目的:探讨第二个线粒体衍生的半胱氨酸蛋白酶激动剂小分子(Smac)类似物LCL161联合天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)抑制剂Z-VAD-FMK诱导细胞发生坏死性凋亡对人乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231增殖的影响。方法:体外培养MCF-7、MDA-MB-231细胞株。噻唑蓝(MTT)法检测2种细胞株空白对照组、Z-VAD-FMK组(10 mmol/L)、LCL161(1 μmol/L)组及LCL161+Z-VAD-FMK组存活率，并应用透视电子显微镜观察各组细胞凋亡亚微结构。Nec-1预处理后，MTT法检测2种细胞株空白对照组、Nec-1组(20 mmol/L)，LCL161(1 μmol/L)组及LCL161+Nec-1组细胞存活率。Annexin V-FITC/PI双染法检测空白对照组、LCL161组、Z-VAD组、Nec-1组、LCL161+Z-VAD组、LCL161+Nec-1组、LCL161+Z-VAD+Nec-1组细胞凋亡率。裸鼠成瘤实验观察空白对照组、LCL161组、LCL161+Z-VAD-FMK组裸鼠活体内MCF-7细胞株移植瘤体积和质量。结果:(1)MTT法检测结果显示，LCL161+Z-VAD-FMK组的MDA-MB-231和MCF-7细胞株的存活率均低于其他各组，差异均有统计学意义( P值均<0.01)。透视电子显微镜观察到LCL161+Z-VAD-FMK组细胞具有凋亡和坏死共同存在的特征性形态学改变。(2)Nec-1预处理后，MTT法检测结果显示，与空白对照组及Nec-1组相比较，LCL161组和Nec-1+LCL161组的MDA-MB-231和MCF-7细胞的OD值明显降低，表明其细胞存活率较低，差异均有统计学意义( P值均<0.05)；但LCL-161组与Nec-1+LCL161组比较，MDA-MB-231和MCF-7细胞存活率差异均无统计学意义( P值均>0.05)。(3)Annexin V-FITC/PI双染法结果显示，与其他各组相比，LCL161+Z-VAD-FMK组和LCL161组两种细胞株凋亡率明显增高，LCL161+Z-VAD-FMK组亦高于LCL161组，差异均有统计学意义( P值均<0.01)。(4)15只裸鼠成功建立MCF-7细胞裸鼠成瘤模型，给药后第20天时LCL161组和LCL161+Z-VAD-FMK组肿瘤体积和质量均低于空白对照组，差异均有统计学意义( P值均<0.05)，而LCL161组与LCL161+Z-VAD-FMK组的肿瘤体积和质量差异均无统计学意义( P值均>0.05)。 结论:体外实验验证LCL161+Z-VAD-FMK在乳腺癌细胞中能通过诱发坏死性凋亡抑制肿瘤增殖，但是对雌激素受体阳性乳腺癌体内作用需要进一步验证。

目的:研究桂枝茯苓丸联合促性腺激素释放激素类似物(GnRH-a)对子宫内膜异位病灶内细胞增殖、侵袭及M EK/ERK通路的影响.方法:选择在本院诊断为子宫内膜异位症的患者作为研究对象并随机分为两组,观察组术前接受桂枝茯苓丸联合GnRH类似物治疗,对照组术前接受GnRH类似物单药治疗.手术切除后收集子宫内膜异位病灶,测定增殖及侵袭相关基因的m RN A表达量以及MEK/ERK通路分子的蛋白表达量.结果:观察组子宫内膜异位病灶内Id-1、Sema3A、c-IAP1、OPN、uPA的mRNA表达量以及p-MEK、p-EKR1/2、MMP2的蛋白表达量显著低于对照组,Bak、Smac、PAI-1、TIMP1、TIMP2的mRNA表达量以及caspase-3的蛋白表达量显著高于对照组.结论:桂枝茯苓丸联合GnRH类似物能够抑制子宫内膜异位病灶内细胞的增殖、侵袭及M EK/ERK通路的激活.

目的 探讨Smac类似物LCL161对非小细胞肺癌A549细胞增殖及凋亡的影响及其机制.方法 将处于对数生长期的A549细胞分为对照组(0.1%二甲基亚砜)及5、10、20 mmol/L LCL161组,分别采用相应药物干预24 h、48 h、72 h后,用四甲基偶氮唑盐法检测各组细胞的增殖情况,药物干预48 h后用Hoechst荧光染色法计数凋亡细胞.取对照组及5、10 mmol/L LCL161组培养48 h后的细胞,用免疫印迹法检测X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)、B淋巴细胞瘤-2相关X蛋白(Bax)和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)的蛋白表达情况.结果 各时点,对照组、5 mmol/L LCL161组、10 mmol/L LCL161组、20 mmol/L LCL161组 A549细胞 A490值依次降低(均 P <0.05);5 mmol/L LCL161组、20 mmol/L LCL161组A549细胞A490值随时间延长而降低(均P<0.05),10 mmol/L LCL161组A549细胞72 h A490值均低于24 h、48 h (均P<0.05).对照组、5 mmol/L LCL161组、10 mmol/L LCL161组、20 mmol/L LCL161组 A549细胞凋亡数依次增高(均P<0.05).对照组、5 mmol/L LCL161组、10 mmol/L LCL161组XIAP蛋白表达水平依次降低,而Bax和Caspase-3蛋白表达水平依次升高(均P<0.05).结论 LCL161对肺癌A549细胞具有增殖抑制及凋亡诱导作用,其机制可能与下调XIAP、上调Bax和Caspase-3相关.

目的:通过定量蛋白组学技术探讨Smac类似物BV6影响人卵巢癌SKOV3细胞生长的可能机制.方法:四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测各浓度梯度BV6干预SKOV3细胞48 h后的生长抑制率,计算抑制率为50％时的药物浓度为半数抑制浓度(IC50),以0.05、0.1、0.2μmol/L BV6进行后续实验;光镜下观察对照组与0.05μmol/L BV6处理组48 h后的细胞形态变化,应用同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)技术结合液相串联质谱策略筛选差异蛋白并行生物信息分析;蛋白质印迹(Western blotting)检测对照组、不同浓度BV6处理组半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)的表达.结果:BV6可以抑制SKOV3细胞的生长增殖,且呈剂量依赖性,多组间方差分析及任意组间两两比较,差异均有统计学意义(均P<0.05).按公式计算BV6作用于SKOV3细胞48 h的IC50为0.40μmol/L.基于发现错误率(FDR)<1％,对照组与0.05μmol/L BV6处理48 h组筛选到349个差异蛋白,其中251个蛋白表达上调、98个蛋白表达下调,经生物信息学分析显示差异蛋白与RNA转录、蛋白质翻译、细胞分裂增殖、凋亡信号调节及肿瘤血管生成密切相关.Western blotting结果显示高、中、低浓度BV6干预SKOV3细胞48 h后与对照组相比,Caspase-3蛋白表达增加,其中高BV6组的Caspase-3蛋白表达最高,组间差异有统计学意义(均P<0.05).结论:BV6通过抑制RNA转录、蛋白质翻译进程、细胞分裂增殖及肿瘤血管生成,促进Caspase-3凋亡信号活化介导SKOV3细胞死亡.

目的:探讨Birinapant抗肝癌的作用及分子机制.方法:人肝癌细胞QGY-7701经终浓度为0、1、5、25和125 nmol/L的Birinapant作用24、48和72 h,各设3个复孔,检测细胞增殖活性,分析细胞凋亡率,观察细胞核型和线粒体膜电位变化,分析基因转录与表达水平,评价药物细胞毒性;同时,将4周龄雄性BALB/C小鼠随机分成5组,每组20只,腹股沟注射肝癌细胞QGY-7701,两天后各组皮下分别注射Birinapant(0、1、5、25和125μg/kg),隔天注射一次,首次注射Birinapant后18 d,每组脱颈处死10只小鼠,取瘤组织称重,并记录各组剩余10只小鼠的存活期,观察Birinapant对荷瘤小鼠肝癌生长及生存期的影响.结果:与对照组(NC)比较,Birinapant处理组的细胞增殖显著受抑制、细胞凋亡率显著增加(P<0.01),出现细胞线粒体膜电位降低及核型改变,同时细胞内Ciap-1(cellular inhibitor of apoptosis protein 1)、Ciap-2(cellular inhibitor of apoptosis protein 2)、ras、raf、mek、erk基因的表达显著下调(P<0.01),caspase-3和caspase-9基因的表达水平显著上调(P<0.01);与模型对照组(MG)比较,Biri-napant处理组的荷瘤小鼠瘤组织生长速度显著减小且生存期延长(P<0.01).结论:Birinapant通过抑制Ciap-1、Ciap-2和Ras-Raf-MEK-ERK通路蛋白的表达,激活线粒体介导的内源性凋亡,对肝癌有一定的抑制作用.

目的 探讨Smac类似物BV6泛素化对肺癌细胞A549迁移的影响及BV6泛素化诱导肺癌细胞A.549迁移的机制.方法 采用空载质粒(空白对照组)、BV6-flag质粒(BV6-flag组)、BV6-flag质粒分别与泛素HA-ub质粒(BV6-ub组)、泛素HA-K48质粒(BV6-K48组)和泛素HA-K63质粒(BV6-K63组)转染肺癌A549细胞.实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测BV6 mRNA转录情况;免疫共沉淀和免疫印迹法(Western blot)检测BV6泛素化情况;Transwell小室法检测细胞迁移情况;Western blot和qRT-PCR检测NF-κB/p65蛋白和mRNA表达情况.结果 转染后,BV6-flag组、BV6-ub组、BV6-K48组、BV6-K63组A549细胞中BV6 mRNA表达显著高于空白对照组(P＜0.05);而各转染组间BV6 mRNA表达无统计学差异(P＞0.05).各转染组A549细胞中BV6都发生泛素化,且BV6-K63组泛素化水平最高.与空白对照组比较,BV6-flag、BV6-ub、BV6-K63组A549细胞迁移数显著增高(P＜0.05);与BV6-flag组比较,BV6-ub组、BV6-K63组A549细胞迁移数显著增高(P＜0.05).与空白对照组比较,BV6-flag组、BV6-ub组、BV6-K48组、BV6-K63组A549细胞中NF-κB/p65蛋白和mRNA表达上调(P＜0.05);与BV6-flag组比较,BV6-ub组、BV6-K63组A549细胞中NF-κB/p65蛋白和mRNA表达显著上调(P＜0.05).结论 Smac类似物BV6可能主要通过K63位点发生泛素化促进A549细胞中NF-κB/p65表达,诱导迁移的发生.

目的:探讨SMAC类似物Birinapant预处理对大鼠肝脏缺血再灌注损伤(I/RI)的保护作用及分子机制.方法:将大鼠分为空白对照组(Blank)、对照组(Control)和Birinapant预处理组(Birinapant).Blank组不做任何处理,Control组腹腔注射30 mg/kg体重的生理盐水,1 h后构建大鼠肝脏I/RI模型,Birinapant组腹腔注射30 mg/kg体重的Birinapant,1 h后构建大鼠肝脏I/RI模型.各组在模型建立4 h后取下肝脏组织,HE染色检测各组肝脏大体形态及炎症反应;收集大鼠外周血,ELISA检测血清中TNF-α、IL-6及IL-1β炎症因子水平;提取肝脏库普弗细胞(KCs),免疫荧光检测KCs中cIAP1和TRAF3的表达;Western blot检测cIAP1和TRAF3与MAPK信号通路密切相关的JNK、p-JNK、p38及p-p38的蛋白表达.结果:与Control组相比,Birinapant预处理可以显著抑制肝脏I/RI诱导的肝组织损伤和炎症反应;Birinapant预处理也可显著降低血清中TNF-α、IL-6及IL-1β炎症因子水平;Birinapant预处理可抑制KCs中cIAP1的表达进而抑制TRAF3的降解;Birinapant预处理可抑制KCs中p-JNK和p-p38的表达进而抑制MAPK信号通路的激活.结论:预处理Birinapant可以通过抑制cIAP1的表达抑制TRAF3的降解,进而通过抑制MAPK信号通路的激活,发挥对肝脏I/RI的保护作用.

目的:探讨SMAC类似物Birinapant对小鼠非酒精性脂肪性肝炎(NASH)形成的影响及分子机制.方法:将C57BL/6小鼠分为对照组,MCD组及Birinapant组.对照组普食喂养,MCD组用MCD饲料喂养,Birinapant组在MCD喂养的同时,每隔2周腹腔注射一次Birinapant(25 mg/μg),4周后处死,取肝组织、外周血,测量小鼠及肝组织大小和质量;检测小鼠肝组织病理改变;检测小鼠血清肝功能ALT和AST水平;提取肝脏Kupffer细胞(KCs),Western blot检测KCs中cIAP1、TRAF3、p-p65和p65的蛋白表达.结果:与对照组相比,MCD组小鼠及肝组织大小和质量显著降低,肝组织结构紊乱,肝细胞空泡样改变伴大量炎症细胞浸润,血清ALT和AST水平显著增高,KCs中cIAP1和p-p65的水平显著增高,TRAF3的表达受抑制.与MCD组相比,Birinapant组小鼠及肝脏体积和质量显著高于MCD组,肝组织结构纹理相对正常,肝细胞空泡样改变显著减少,浸润的炎症细胞显著减少,肝功能异常显著改善, KCs中cIAP1和p-p65的水平显著降低,TRAF3的表达显著增高.结论:SMAC类似物Birinapant可能通过抑制KCs cIAP1的表达和TRAF3的降解,通过抑制p-p65的活化,抑制炎症因子的表达,进而缓解MCD介导的小鼠NASH形成.

目的:探讨Smac基因调控Caspase-3表达对紫杉醇耐药肺腺癌细胞株生物活性及经典凋亡信号通路的作用机制.方法:取构建好的耐药A549细胞,将其分为A549细胞(LC)组、A549细胞+Smac-NC(SN)组、A549细胞+Smac抑制剂(SI)组、A549细胞+Smac 激动剂(SM)组、A549 细胞+Caspase-3-NC(CN)组、A549 细胞+Caspase-3 抑制剂(CI)组、A549 细胞+Caspase-3 激动剂(CM)组、A549细胞+Smac激动剂+Caspase-3激动剂(MM)组;Real-time PCR法检测正常肺上皮细胞及4种肺腺癌细胞系中Smac、Caspase-3表达水平,将阴性对照、Smac、Caspase-3类似物转染至紫杉醇耐药肺腺癌细胞株,MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡,免疫印迹法检测经典凋亡信号通路表达,并分析Smac与Caspase-3的相关性.结果:肺腺癌细胞系中的Smac、Caspase-3 mRNA表达量显著低于正常肺上皮细胞系BEAS-2B(P＜0.05),其中A549的Smac、Caspase-3 mRNA值最小(P＜0.05),因此选取其作为此次实验细胞;LC组与SN组相比,细胞增殖率、凋亡率及Caspase-3、Bcl-2、Bax、Cyto-C蛋白表达基本无差异(P＞0.05),与SN组相比,SI组细胞凋亡率及Caspase-3、Bax、Cyto-C蛋白表达明显降低(P＜0.05),增殖率、Bcl-2表达明显升高(P＜0.05),与SI组相比,SM组细胞凋亡率及Caspase-3、Bax、Cyto-C蛋白表达明显升高(P＜0.05),增殖率、Bcl-2表达明显降低(P＜0.05);LC组与CN组相比,细胞增殖率、凋亡率及Caspase-3、Bcl-2、Bax、Cyto-C蛋白表达基本无差异(P＞0.05),与CN组相比,CI组细胞凋亡率及Caspase-3、Bax、Cyto-C蛋白表达明显降低(P＜0.05),增殖率、Bcl-2表达明显升高(P＜0.05),与CI组相比,CM组细胞凋亡率及Caspase-3、Bax、Cyto-C蛋白表达明显升高(P＜0.05),增殖率、Bcl-2表达明显降低(P＜0.05);SM组与CM组相比,细胞增殖率、凋亡率及Caspase-3、Bcl-2、Bax、Cyto-C蛋白表达基本无差异(P＞0.05),与 CM组相比,MM组细胞凋亡率及Caspase-3、Bax、Cyto-C蛋白表达明显升高(P＜0.05),增殖率、Bcl-2表达明显降低(P＜0.05);Smac与Caspase-3呈现正相关(r=0.470,P=0.002),组间具有显著差异.结论:Smac基因可显著改善紫杉醇耐药肺腺癌细胞株细胞生物活性,并激活经典凋亡信号通路,其作用机制可能与调控Caspase-3表达有关.