目的 研究D-半乳糖(D-galactose,D-gal)对小鼠睾丸TM4支持细胞连接功能损伤以及淫羊藿素(icaritin,ICT)的改善作用机制.方法 首先将TM4细胞分为正常对照组、不同浓度D-gal处理组,Western blot检测TM4细胞连接功能相关蛋白(ZO-1、Occludin、β-catenin 和 Cx43)以及 ERα/FAK信号通路相关蛋白(ERα、FAK和pY397-FAK)表达水平的变化;随后MTT筛选ICT药物浓度,并将TM4细胞分为正常对照组、D-gal处理组、D-gal处理+不同浓度ICT组,Western blot检测上述蛋白表达水平变化;分子对接研究ERα与ICT之间的相互作用,并预测两者之间的亲和力;最后将TM4细胞分为正常对照组、D-gal处理组、ERα抑制剂组、D-gal+ICT组、ERα抑制剂+ICT组,Western blot检测上述蛋白表达水平的变化.结果 D-gal可浓度依赖性下调连接功能相关蛋白(ZO-1、Occludin、β-catenin 和 Cx43)以及 ERα/FAK信号通路相关蛋白(ERα、FAK和pY397-FAK)表达水平;给予ICT药物后,上述蛋白表达水平均明显上调;ERα和ICT分子对接结果显示,ERα的Asp351氨基酸残基与ICT之间形成2个距离为3.4 ?和2.4 ?的氢键,且两者之间的对接结合能小于-7 kcal·mol-1;ERα抑制剂处理TM4细胞后,上述蛋白表达水平均明显下调,给予ICT后,上述蛋白表达水平未有明显变化.结论 D-gal可导致TM4细胞连接功能损伤,而ICT可改善其损伤,机制可能与上调ERα/FAK信号通路相关.

目的 评价健脾消渴方对2型糖尿病大鼠的药效,并探讨其可能的作用机制.方法 40只SD大鼠随机分为正常对照组、模型对照组、健脾消渴方组及盐酸二甲双胍组,每组10只,STZ+高脂饮食建立2型糖尿病大鼠模型,给予相应药物,持续4周.实验结束后取材,考察大鼠空腹血糖变化情况;ELISA法检测大鼠血清中白细胞介素-1(interleukin-1β,IL-1β)、白细胞介素-10(interleukin-10,IL-10)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、D-氨基酸氧化酶(D-amino acid oxidase,DAO)、D-乳酸含量;考察血清血脂四项[甘油三酯(triglycerides,TG)、总胆固醇(total cholesterol,TC)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)]含量;HE染色法观察各组大鼠胰腺及回肠的组织形态学改变;免疫荧光法检测大鼠回肠L细胞的免疫荧光法检测大鼠回肠L细胞的胰高糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)阳性表达;Western blotting法检测大鼠结肠组织中紧密连接蛋白(occludin)、闭锁小带蛋白-1(zonula occludens-1,ZO-1)、黏蛋白2(Muc2)蛋白相对表达.结果 健脾消渴方可有效降低2型糖尿病大鼠的空腹血糖,下调血清中IL-1β、TNF-α含量,上调IL-10含量,抑制DAO、D-乳酸含量;同时,显著性下调TG、TC、LDL-C含量,但在提高HDL-C含量方面上仅具有趋势性;此外,健脾消渴方可改善大鼠胰腺及回肠损伤,提高GLP-1阳性表达,并有效降低2型糖尿病大鼠结肠occludin、ZO-1、Muc2蛋白相对表达.结论 健脾消渴方对2型糖尿病大鼠具有较好的治疗效果,其作用可能与改善血清炎症、调节血脂,减轻肠道功能损伤,改善肠道屏障通透性与保护肠道屏障生理结构等作用有关.

目的 探讨葛根芩连汤对肠道湿热证泄泻模型小鼠肠道机械屏障的作用机制.方法 选取 15只SPF级雄性昆明小鼠,随机分为正常组 5 只和模型组 10只.采取"高糖高脂+高温高湿+白酒稀释液+冰水法"复制肠道湿热证泄泻小鼠模型,造模成功的10 只小鼠随机分为自愈组和治疗组,每组5只.治疗组灌胃5.07 g/(kg·d)葛根芩连汤水煎液,正常组和自愈组给予等容积无菌水,连续灌胃4d后无菌提取各组小鼠十二指肠、空肠和回肠肠段.观察各组小鼠一般状态;HE染色观察各组肠段形态;采用Image J图像处理软件测量各组绒毛长度(villus height,VH)、隐窝深度(crypt depth,CD),计算VH与CD的比值(绒隐比,V/C)、杯状细胞数目和紧密连接蛋白平均光密度值(average optical density value,AOD);采用二步法免疫组织化学法分析各肠段密封蛋白 1(Claudin 1)、闭合蛋白(Occludin)和紧密连接蛋白-1(zonula occluden-1,ZO-1)的表达.结果 正常组小鼠毛发有光泽,精神状态佳,饮水量、肛温和二便均正常;治疗组小鼠毛发洁白、精神状态良好、大便颗粒饱满、肛温恢复正常、泄泻症状消失;自愈组小鼠毛发暗淡、肛温高、大便含水量较多、挤压不成型.与正常组相比,自愈组十二指肠、空肠和回肠肠黏膜结构部分受损,小肠腺出现萎缩,出现炎性症状.与自愈组相比,治疗组肠黏膜结构较清晰,肠上皮细胞和固有层细胞排列紧密,炎症情况明显改善.与正常组相比,自愈组十二指肠CD升高(P<0.01),十二指肠V/C和杯状细胞数降低(P<0.05,P<0.01);治疗组十二指肠V/C降低(P<0.05).与正常组相比,自愈组空肠、回肠VH和V/C均明显降低(P<0.05,P<0.01).与自愈组相比,治疗组十二指肠CD显著降低(P<0.01),十二指肠、回肠V/C升高(P<0.05,P<0.01).十二指肠肠段,与正常组相比,自愈组和治疗组Claudin 1、Occludin、ZO-1 AOD值降低(P<0.05,P<0.01);与自愈组相比,治疗组Claudin 1、Occludin、ZO-1 AOD值显著升高(P<0.01).与正常组比较,自愈组空肠、回肠肠段Occludin AOD值明显降低(P<0.01).与自愈组比较,治疗组空肠肠段Claudin 1 AOD值升高(P<0.05),回肠肠段Occludin AOD值明显升高(P<0.01).结论 葛根芩连汤可改善肠道湿热证泄泻小鼠肠道炎症水平、促进紧密连接蛋白Claudin1、Occludin和ZO-1 的表达,其机制可能与修复肠道机械屏障功能有关.

目的:探究链脲佐菌素（STZ）诱导的1型糖尿病（T1DM）小鼠在不同时期的肠道功能、血清相关抗体、脾脏细胞因子谱表达与肠道菌群的演变。方法:取3~4周龄雄性C57BL/6小鼠28只，采用随机抽样法分为对照组（NC组，13只）和STZ组（15只）。STZ组连续5 d空腹腹腔注射STZ 50 mg·kg -1·d -1，NC组注射等体积溶剂。实验第3周测定随机血糖>16.7 mmol/L为建模成功，定义为基线水平，两组各取6只小鼠处死，剩余小鼠观察4周，即实验第7周（实验终点）处死剩余小鼠。每周测量体重、随机血糖和每日饮水量。采用酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测脾脏细胞因子谱［肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、干扰素-γ（IFN-γ）、白细胞介素（IL）-6、IL-17、IL-4、IL-10、转化生长因子-β（TGF-β）］、血清相关抗体［胰岛细胞抗体（ICA）、胰岛素自身抗体（IAA）与谷氨酸脱羧酶抗体（GADA）］和结肠紧密连接蛋白1（ZO-1）的表达；采用流式细胞术检测脾脏CD4 +FoxP3 +调节性T细胞（Treg）水平；对粪便进行16SrRNA菌群测序分析。组间比较采用独立样本 t检验。采用Spearman相关分析法分析CD4 +FoxP3 +Treg细胞、肠道菌群、各免疫生化指标之间的相关性。 结果:流式细胞术与ELISA结果显示，在基线水平，与NC组相比，STZ组小鼠脾脏CD4 +FoxP3 +Treg、TGF-β、TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-17与血清ICA、IAA表达水平增加，脾脏IL-4、IL-10表达水平下降（均 P<0.05）；在实验终点，与NC组相比，STZ组小鼠脾脏TNF-α、IFN-γ、IL-6，血清GADA、ICA与结肠ZO-1表达水平增加（均 P<0.05）。16SrRNA测序结果显示，与NC组相比，STZ组乳杆菌属丰度明显下降（ P<0.05），拟杆菌属、阿克曼菌属、普雷沃菌属和颤螺菌属丰度明显上升（均 P<0.05）。Spearman相关性分析结果表明，乳杆菌属丰度与IL-10水平呈正相关（ r=0.65， P<0.05），与TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-17和GADA水平呈负相关（ r值-0.61~-0.58，均 P<0.05）；颤螺菌属丰度与TGF-β、TNF-α、IL-6和IAA水平呈正相关（ r值0.55~0.72，均 P<0.05），与IL-10水平呈负相关（ r=-0.59， P<0.05）。 结论:多次低剂量STZ诱导的T1DM小鼠可能存在CD4 +Foxp3 +Treg及TGF-β介导的负性免疫调节和以增加结肠ZO-1表达的肠道调节，其中颤螺菌属与乳杆菌属丰度改变可能参与免疫调节。

目的:探讨萝卜硫素（sulforaphane, SFN）减轻猪复苏后肠黏膜损伤的保护效果及作用机制。方法:本实验在浙江大学实验动物中心进行。24头国产健康雄性大白猪，采用随机数字表法分为假手术（Sham）组、心肺复苏（cardiopulmonary resuscitation, CPR）组、SFN组，其中Sham组6头、另两组各9头。CPR组和SFN组选择10 min心脏骤停与6 min CPR的造模参数建立猪CPR模型。SFN组在复苏后5 min时，经股静脉泵入SFN 2 mg/kg、共计10 min。在复苏后1 h、2 h、4 h和24 h时，采集静脉血标本，应用ELISA法检测肠型脂肪酸结合蛋白（intestinal fatty acid binding protein, IFABP）和二胺氧化酶（diamine oxidase, DAO）的血清水平。然后，各组选择6头猪实施安乐死，获取回肠末端组织标本，应用TUNEL法检测细胞凋亡水平，生化法检测超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）和过氧化氢酶（catalase, CAT）活性、还原型谷胱甘肽（glutathione, GSH）和丙二醛（malondialdehyde, MDA）含量，ELISA法检测过氧化物4-羟基壬烯醛（4-hydroxy-2-nonenal, 4-HNE）含量，免疫荧光染色法检测活性氧物质（reactive oxygen species, ROS）荧光强度，Western blot法检测黏连蛋白-１（zonula occluden-1, ZO-1）、闭合蛋白（occludin）、核因子Ｅ2相关因子2（nuclear factor E2-related factor 2, Nrf2）和血红素加氧酶-1（heme oxygenase-1, HO-1）表达水平。三组间的计量资料比较，采用单因素方差分析，进一步两两比较采用Bonferroni事后检验。结果:复苏后观察期间，CPR组和SFN组肠黏膜损伤标志物IFABP和DAO的血清水平均高于Sham组（均 P<0.05）。然而，SFN组IFABP在复苏后2 h、4 h和24 h时、DAO在复苏后1 h、2 h、4 h和24 h时均低于CPR组（均 P<0.05）。复苏后24 h时，CPR组和SFN组细胞凋亡指数高于Sham组，SOD和CAT活性、GSH含量均降低，MDA和4-HNE含量、ROS产物均升高，ZO-1和occludin表达下调、Nrf2和HO-1表达上调（均 P<0.05）。但是，SFN组细胞凋亡指数低于CPR组，SOD和CAT活性、GSH含量均升高，MDA和4-HNE含量、ROS产物均降低，ZO-1、occludin、Nrf2和HO-1表达均上调（均 P<0.05）。 结论:SFN具有积极减轻猪复苏后肠黏膜损伤的保护作用，其机制可能与激活Nrf2/HO-1通路后抑制组织氧化应激与细胞凋亡有关。

目的:基于沉默信息调节因子1/叉头转录因子O1(SIRT1/FoxO1)信号通路探讨高压氧(HBO)对脑缺血再灌注(CIR)大鼠血脑屏障(BBB)的保护作用。方法:选取雄性Wistar大鼠40只，按照随机数字表法将其分成假手术组(Sham组)、模型组(CIR组)、CIR+HBO组、CIR+HBO+ SIRT1抑制剂(EX527)组，每组10只。采用改良线栓法建立大鼠右侧大脑中动脉栓塞模型，Sham组大鼠不进行结扎和线栓导入，CIR+HBO组和CIR+HBO+EX527组予以HBO干预，CIR+HBO+EX527组在此基础上再予以EX527处理。CIR+HBO组和CIR+HBO+EX527组于再灌注1 h、9 h、21 h、45 h、69 h进入HBO舱，期间行HBO治疗5次。在处死动物前1 h，经尾静脉注射2%伊文思兰(EB)，采用比色法、逆转录-聚合酶链(RT-PCR)和Western blot法分别检测再灌注72 h大鼠海马区脑组织EB含量，SIRT1、FoxO1、ZO-1、Occludin、Claudin-5 mRNA及蛋白表达变化。结果:CIR 72 h，CIR组、CIR+HBO组和CIR+HBO+EX527组大鼠海马区脑组织EB含量均较Sham组明显增加( P<0.05)，CIR+HBO+XE527组大鼠海马区脑组织EB的含量较CIR+HBO组显著增加( P<0.05)。CIR 72 h，CIR组、CIR+HBO组和CIR+HBO+EX527组大鼠海马区脑组织SIRT1、FoxO1、ZO-1、Occludin、Claudin-5 mRNA表达及其相应蛋白表达较Sham组均显著降低( P<0.05)，CIR+HBO+EX527组大鼠海马区脑组织SIRT1、FoxO1、ZO-1、Occludin、Claudin-5 mRNA表达及其相应蛋白表达较CIR+HBO组显著降低( P<0.05)。 结论:HBO可以通过SIRT1/FoxO1通路增加紧密连接蛋白的表达，从而在CIR损伤中对BBB起到保护作用。

目的:研究急性高眼压诱导小鼠视网膜缺血-再灌注损伤模型中血-视网膜外屏障的破坏情况。方法:选取SPF级雄性C57BL/6J小鼠57只，采用随机数表法将小鼠随机分为对照组和高眼压组，其中对照组25只，高眼压组32只，剔除建模失败或建模不佳的小鼠后，每组最终纳入20只，均选取左眼为实验眼。高眼压组采用质量分数0.9%氯化钠溶液前房灌注法建立小鼠急性高眼压诱导的视网膜缺血-再灌注损伤模型，对照组仅作前房穿刺。采用动物光相干断层扫描法检测视网膜厚度变化；采用免疫荧光染色法检测视网膜组织中紧密连接蛋白1(ZO-1)分布变化；采用胰蛋白酶消化法检测视网膜毛细血管退化程度；采用苏木精-伊红染色法观察视网膜炎性细胞浸润情况。结果:与对照组比较，高眼压组视网膜色素上皮(RPE)层结构紊乱，伴有明显渗出，局部神经上皮层脱离、隆起。高眼压组小鼠视网膜全层厚度为(235.8±5.3)μm，较对照组的(213.3±3.9)μm明显增厚，差异有统计学意义( t＝3.427， P＝0.009)。小鼠RPE层中ZO-1主要定位在细胞膜上，少部分在细胞质中，建模后2 d，高眼压组ZO-1出现明显内化，细胞膜上ZO-1减少，细胞质中ZO-1增多，整体分布紊乱。建模后7 d，高眼压组视网膜毛细血管出现退行性变，退化的毛细血管数量明显增加，高眼压组退化的毛细血管数量为(201.0±13.2)根，明显多于对照组的(11.2±1.7)根，差异有统计意义( t＝14.280， P<0.01)。苏木精-伊红染色结果显示，高眼压组小鼠视网膜中可见炎性细胞浸润，主要是嗜中性粒细胞，浸润的炎性细胞主要位于内界膜下。 结论:急性高眼压诱导小鼠视网膜缺血-再灌注损伤使视网膜外屏障受到破坏，引起外周循环中粒细胞的浸润及视网膜水肿，视网膜毛细血管退化。

目的:观察脂肪酸结合蛋白4(Fabp4)在创伤性脑损伤(TBI)后血脑屏障破坏中的作用，并探讨其中的调控机制。方法:采用控制性皮质冲击法进行小鼠TBI造模，C57/BL雄性小鼠由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供，将小鼠按照随机数字表法随机分为Sham组和4个不同时间点TBI组(术后6 h、1 d、3 d和7 d)，每组各6只，通过蛋白质印迹法(Western blot)和免疫荧光检测Fabp4的表达变化。然后将小鼠随机分为Sham组、TBI组、TBI+Vehicle组和TBI+BMS309403(Fabp4选择性抑制剂)干预组，每组各6只，采用伊文斯蓝实验和脑含水量测定实验评估各组血脑屏障改变，采用Western blot检测各组基质金属蛋白酶(MMP)-9、ZO-1和Occludin蛋白水平，采用mNSS和水迷宫实验评估各组小鼠神经功能。两组比较采用 t检验，多组间比较采用方差分析。 结果:TBI组损伤周围皮层组织Fabp4蛋白表达水平在第3天高于Sham组最显著(条带相对灰度值：2.243±0.231比1.000±0.102， t＝9.334， P<0.01)，且主要表达于小胶质细胞。TBI+BMS309403组中伊文斯蓝的含量低于TBI+溶剂组[(15.960±0.829) μg/g脑组织比(22.960±2.064) μg/g脑组织， t＝3.146， P<0.05]，而且TBI+BMS309403组脑组织含水量低于TBI+溶剂组[(80.000±0.578)%比(83.670±0.871)%， t＝3.479， P<0.05]。TBI+BMS309403组MMP-9的表达蛋白表达水平低于TBI+溶剂组(条带相对灰度值：1.253±0.086比1.677±0.098， t＝3.248， P<0.05)，同时，TBI+BMS309403组ZO-1和Occludin的表达水平高于TBI+溶剂组(条带相对灰度值：0.910±0.044比0.667±0.079， t＝2.851， P<0.05；条带相对灰度值：0.727±0.106比0.467±0.075， t＝2.843， P<0.05)。TBI+BMS309403组小鼠在3 d和7 d的mNSS评分低于TBI+溶剂组[(5.500±0.428)分比(8.333±0.494)分， t＝4.332， P<0.01；(5.000±0.516)分比(7.500±0.500)分， t＝3.478， P<0.01]。水迷宫实验发现，TBI+BMS309403组小鼠的逃离潜伏期在3 d和7 d明显缩短于TBI+溶剂组[(33.833±1.740) s比(40.833±1.400) s， t＝3.134， P<0.05；(25.167±1.621) s比(33.167±1.327) s， t＝3.819， P<0.01]。 结论:Fabp4促进TBI后血脑屏障的破坏，抑制Fabp4能够改善TBI后神经功能缺陷。

目的:探究脓毒症对血脑屏障通透性的影响。方法:采用盲肠结扎穿孔术建立脓毒症大鼠模型。根据干预时间随机（随机数字法）分组：假手术组、脓毒症1 d组、脓毒症4 d组、脓毒症7 d组。采用荧光素钠检测血脑屏障的通透性变化；采用Western blot和免疫荧光方法检测脑微血管内皮细胞紧密连接蛋白的表达变化。结果:和假手术组大鼠相比较，脓毒症组的大鼠呼吸急促，精神萎靡、反应迟钝，活动量少、进食饮水少，腹胀明显，排稀便。腹腔解剖可见肠系膜黏连，近端肠管扩张，盲肠结扎部位颜色暗红且表面有脓液渗出，整个腹腔可见血性渗出液。和假手术组大鼠相比较，脓毒症组的大鼠体质量下降，随着脓毒症的病程发展，大鼠体质量持续降低，脓毒症7 d组的大鼠体质量最低，且明显低于脓毒症4 d（ P < 0.05）、脓毒症1 d（ P < 0.05）以及假手术组（ P < 0.05）的大鼠。和假手术组大鼠相比较，盲肠结扎穿孔1 d后大鼠脑组织中的荧光素钠的渗漏显著增加（ P < 0.05）。随着脓毒症的病程发展，荧光素钠渗漏含量持续增加。脓毒症7 d的大鼠脑组织中的荧光素钠含量最高，并且明显高于脓毒症4 d、脓毒症1 d以及假手术组的大鼠（均 P < 0.05）。和假手术组大鼠相比较，盲肠结扎穿孔1 d后大鼠脑组织的脑微血管内皮细胞紧密连接蛋白Claudin-5、Occludin和ZO-1的蛋白表达量明显降低（均 P < 0.05）。随着脓毒症的病程发展，紧密连接蛋白的表达量持续降低。脓毒症7 d的大鼠脑组织中的紧密连接蛋白Claudin-5、Occludin、ZO-1的表达量最低，并且明显低于脓毒症4 d、脓毒症1 d以及假手术组的大鼠（均 P < 0.05）。 结论:脓毒症可诱导大鼠的血脑屏障通透性增加，并且脓毒症持续的时间越久，血脑屏障的通透性越高。

目的:观察大鼠多系分化持续应激(Muse)细胞对肠上皮细胞间紧密连接结构的保护作用。方法:贴壁筛选法自大鼠(6只，购自中国食品药品检定院)股骨内分离大骨髓间充质干细胞(BMMSCs)，长时间胰蛋白酶孵育法(LTi)自BMMSCs中分离大鼠Muse细胞，流式细胞术标记如白细胞分化抗原(CD)29、CD34、CD90等及特异阶段胚胎抗原-3(SSEA-3)抗体；免疫组织化学法标记Nanog同框蛋白(NANOG)等抗体，定向诱导分化后标记α-甲胎蛋白(AFP)等鉴定其多能分化能力；重组肿瘤坏死因子-α(TNF-α)建立体外肠上皮细胞损伤损伤模型；与Muse细胞共培养后检测细胞增殖能力及桥接蛋白-1(ZO-1)的表达水平及形态，组间比较采用 t检验。 结果:LTi后，大鼠BMMSCs中(2.57±0.57)%能够形成特征性的Muse细胞簇；流式细胞术结果表明，Muse细胞保留了BMMSCs表面分子特征，SSEA-3的阳性细胞比例[(73.2±1.4)%]显著高于BMMSCs[(2.3±0.3)%]；免疫荧光实验表明，培养的Muse细胞阳性表达NANOG等多能分化标记，定向诱导分化后分别能够表达AFP等分化标记；Muse细胞与TNF-α炎症损伤的肠上皮细胞共培养后，其增殖细胞比例[(40.06±1.04)%]高于损伤[(23.10±2.05)%]组的细胞( t＝12.79， P<0.05)及ZO-1蛋白的相对表达水平(0.55±0.03、0.27±0.01， t＝13.03， P<0.05)。 结论:大鼠Muse细胞具有更加理想的保护炎症损伤肠上皮细胞紧密连接结构的作用。