目的:确定钩端螺旋体LA_RS06960基因产物蛋白具有磷酸二酯酶(PDE)活性，确定该酶降解的底物细菌二核苷酸可激活巨噬细胞固有免疫因子。方法:PCR扩增钩端螺旋体56601株LA_RS06960基因并构建原核表达系统。通过Ni-NTA亲和层析法提纯表达的目的重组蛋白rPDE。高效液相色谱法(HPLC)检测rPDE降解细菌二核苷酸c-di-AMP或5′-pApA底物为AMP的活性。荧光定量RT-PCR法检测钩端螺旋体感染巨噬细胞过程中钩体LA_RS06960基因和细胞固有免疫相关因子基因mRNA水平变化。采用荧光定量RT-PCR法和ELISA法检测细菌二核苷酸影响细胞固有免疫相关因子表达及分泌水平变化。结果:成功构建钩端螺旋体LA_RS06960基因原核表达系统，纯化的rPDE具有体外降解5′-pApA和c-di-AMP为AMP的功能。钩端螺旋体感染巨噬细胞过程中，钩体LA_RS06960基因表达水平显著下降，巨噬细胞IFN-β、TNF-α、IL-6以及IL-1β编码基因表达水平均显著升高。LA_RS06960编码的PDE酶降解底物细菌二核苷酸可诱导IFN-β和IL-6基因mRNA表达水平或蛋白分泌水平的升高。结论:LA_RS06960基因产物PDE具有PDE活性，其水解底物细菌二核苷酸激活巨噬细胞固有免疫应答。

目的:寻找和鉴定钩端螺旋体中编码第二信使c-di-AMP结合蛋白KtrA，并探究c-di-AMP-KtrA/B系统的功能及调控机制。方法:采用PCR扩增 ktrA基因并克隆入pET42a质粒获得pET42a ktrA原核表达载体，将其转入表达宿主菌中获得表达rKtrA的工程菌 E. coli BL21DE3 pET42a-ktrA。通过亲和层析法提纯上述工程菌表达的重组蛋白rKtrA后，运用BIAcore技术检测rKtrA与c-di-AMP的结合能力。采用细菌双杂交法检测钩端螺旋体Ktr系统中KtrA与KtrB的结合能力以及外源c-di-AMP对其结合的调控机制。通过在钾离子转运功能缺失大肠埃希菌LB2003株中回补相关基因，分析c-di-AMP-KtrA/B通路功能。 结果:成功构建钩端螺旋体 ktrA基因原核表达工程菌，纯化的rKtrA可与c-di-AMP特异性结合；KtrA可与KtrB发生相互作用，该结合作用可被c-di-AMP解离；KtrA/B系统参与调控钾离子的摄取，该系统功能受c-di-AMP负调控。 结论:钩端螺旋体KtrA为c-di-AMP结合蛋白，c-di-AMP-KtrA/B系统参与调控钾离子的转运。

目的:探讨干扰素基因激活因子(STING)激动剂对皮肤黑色素瘤细胞的放射增敏作用及其机制。方法:为检测STING激动剂环二腺苷酸(c-di-AMP)对人皮肤黑色素瘤细胞(A375)辐射后的影响，将人皮肤黑色素瘤细胞A375分为空白对照组、10 μmol/L c-di-AMP处理组、X射线照射组、照射+c-di-AMP组。通过CCK-8法、乳酸脱氢酶(LDH)释放实验、平板克隆形成实验以及流式细胞术等手段，检测c-di-AMP对A375细胞的放射增敏作用。采用Western blot检测细胞死亡相关蛋白表达。结果:10 μmol/L的c-di-AMP联合10 Gy X射线照射时可见明显的放射增敏效应，A375细胞活力较X射线照射组显著下降( t＝5.11， P<0.05)，细胞毒性显著增加( t＝10.15， P<0.05)，细胞凋亡显著增加( t＝4.41， P<0.05)，细胞克隆增殖能力显著降低( t＝6.30、3.55、5.45、3.55， P<0.05)。c-di-AMP的放射增敏比(SER)为1.88。10 μmol/L的c-di-AMP联合10 Gy X射线后细胞死亡相关信号通路(细胞凋亡、细胞坏死、铁死亡)相关蛋白表达较X射线照射组显著上调。 结论:采用c-di-AMP激活STING可显著增加电离辐射对皮肤黑色素瘤的放射敏感性，为皮肤黑色素瘤放射治疗提供了新的策略。

目的:探讨人参皂苷Rc对脑缺血再灌注损伤(CIRI)小鼠的保护作用,并从细胞焦亡角度阐释其作用机制.方法:将C57BL/6小鼠随机分为假手术(sham)组、大脑中动脉闭塞/再灌注(MCAO/R)组、人参皂苷Rc+MCAO/R组(Rc组)、AMP活化蛋白激酶(AMPK)激动剂阿卡地新(AICAR)+MCAO/R组(agonist组)和人参皂苷Rc+MCAO/R+AMPK抑制剂Compound C组(Rc+inhibitor组).对agonist组小鼠给予AICAR(500 mg/kg)腹腔注射,Rc+inhibitor组小鼠给予Compound C(20 mg/kg)腹腔注射;Rc组和Rc+inhibitor组小鼠造模后给予人参皂苷Rc(40 mg/kg)灌胃,每天一次,连续7 d;sham组和MCAO/R组则给予等体积的纯化水.Zea Longa评分观察小鼠神经功能缺损程度,TTC染色观察小鼠脑梗死体积,干湿重法观察小鼠脑水肿程度,HE染色观察小鼠脑组织病理形态的改变,RT-qPCR和Western blot检测小鼠脑组织AMPK、核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)、胱天蛋白酶1(cas-pase-1)和焦亡效应蛋白消皮素D(GSDMD)的表达,ELISA检测炎症因子白细胞介素1β(IL-1β)和IL-18的含量.结果:Rc组和agonist组小鼠神经功能缺损症状减轻,脑梗死体积减小,脑水肿和神经元病理损伤受到抑制,脑组织p-AMPK/AMPK比值和AMPK mRNA表达水平升高,细胞焦亡相关蛋白NLRP3、caspase-1和GSDMD的mRNA和蛋白表达水平降低,炎症因子IL-1β和IL-18表达水平降低.Rc+inhibitor组小鼠脑组织p-AMPK/AMPK比值和AMPK mRNA表达水平较Rc组显著下降(P<0.05),NLRP3、caspase-1和GSDMD的mRNA和蛋白表达水平,以及IL-1β和IL-18表达水平显著升高(P<0.05),小鼠神经功能缺损程度评分升高,脑梗死体积增大,脑水肿和神经元病理损伤显著加重(P<0.05).结论:人参皂苷Rc可能通过活化AMPK通路抑制NLRP3/caspase-1/GSDMD介导的细胞焦亡,从而减轻小鼠CIRI.

本研究旨在制备脂质体纳米颗粒(lipid nanoparticles,LNP)为载体的结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)抗原EsxV亚单位疫苗,明确该疫苗经黏膜免疫诱导的免疫应答水平.采用薄膜分散法制备包裹蛋白EsxV和c-di-AMP的LNP(EsxV:C:L),并对其包封率、LNP形态、粒径、表位电荷及多相分散指数进行了检测.EsxV:C:L滴鼻免疫 BALB/c小鼠,检测免疫后血清和黏膜抗体、肺或脾细胞因子转录及分泌水平、肺 T 细胞亚群细胞比例.结果成功获得大小均一、呈球状、带负电的EsxV:C:L LNP亚单位疫苗.与EsxV:C相比,EsxV:C:L鼻黏膜接种可诱导小鼠呼吸道黏膜 sIgA水平增加,脾细胞因子 IL-2 分泌水平升高,提高中央记忆 T 细和组织驻留T细胞的比例.综上,EsxV:C:L经黏膜免疫,可诱导更强的黏膜免疫和记忆性T细胞免疫应答,可能提供更好的抗Mtb感染的保护作用.

环二腺嘌呤核苷酸(c-di-AMP)是在继环腺嘌呤核苷酸(cAMP)、四(五)磷酸鸟嘌呤核苷((p)ppGpp)、环二鸟嘌呤核苷酸(c-di-GMP)后新发现的一种第二信使分子,在细菌和支原体中广泛存在.c-di-AMP调控细菌多项生理活动,如细胞周期、细胞壁稳定性、细胞形态、刺激宿主免疫反应以及应对外界环境胁迫等.本文总结了信使分子c-di-AMP自发现以来的研究进展,这些信息可丰富对c-di-AMP调控作用的全面理解.同时,生物信息学分析发现在口腔常见细菌(如变异链球菌和牙龈卟啉单胞菌等)基因组中均存在编码c-di-AMP合成酶的基因,对于这一类基因的功能研究将为深入认识c-di-AMP信号系统在口腔细菌致病过程中的潜在作用提供重要线索,并为研究其在口腔细菌致病性中的调控机制开辟新天地.

目的 研究环化二核苷酸(cyclic dinucleotide,CDN)在小鼠体内对乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)免疫作用的影响,探讨其作为疫苗佐剂的可能性.方法 以HBsAg作为模式抗原,评价3种CDN[环二鸟苷酸(c-di-GMP)、环二腺苷酸(c-di-AMP)和环鸟苷酸-腺苷酸(cGAMP)]在小鼠中对HBsAg免疫作用的影响.经肌肉注射时以铝佐剂作为对照,经黏膜免疫时以壳聚糖(chitosan,CTS)作为对照,ELISA法测定各组小鼠血清中的乙型肝炎病毒表面抗体(HBsAb)水平.同时将c-di-GMP与CTS联合进行黏膜免疫,ELISA法测定各组小鼠血清中的HBsAb水平,ELISPOT法检测小鼠脾细胞特异性细胞因子分泌水平.结果 3种CDN+HBsAg经肌肉免疫诱导产生的HBsAb水平均明显高于HBsAg单独免疫组(P＜0.001),且3组CDN+ HBsAg组与铝佐剂+HBsAg组差异无统计学意义(P＞0.05).c-di-GMP+HBsAg经黏膜免疫诱导HBsAb水平明显高于HBsAg单独免疫组,且与CTS+HBsAg组比较,差异无统计学意义(P＞0.05).c-di-GMP与CTS联合黏膜免疫诱导的HBsAb水平与c-di-GMP+ HBsAg组及CTS+HBsAg组比较,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 3种CDN均具有一定的免疫增强作用,肌肉注射效果与铝佐剂相当;c-di-GMP黏膜免疫效果与CTS相当,c-di-GMP与CTS联合黏膜免疫未显示有协同免疫增强作用.提示CDN具有进一步开发成疫苗佐剂的潜力.

目的 确定致病性问号钩端螺旋体(简称钩体)LA3304基因产物DAC合成c-di-AMP的活性,LA3303基因产物CdaR增强DAC酶活.方法 采用PCR扩增问号钩体黄疸出血群赖型赖株LA3304基因,并构建其原核表达系统.Ni-NTA亲和层析法提纯表达的目的重组蛋白rDAC.采用高效液相色谱法(HPLC)检测rDAC环化ATP底物为c-di-AMP的活性.采用细菌双杂交法检测CdaR与DAC相互作用情况.构建细菌共表达系统,结合HPLC法检测CdaR增强DAC酶活情况.结果 所构建的问号钩体赖株LA3304基因原核表达系统在IPTG诱导下能高效表达rDAC,Ni-NTA亲和层析法提纯的rDAC经SDS-PAGE后显示为单一蛋白条带.rDAC具有体外合成ATP底物为c-di-AMP的功能.CdaR与DAC存在相互作用,CdaR可显著增强DAC酶活(P<0.05).结论LA3304基因产物DAC具有c-di-AMP合成酶活性,CdaR可增强DAC活性,并与DAC构成CdaR-DAC信号系统,共同参与调节钩体c-di-AMP合成.

目的 对几种天然环二核苷酸(cyclic dinucleotide,CDN)作为人体佐剂作用的潜力进行比较.方法 以相同剂量的CDN(c-di-GMP、c-di-AMP、3′3′cGAMP和2′3′cGAMP)同人体来源的单核细胞白血病细胞(human monocyticleukaemia cells,THP-1)共孵育,同时将CDN(c-di-GMP和2′3′cGAMP)与脂质体混合后同THP-1细胞共孵育,刺激5h后,收集细胞及培养液,采用实时定量PCR及ELISA法检测IFNβ基因及蛋白的表达水平,同时检测脂质体对不同类型CDN刺激作用的影响.结果 4种CDN均能有效刺激THP-1细胞IFNβ基因及蛋白表达水平的提高,且对人体细胞作用从强到弱依次为2′3′cGAMP、3′3′cGAMP、c-di-AMP和c-di-GMP,各自之间差异有统计学意义(P＜0.01).脂质体能显著增强典型和非典型CDN对THP-I细胞的刺激作用,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 4种天然CDN对人体均具有潜在的佐剂效应,从作用强度看,2′3′cGAMP是最优选择,同时脂质体能增强CDN的这种效应,为将来进一步对CDN类化合物的佐剂作用的研究奠定基础.

环二腺苷酸(Cyclic diadenosine monophosphate,c-di-AMP)是细菌中广泛存在的第二信号分子.c-di-AMP在细菌中的代谢受二腺苷酸环化酶(Diadenylate cyclase,DAC)和磷酸二酯酶(Phosphodiesterase,PDE)的精密调控.c-di-AMP不仅调节细菌生长、细胞壁稳态、离子转运等多种生理过程,而且能够被真核宿主胞内多种感应子/受体蛋白识别,从而调控抗感染免疫.细菌c-di-AMP参与调控宿主Ⅰ型干扰素应答、NF-κB信号通路活性、自噬以及炎症小体应答等固有免疫应答.此外,c-di-AMP作为黏膜佐剂可诱导宿主适应性免疫.c-di-AMP被认为是一种新发现的病原体相关的分子模式(Pathogen associated molecular pattern,PAMP),已成为细菌疫苗和药物研究中的新靶点.