准品进行检测,100％ DNA突变标准品、IS DNA标准品、LMVR标准品以及HMVR标准品的标示值分别为100％、0.9％、0.7％、1.1％,检测结果分别为95.59％、0.84％、0.68％、1.07％,与其标示值一致性良好,并且不同实验间RSD均小于15％.检测9个批次样品,结果突变率均小于1％,符合WHO要求.结论:初步建立了基于荧光素标记的MAPREC方法,可以代替同位素法进行病毒突变的定量检测.

目的 采用透析法对Sabin株3个型别的脊髓灰质炎病毒收获液进行透析后的病毒回收效果评价.方法 高病毒滴度时,对Sabin株Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型病毒收获液分别进行透析,比较每个型别病毒收获液透析前后的病毒感染性滴度回收率,及透析后的甲醛清除率;低病毒滴度时,选取101、100、10-1 CCID50/mL 3个滴度的Sabin株Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型病毒液,分别进行透析,将相同型别及滴度的透析前后样品接种至Hep-2细胞上进行3次传代,比较透析前后细胞病变比率及病毒滴度.结果 高病毒滴度时,各型别病毒收获液透析后与透析前相比,样品体积和感染性滴度均未发生较大变化(P＞0.05),透析后甲醛清除率达99％以上.10 1 CCID50/mL低病毒滴度时,各型别病毒3次传代均能100％引起细胞病变;100 CCID50/mL低病毒滴度时,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型病毒第1次传代引起细胞病变比率分别为66％、33％和33％,第2、3次传代均能100％引起细胞病变;10-1CCID50/mL低病毒滴度时,3个型别病毒3次传代均不能引起细胞病变.所有细胞病变后检测病毒滴度均在6.0 IgCCID50/mL以上.结论 Sabin株3个型别的病毒收获液经透析后,活病毒的回收率较高,基本无损失,透析法可作为该病毒的纯化方法.

目的 获得在昆虫细胞中有效表达脊髓灰质炎病毒P1基因和3CD基因的重组杆状病毒,为制备脊髓灰质炎病毒样颗粒疫苗提供了科学依据.方法 将I型脊髓灰质炎病毒( Mahoney株) 的P1基因和3CD基因构建到供体质粒中,通过flashBAC ULTRATM系统制备重组杆状病毒;将Mahoney株的P1基因与Sabin株Ⅲ 型的3CD基因组合,用同样方法构建重组杆状病毒.通过接种昆虫细胞草地贪夜蛾细胞( sf-9细胞) 对两种病毒进行扩增,再接种昆虫细胞粉纹夜蛾细胞( High five细胞) 扩大培养,并通过定量PCR对P1和3CD基因的表达进行验证,利用Western blot检测P1蛋白的表达及被3CD蛋白酶剪切的情况.结果 获得了两株稳定表达脊髓灰质炎病毒P1和3CD基因的重组杆状病毒.其中,重组杆状病毒( BacU-Mahoney-P1-3CD) 在感染细胞后,3CD蛋白酶表达量较低,不能有效剪切P1前体蛋白;而重组杆状病毒( BacU-Mahoney-P1-Sabin PV3 3CD) 感染细胞后,3 CD蛋白酶的表达量和对P1前体蛋白的剪切效力都有明显提高( P＜0.05).结论将Mahoney株P1基因和Sabin株Ⅲ 型的3CD基因的组合构建重组杆状病毒,可有效地在昆虫细胞中表达P1和3CD基因,并且Sabin株Ⅲ 型的3CD蛋白酶可有效地剪切Mahoney株的P1前体蛋白.