目的 探讨siRNA沉默DJ-1基因体内外对人胃癌MGC803细胞的影响机制.方法 构建沉默DJ-1基因MGC803细胞;四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法、平板克隆、细胞划痕和侵袭实验检测沉默DJ-1基因对MGC803细胞增殖、克隆形成、迁移与侵袭的影响;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白质印迹法检测DJ-1、PTEN、Akt、p-Akt、Snail、Vimentin、E-cadherin、基质金属蛋白酶9(MMP-9)与基质金属蛋白酶组织抑制因子3(TIMP3)的表达;相差显微镜观察DJ-1沉默对MGC803细胞形态学的影响;裸鼠实验检测DJ-1沉默对MGC803细胞移植瘤的影响.结果 分别用4组si-DJ-1及si-NC质粒转染MGC803细胞,其中si-DJ-1A组DJ-1 mRNA与蛋白表达下调较为显著(P＜0.001),则后续选用si-DJ-1A作为稳定沉默DJ-1基因MGC803细胞.MTT法检测结果显示,24、48和72 h后,si-DJ-1组增殖活性分别较MGC803对照组和si-NC组降低,均P＜0.001.克隆形成实验显示,si-DJ-1组克隆形成数较对照组与si-NC组减少,P＜0.001.划痕实验结果显示,si-DJ-1组迁移距离[(199.21±14.74)μm]较对照组[(302.62±17.70)μm]和si-NC组[(304.49+13.55)μm]缩短,P＜0.001.侵袭实验显示,si-DJ-1组侵袭细胞数[(44.80±5.10)个]较对照组[(83.80±5.80)个]和 si-NC 组[(82.80±5.80)个]减少,P＜0.001.与对照组和 si-NC 组相比,si-DJ-1 组 DJ-1 mRNA(F=18.350,P=0.003)、Snail mRNA(F=26.320,P＜0.001)、Vimentin mRNA(F=44.379,P＜0.001)与 MMP-9 mRNA(F=57.450,P＜0.001)下调,而 E-cadherin mRNA(F=94.529,P＜0.001)与 TIMP3 mRNA(F=16.480,P=0.004)上调;si-DJ-1 组 DJ-1(F=6.393,P=0.004)、p-Akt(F=12.980,P=0.007)、Snail(F=381.000,P＜0.001)、Vimentin(F=99.750,P＜0.001)与 MMP-9(F=126.800,P＜0.001)蛋白下调,而 PTEN(F=36.880,P＜0.001)、E-cadherin(F=181.000,P＜0.001)与TIMP3(F=217.800,P＜0.001)上调.相差显微镜显示,si-DJ-1组纤维母细胞样长梭形细胞肿瘤干细胞减少,圆形与椭圆形细胞增多,异型性下降.体内实验表明,si-DJ-1组移植瘤生长速度较对照组减慢,si-DJ-1 组移植瘤质量[(0.51±0.05)g]较对照组[(0.90±0.16)g]减小,t=5.273,P＜0.001.si-DJ-1 组较对照组 DJ-1、Ki-67、Vimentin和CD-34阳性表达降低,而PTEN和E-cadherin表达增强.结论 DJ-1沉默可通过PTEN/Akt通路体内外抑制MGC803细胞增殖、迁移、侵袭与上皮细胞-间充质转化.

目的:基于永离有丝分裂基因A相关激酶9(NEK9)/转移相关肿瘤基因家族2(MTA2)信号通路泛素化修饰探讨胃癌(GC)的转移机制.方法:使用癌症基因组图谱(TCGA)和Kaplan-Meier Plotter数据库分析NEK9表达与GC分期、预后之间的关联.体外实验中,将GC细胞分为:对照组、shNC 组、shNEK9 组、shNC+NC-OE 组、shNEK9+NC-OE 组和 shNEK9+MTA2-OE 组.分别采用 MTT 和Transwell法测定细胞的增殖、迁移和侵袭,并通过 Western blot检测 NEK9、MTA2、上皮间充质转化(EMT)标记和PI3K/AKT信号通路蛋白表达.结果:TCGA数据库分析显示,NEK9 mRNA在肿瘤组织中的表达明显上调,并且与TNM分期较晚和NEK9高表达者的预后较差密切相关.此外,NEK9在7个GC细胞系中的表达明显高于正常胃上皮GES-1细胞(P＜0.05).与对照组相比,shNEK9组细胞活力、相对集落形成、EdU阳性细胞数、侵袭和迁移细胞数均显著降低(P＜0.05).此外,在shNEK9组细胞中,E-钙粘蛋白水平上调(P＜0.05),波形蛋白水平下调(P＜0.05).通过免疫共沉淀试验证明NEK9与MTA2有相互作用.NEK9敲低加速了 HGC-27细胞中MTA2的降解,并且 MTA2泛素化在NEK9沉默的细胞中增加.与shNEK9+NC-OE组组相比,shNEK9+MTA2-OE组相对集落形成、EdU阳性细胞数和迁移和侵袭数均显著增加(P＜0.05).结论:NEK9在GC中明显上调,其敲低在体外抑制GC细胞的生长和转移.NEK9可能通过去泛素化途径稳定 MTA2进而激活PI3K-AKT信号通路来对GC细胞产生促癌影响.

目的 探讨miR-15a-5p调控Wnt信号通路对PQ致肺纤维化的影响及分子机制.方法 构建PQ诱导的16HBE细胞模型,采用高通量miRNA芯片技术和RT-qPCR筛选表达差异明显的miR-15a-5p进行实验.实验分组为:NC组(对照组):无特殊处理;PQ组:50 μmol/L PQ处理细胞72 h;miR-15a-5p组:转染miR-15a-5p过表达慢病毒的16HBE稳转株;miR-15a-5p+PQ组:50 μmol/L PQ处理稳转株细胞72 h.RT-qPCR和Western blot检测Wnt通路相关基因Wnt3 α和β-catenin、成纤维细胞标记基因Collagen I、Vimentin和α SMA,上皮细胞标记基因Occludin和CK18表达情况.构建PQ诱导的肺纤维化小鼠模型,采用Western blot、HE染色和免疫组织化学检测蛋白表达及肺组织损伤情况.数据以均数±标准差((x)±s)表示,采用独立样本t检验分析两组间数据.结果 细胞损伤模型中,Wnt3α、β-catenin、成纤维细胞标记基因Collagen I、Vimentin和α SMA表达显著上调(P＜0.05),上皮细胞标记基因Occludin和CK18显著下调(P＜0.05),过表达miR-15a-5p可靶向抑制Wnt3α表达并缓解PQ诱导的EMT进程.动物模型中,Wnt3α、β-catenin、成纤维细胞标记基因Collagen I、Vimentin和α SMA蛋白水平显著升高(P＜0.01),肺组织结构紊乱并发生纤维化,过表达miR-15a-5p可抑制Wnt3 α蛋白表达水平(P＜0.05)且改善肺组织损伤.结论 miR-15a-5p可通过调控Wnt3 α/β-catenin信号通路改善PQ导致的肺损伤,从而抑制肺纤维化的发生发展.

从药效相关性和成分差异阐释青翘与老翘改善博来霉素(BLM)诱导肺纤维化小鼠的作用差异.小鼠随机分为正常组,模型组,吡非尼酮组(50mg·kg-1),青翘低、高剂量组(1.3、2.6g·kg-1),老翘低、高剂量组(1.3、2.6 g·kg-1).采用气管滴注BLM制备肺纤维化模型,统计小鼠存活率及体质量变化;给药完成后计算肺指数,HE染色、Masson染色和天狼星红染色评价肺组织病理变化;透射电子显微镜观察肺组织超微结构;生化法测定肺组织转化生长因子-β1(TGF-β1)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、E钙黏着蛋白(E-cadherin)、羟脯氨酸(HYP)及肺泡灌洗液中白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平;RT-qPCR、Western blot法检测肺组织中基质金属蛋白酶7(MMP7)、胶原蛋白I型(collagen I)、E-cadherin、TNF-α、波形蛋白(vimentin)、TGF-β1、α-SMA表达;免疫荧光检测肺组织中α-SMA的表达;主成分分析法评价老翘与青翘改善肺纤维化的作用差异;分子对接技术分析老翘中含量高的化合物与TGF-β1受体之间的相互作用,CCK-8法检测其对TGF-β1诱导BEAS-2B和HFL1细胞模型的影响.结果显示,青翘、老翘可提高肺纤维化小鼠存活率,降低肺指数,改善肺组织病理损伤与胶原纤维沉积水平,改善小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞板层小体受损情况,降低肺泡灌洗液中IL-6、TNF-α水平,下调肺组织中HYP、MMP7、vi-mentin、collagen Ⅰ、TGF-β1、α-SMA的表达,上调E-cadherin的表达.通过主成分分析综合评价胶原纤维沉积水平,其改善程度为老翘高剂量＞老翘低剂量＞青翘高剂量＞青翘低剂量.分子对接显示羟基酪醇、咖啡酸、连翘脂素、落叶松脂素与TGF-β1受体有较好的结合活性,且可显著减轻TGF-β1诱导BEAS-2B细胞损伤,抑制TGF-β1诱导HFL1细胞增殖.综上,青翘、老翘均可有效改善BLM诱导的肺纤维化小鼠损伤,老翘在减少胶原沉积方面优于青翘,可能与老翘中羟基酪醇、咖啡酸、连翘脂素、落叶松脂素含量高于青翘有关.

该研究旨在通过观察苓桂术甘汤(Linggui Zhugan Decoction,LGZGD)含药血清对心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts,CFs)纤维化及Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路蛋白分子表达的调控机制.制备空白血清和LGZGD含药血清,胰酶-胶原酶依次消化并结合差速贴壁法分离培养原代CFs,采用免疫荧光标记鉴定原代CFs.设正常对照组,模型组,20％空白血清组,5％、10％、20％LGZGD含药血清组.分别用20％空白血清,5％、10％、20％LGZGD含药血清预处理12 h,除正常对照组,其余5组均加入过氧化氢(hydrogen peroxide,H2O2)刺激细胞,建立原代CFs纤维化模型.采用划痕愈合实验观察细胞迁移能力,ELISA法检测Ⅰ型胶原(collagen Ⅰ,Col Ⅰ)、Ⅲ型胶原(collagen Ⅲ,Col Ⅲ)含量,Western blot法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、Wnt1、糖原合酶激酶 3β(glycogen synthase kinase 3 beta,GSK-3β)、磷酸化糖原合酶激酶 3β(phospho synthase kinase 3 beta,p-GSK-3β)、β-catenin 及细胞核β-catenin 的蛋白表达,RT-qPCR 检测 β-catenin、基质金属蛋白酶9(matrix metalloprotein 9,MMP9)的基因表达,免疫荧光技术检测关键蛋白α-SMA、β-catenin的表达及定位.制备Wnt1过表达CFs,采用H2O2处理CFs.设正常对照组、模型组、20％LGZGD含药血清组、空载质粒+20％LGZGD含药血清组、Wnt1过表达+20％LGZGD含药血清组.采用ELISA法检测Col Ⅰ、Col Ⅲ的含量与其比值,Western blot法检测α-SMA和Wnt1、GSK-3β、p-GSK-3β、β-catenin及细胞核β-catenin的蛋白表达,RT-qPCR检测β-catenin、MMP9的基因表达.免疫荧光染色显示,心肌成纤维细胞Vimentin表达阳性,呈绿色,胞核为蓝色,纯度大于90％,鉴定是原代CFs.结果显示,与正常对照组相比,模型组CFs 愈合率增强,Col Ⅰ、Col Ⅲ 含量升高,Col Ⅰ/Col Ⅲ 比值增大,α-SMA、Wnt1、p-GSK-3β、β-catenin、核β-catenin 蛋白表达上调,GSK-3β蛋白表达降低,β-catenin、MMP9 mRNA表达显著升高,β-catenin、α-SMA荧光强度明显增强,表达量明显增多;与模型组相比,5％、10％、20％LGZGD含药血清能显著抑制细胞迁移能力,减少Col Ⅰ、Col Ⅲ的含量,降低Col Ⅰ/Col Ⅲ比值,下调α-SMA、Wnt1、p-GSK-3β、β-catenin、核 β-catenin 蛋白表达,提高 GSK-3β 表达,减少 β-catenin、MMP9 的 mRNA 表达,降低β-cate-nin、α-SMA荧光强度和表达量;与空载质粒+20％LGZGD含药血清组比,过表达Wnt1后,LGZGD作用被显著逆转.LGZGD能够减少胶原纤维过度沉积,抑制成纤维细胞过度增生,改善心肌纤维化进程.LGZGD改善心肌纤维化的作用与调控Wnt/β-catenin通路,减少胶原沉积,保护心肌细胞有关.

目的 探讨AURKA对多发性骨髓瘤(MM)细胞增殖、凋亡、周期改变及对药物敏感性的影响,并分析内在机制.方法 人多发性骨髓瘤细胞株 RPMI8226 和 U266 分别转染 smart silencer NC(ssi-NC)和 smart silencer AURKA(ssi-AUR-KA),分为ssi-NC组、ssi-AURKA组和空白组,采用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)和蛋白质印迹实验检测3组细胞AURKA mRNA和AURKA蛋白相对表达量,细胞计数试剂盒8(CCK8)检测其细胞增殖活性,流式细胞术检测ssi-NC组、ssi-AURKA组细胞周期变化和凋亡率,CCK 8法检测其对硼替佐米和地塞米松的药物敏感性,蛋白质印迹实验检测Wnt信号通路相关因子及上皮细胞-间充质转化(EMT)相关蛋白表达.结果 RPMI8226细胞ssi-AURKA组蛋白相对表达量为 0.58±0.09,低于空白组(1.00±0.10)和 ssi-NC 组(1.00±0.09),F=20.84,P＜0.001;U266 细胞 ssi-AURKA 组蛋白相对表达量为0.57±0.07,低于空白组(1.00±0.04)和ssi-NC组(1.07±0.08),F=46.19,P＜0.001.细胞增殖活性实验结果显示RPMI8226细胞空白组、ssi-NC组、ssi-AURKA组相对活性差异有统计学意义,F时间=3 966.12,P时间＜0.001;F组别=363.15,P组别＜0.001;F时间×组别=48.03,P时间×组别＜0.001.U266 细胞空白组、ssi-NC 组、ssi-AURKA 组相对活性差异有统计学意义,F时间=2 452.32,P时间＜0.001;F组别=236.91,P组别＜0.001;F时间×组别=33.47,P时间×组别＜0.001.RP-MI8226细胞和U266细胞中ssi-AURKA组S期均增加,t值分别为12.28和14.64,均P＜0.001;G0/G1期均降低,t值分别为 23.33 和 22.98,均 P＜0.001.RPMI8226 细胞(t=16.23,P＜0.001)和 U266 细胞(t=18.44,P＜0.001)中,与 ssi-NC 组比较,ssi-AURKA组细胞总凋亡率增加.药物敏感性实验结果显示,RPMI8226细胞ssi-NC组、ssi-AURKA组、ssi-NC+B+D组、ssi-AURKA+B+D组细胞活性差异有统计学意义,F时间=618.82,P时间＜0.001;F组别=1 373.51,P组别＜0.001;F时间×组别=228.70,P时间×组别＜0.001.U266 细胞 ssi-NC组、ssi-AURKA组、ssi-NC+B+D组、ssi-AURKA+B+D组细胞活性差异有统计学意义,F时间=617.83,P时间＜0.001;F组别=1 352.84,P组别＜0.001;F时间×组别=155.81,P时间×组别＜0.001.蛋白质印迹实验结果显示,RPMI8226 细胞中 ssi-AURKA 组 E-cadherin 表达升高,t=5.11,P=0.007;Vimentin、β-catenin 和Wnt3A 表达降低,t 值分别为 2.86、3.87 和 7.56,P 值分别为 0.046、0.018 和 0.002;U266 细胞中 ssi-AURKA 组 E-cadherin表达升高,t=10.02,P＜0.001;Vimentin、β-catenin、Wnt3A 表达降低,t 值分别为 3.71、2.82 和 3.30,P 值分别为 0.020、0.047和0.030.结论 抑制AURKA表达可抑制MM细胞增殖,导致细胞周期的改变,诱导细胞凋亡,增加药物敏感性;AURKA可能通过Wnt/β-Catenin信号通路影响MM细胞EMT过程进而影响细胞增殖和凋亡.

目的 探讨YAP1-KMT2A融合高级别肉瘤的临床病理特征、诊断和鉴别诊断.方法 对1例左侧腋下YAP1-KMT2A融合高级别肉瘤进行组织学观察、免疫组化染色、RNA-seq及FISH检测YAP1基因重排情况,并结合相关文献讨论其临床病理特征.结果 肿瘤呈结节状生长,境界欠清,大小10.3 cm ×5.5 cm × 5.0 cm.肿瘤细胞于致密胶原基质中浸润性生长,部分区呈硬化性上皮样肉瘤样结构.细胞以上皮样为主,胞质丰富、透亮,核分裂象多见,伴多灶性凝固性坏死.间质血管较丰富.肿瘤细胞vimentin、Cyclin D1、EMA 等均(+),MUC4、WT1、ERG等(-),Ki67 增殖指数约80％.RNA-seq检测出3种不同融合方式的YAP1-KMT2A基因,FISH检测示YAP1基因重排阴性.结论 YAP1-KMT2A融合高级别肉瘤是一种较为罕见的KMT2A重排肉瘤,需与硬化性上皮样肉瘤等多种肿瘤鉴别,其确诊有赖于分子检测.

目的 探讨成人肝脏胚胎性肉瘤(embryonal sarcoma of the liver,ESL)的临床病理特征、诊断、鉴别诊断及预后.方法 回顾性分析4例成人ESL的临床影像学资料、组织特征及免疫表型,并进行随访及文献复习.结果 4例ESL患者年龄25～49岁,男女比为3:1;4例均位于肝右叶;CT示巨大类圆形低密度或不规则混杂密度肿块,边界清,其中1例误诊为血管平滑肌脂肪瘤,1例误诊为肝细胞癌,另2例未给出明确诊断.肿物呈实性或囊实性包块,切面鱼肉状,囊内多伴出血、坏死.镜下肿瘤由不规则梭形或星形细胞和疏松黏液样基质构成,散在少量多核巨细胞或瘤巨细胞.瘤细胞核深染,具有高度非典型性及多量核分裂象,特征性表现为可见大小不等的嗜酸性小体,PAS染色阳性.免疫表型:所有病例瘤细胞p53、α1-抗胰蛋白酶(α1-AT)、vimentin等阳性,Ki67增殖指数50％～80％.4例均行手术完整切除,随访4例患者有2例于1年内死亡.结论 ESL是成人罕见的高度恶性肿瘤,临床易误诊,确诊依靠于病理学检查,治疗以手术切除肿瘤为首选,手术前、后联合化疗等综合治疗可提高疗效.

目的:探讨过氧化物酶体膜蛋白4(PXMP4)对肝细胞癌(HCC)细胞迁移和侵袭及上皮间质转化(EMT)进程的影响.方法:采用生物信息学和免疫组织化学方法分析HCC组织中PXMP4的表达,分析其与患者临床病理特征的相关性.在HCCLM3和MHCC97H细胞中干扰PXMP4,在Huh7和MHCC97L细胞中过表达PXMP4,利用WB和qPCR法验证干扰/过表达效率.利用CCK-8、划痕愈合实验和Transwell侵袭实验检测干扰/过表达PXMP4对HCC细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响,采用WB法检测干扰/过表达PXMP4或0、5、10和20 μmol/L U0126处理对HCC细胞中N-cadherin、E-cadherin、vimentin、细胞外信号调节激酶(ERK)、p-ERK表达的影响.结果:生物信息学和免疫组织化学分析显示,HCC组织中PXMP4呈高表达(P<0.05).临床病理分析发现,PXMP4的表达与肿瘤分化程度有关联(P<0.05).在HCC细胞中,干扰PXMP4后抑制细胞增殖、侵袭和EMT进程(P<0.05);反之,过表达PXMP4后促进HCC细胞增殖、侵袭及EMT进程(P<0.05).此外,PXMP4通过激活ERK1/2信号通路促进HCC细胞EMT进程,U0126处理同样能够抑制HCC细胞EMT进程.结论:PXMP4在HCC组织中呈高表达且与HCC细胞分化有关联,PXMP4通过激活ERK1/2信号通路促进HCC细胞EMT进程.

目的:探寻白术内酯Ⅲ(AT-Ⅲ)的关键靶点,探究肌动蛋白相关蛋白2/3(Arp2/3)抑制溃疡性结肠炎(UC)的作用机制.方法:采用有限酶切-质谱法(lip-SMap)筛选大鼠小肠隐窝上皮细胞(IEC-6)特征蛋白,进行基因本体(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析,确定AT-Ⅲ的关键靶点.脂多糖(LPS)与IEC-6共孵育模拟UC模型,酶联免疫吸附实验(ELISA)检测白细胞介素-6(IL-6),肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量;划痕实验测定IEC-6迁移速率;蛋白质印迹法测定上皮钙黏素(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)和Arp2/3含量;分子对接评估AT-Ⅲ与关键靶点的结合能力.结果:基于lip-SMap获得的特征蛋白参与调控磷脂酰肌醇3激酶-丝苏氨酸激酶(PI3K-AKT)信号通路和紧密连接(TJ)信号通路;与对照组比较,LPS组中IL-6和TNF-α释放量升高(均P＜0.05),迁移速率变快(P＜0.05),E-cadherin和Vimentin的表达都有不同程度的影响(均P＜0.05);与LPS组比较,LPS+CK666+AT-Ⅲ组显著降低IL-6和TNF-α含量(均P＜0.01),有效逆转LPS诱导的细胞迁移变化及E-cadherin和Vimentin表达(均P＜0.05);分子对接显示,Arp2/3与AT-Ⅲ有较好的结合活性.结论:Arp2/3作为AT-Ⅲ的关键靶点,可通过上皮细胞-间充质转化(EMT)缓解LPS诱导的UC.