目的:探讨通过外泌体靶向运载整合素αv/β3小干扰(si)RNA(si-αv/β3)对未分化甲状腺癌(ATC)细胞的增殖、迁移和侵袭能力的影响。方法:采用蛋白质印迹法(Western blot)检测整合素αv/β3在ATC细胞系(8505C、Hth7)及人正常甲状腺细胞(上海生命科学院细胞所)中的表达；将含内化精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸多肽(iRGD)的质粒转染人源胚胎肾细胞HEK-293T后采用超高速离心法得到靶向外泌体，采用PKH26染色验证其靶向性；进一步通过转染获得靶向运载si-αv/β3的外泌体iRGD-exos-si-av/β3(载siRNA组)，将其同8505C细胞共孵育后，采用荧光定量聚合酶链反应(qPCR)和Western blot检测载siRNA组与空载外泌体组8505C细胞内整合素αv/β3的mRNA和蛋白表达水平。采用细胞计数试剂盒(CCK-8)、划痕实验和Transwell检测8505C细胞的增殖、迁移及侵袭能力。两样本间比较采用 t检验，多组间比较采用单因素方差分析。 结果:整合素αv/β3在8505C及Hth7细胞中的表达量显著高于人正常甲状腺细胞(αv：1.04±0.12、0.90±0.11比0.31±0.01， F＝50.11， P<0.01；β3：0.93±0.23、0.89±0.16比0.33±0.27， F＝6.81， P<0.05)。iRGD靶向外泌体在细胞中的荧光信号明显高于非靶向外泌体组(47.18±10.39比5.64±1.43， t＝6.86， P<0.05)。转染si-αv/β3至8505C细胞后，mRNA水平表达显著低于对照组(αv：0.20±0.01比1.21±0.14， t＝12.49， P<0.05；β3：0.21±0.02比1.01±0.18， t＝7.90， P<0.05)；蛋白表达水平亦显著低于对照组(αv：0.45±0.03比0.88±0.06， t＝10.33， P<0.05；β3：0.48±0.09比1.10±0.11， t＝9.02， P<0.05)。iRGD-exos-si-av/β3与空载外泌体组分别与8505C细胞共孵育后，前者mRNA水平表达明显低于空载组(αv：0.30±0.08比1.05±0.02， t＝16.75， P<0.05；β3：0.27±0.05比1.29±0.20， t＝8.71， P<0.05)；蛋白水平表达亦低于对照组(αv：0.60±0.30比1.20±0.23， t＝5.72， P<0.05；β3：0.24±0.11比1.26±0.14， t＝16.23， P<0.05)。载si-αv/β3的靶向外泌体组的细胞增殖率在不同时间点均明显低于空载组[载si-αv组：12 h，(1.84±0.34)%比(3.86±0.47)%， t＝6.07， P<0.05；24 h，(2.70±0.28)%比(6.52±0.29)%， t＝15.99， P<0.05；48 h，(3.62±0.25)%比(8.93±0.15)%， t＝31.16， P<0.05；载si-β3组：12 h，(2.07±0.15)%比(3.86±0.15)%， t＝6.35， P<0.05；24 h，(3.48±0.10)%比(6.52±0.29)%， t＝16.98， P<0.05；48 h，(3.85±0.22)%比(8.90±0.15)%， t＝32.62， P<0.05]。划痕24 h和48 h载si-αv/β3的靶向外泌体组的细胞迁移率均低于空载组[24 h：载si-αv组为(13.00±1.10)%比(36.00±4.00)%， t＝9.60， P<0.01；载si-β3组为(7.00±1.60)%比(36.00±4.00)%， t＝11.34， P<0.01；48 h：载si-αv组为(17.00±1.20)%比(65.00±2.50)%， t＝28.89， P<0.01；载si-β3组为(22.00±1.80)%比(65.00±2.50)%， t＝24.01， P<0.01]。载si-αv/β3组的细胞迁移数均低于空载组[载si-αv组：(3 361.67±860.52)个比(7 620.67±1 008.46)个， t＝5.56， P<0.05；载si-β3组：(2 868.33±1 499.92)个比(7 620.67±1 008.46)个， t＝4.55， P<0.01]。 结论:iRGD靶向外泌体运载si-αv/β3通过下调ATC细胞中整合素αv/β3的表达有效减弱其增殖、迁移和侵袭能力。

目的:观察 131I标记、内化精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸多肽(iRGD)靶向的多功能外泌体(iRGD-Exo- 131I)对未分化甲状腺癌(ATC)细胞的杀伤作用。 方法:蛋白印迹检测Hth7、Cal-62(购自上海生命科学院细胞所)两种ATC细胞中整合素αvβ3的表达；设计包含酪氨酸、iRGD肽段及外泌体膜蛋白(Lamp2b)基因的质粒，将其转染HEK-293T(天津医科大学肿瘤医院)细胞后利用超高速离心法得到靶向外泌体(iRGD-Exo)；共聚焦显微镜观察Hth7细胞对靶向及无靶向外泌体的摄取情况；氯胺T法制备iRGD-Exo- 131I；细胞毒性实验验证iRGD-Exo的细胞安全性，并比较 131I标记的靶向及无靶向外泌体对Hth7细胞的毒性；构建Hth 7荷瘤鼠模型，当瘤体直径约8 mm时按随机数字表法分为4组(每组5只)，分别尾静脉注射磷酸盐缓冲液、无靶向外泌体(blank-Exos)、blank-Exos- 131I或iRGD-Exos- 131I溶液，在注射后不同时间点(0、3、6、9、12、15、18 d)记录瘤体体积及荷瘤鼠体重。采用两样本 t检验、单因素方差分析统计数据。 结果:整合素αvβ3在Hth7、Cal-62细胞中明显高表达。共聚焦实验显示外泌体经iRGD修饰后可增强Hth7细胞对其的摄取能力。iRGD-Exo- 131I的标记率为(50.16±4.21)%，放化纯>95%。共孵育48 h后，131I标记的靶向与无靶向外泌体组Hth7细胞存活率均显著低于游离Na131I组[靶向组：(40.97±6.55)%比(83.80±5.21)%， t＝12.531， P<0.05；无靶向组：(67.32±8.92)%比(83.80±5.21)%， t＝3.912， P<0.05]；且无靶向组高于靶向组[(67.32±8.92)%比(40.97±6.55)%， t＝5.833， P<0.05]；动物实验亦证实iRGD-Exo- 131I能更有效地抑制ATC细胞的增殖。 结论:成功制备iRGD-Exo- 131I，且该标志物较稳定，靶向性良好；体外及体内实验证实其能有效杀伤ATC细胞。

目的 构建经iRGD修饰的胡桃醌(juglone,Jug)-紫杉醇(paclitaxel,PTX)靶向纳米粒子(nanoparticles,NPs),并评价其对人骨肉瘤细胞Saos-2 的抑制作用.方法 通过乳化法制备iRGD-PLGA-(Jug,PTX)-NPs,并评价其材料特性、载药能力和体外释放结果.利用荧光显微镜观察iRGD-PLGA-(Jug,PTX)-NPs体外细胞摄取情况,再通过MTT法比较各组对Saos-2细胞的增殖抑制作用.结果 ①在Jug:PTX=0.1 mg:0.1 mg,iRGD-PLGA=1 mg条件下,成功制备iRGD-PLGA-(Jug,PTX)-NPs.②透射电镜下可见,纳米粒子为大小均一的类球形,粒径为233.3 nm,Jug载药率为8.68%,包封率为31.87%,PTX载药率为8.98%,包封率为 30.18%;③体外药物释放显示,前 24h 中为突释,随后为缓释,96 h 后 Jug 累积释放为(72.108±1.243)%,PTX为(69.980±3.626)%;④细胞摄取实验显示,iRGD修饰的纳米粒子较无修饰粒子进入细胞更多;⑤MTT结果显示,Jug和PTX均可抑制Saos-2 细胞增殖,且呈现出剂量依赖性.药物处理 24h后,裸药组抑制率明显高于其他组,而在 48h后,iRGD-PLGA-(Jug,PTX)-NPs抑制率高于裸药组.结论 iRGD-PLGA-(Jug,PTX)-NPs稳定性较好,包载药物表现出先突释后缓释的现象,iRGD修饰可增强肿瘤靶向穿透性,提升疗效.

目的 构建iRGD靶向载尿激酶脂质体-微泡复合物(iRGD-LMC),探讨其联合超声靶向微泡破坏技术(UTMD)的体外溶栓作用.方法 薄膜-水化法制备靶向微泡,冻融法制备载尿激酶(uPA)脂质体,两者通过生物素-亲和素偶联获得iRGD-LMC.共聚焦显微镜观察其形态特征,颗粒计数仪测定其粒径和浓度,BCA试剂盒测定载药量,Vevo 2100超声成像仪对其进行体外超声成像.设置不同的超声强度及时间,比较药物释放率.制作体外血栓模型,观察iRGD-LMC联合超声的溶栓效果.结果 制备的iRGD-LMC表现为普通微泡形态,浓度为(0.51±0.03)×109/ml,粒径为(2.62±0.12)μm,载药量为每108个复合物载uPA(3878.5±97.8)μg.超声下iRGD-LMC可显影并释放药物.在体外溶栓实验中,iRGD-LMC联合超声组的溶栓效率为(87.66±1.69)％,溶栓效果最好,与阴性对照组 、 单纯超声组 、 单纯尿激酶组 、 单纯iRGD-LMC组比较差异均有统计学意义(P<0.05).结论 成功构建了iRGD-LMC,并结合了脂质体高载药量 、 超声溶栓及微泡助溶的优点.体外实验证实,联合UTMD可促进药物释放,取得了显著的溶栓效果.

近年临床常用的常规化疗药物对结直肠肿瘤组织的靶向性较差,由于结直肠肿瘤的多药耐药性,传统药物对肿瘤组织的穿透及细胞毒性大打折扣.随着肿瘤穿透肽的出现,新型高效的抗肿瘤药物传递系统成为国际学者的研究课题.现简要阐述iRGD肽及其修饰纳米胶束载药系统近年在靶向性给药及对抗耐药性结直肠肿瘤方面取得的研究进展,研究表明iRGD肽修纳米胶束将会是极具潜力的抗耐药给药体系.

恶性肿瘤是目前严重威胁人类生命健康的重大疾病之一,随着对恶性肿瘤研究的深入,越来越多的抗肿瘤药物被研发应用并取得显著的成效,但是由于复杂的肿瘤微环境,抗肿瘤药物常难以渗透至肿瘤组织深部,导致生物利用度低,抗肿瘤作用减弱.肿瘤穿透肽(tumor-penetrating peptide) iRGD化学连接在纳米载体表面或者与纳米载体联合给药,促进药物渗透至肿瘤组织深部有效发挥抗肿瘤作用,是目前肿瘤靶向治疗领域中备受关注的研究方向之一.本文回顾并总结了iRGD在抗肿瘤靶向纳米递药治疗中的研究进展,这些研究结果都显示了肿瘤穿透肽iRGD在肿瘤靶向治疗中拥有良好的应用前景.

结直肠癌是世界上常见的恶性肿瘤,奥沙利铂(oxaliplatin)是常用于结直肠肿瘤化疗的第三代铂类药物,以其为基础的化疗方案现已成为结直肠癌化疗的标准方案.结直肠癌化疗无效的一个重要原因是肿瘤细胞对化疗药物产生耐药,最近研究发现,具有靶向能力的修饰物与化疗药物结合,能提高肿瘤组织内化疗药物的局部浓度.iRGD肽作为一种靶向肽与化疗药物结合,能增强化疗效果,血管内注射与iRGD肽偶联修饰过的化疗药物,能导致化疗药物与肿瘤血管结合,并能扩散到血管外的肿瘤实质.本文就iRGD肽协同奥沙利铂逆转结直肠肿瘤耐药的研究进展做详尽综述.

在本研究中,我们制备了iRGD,CRGDK/RGPD/EC)修饰、含溶血磷脂的温敏脂质体(LTSL)载体系统用以递送共轭亚油酸-紫杉醇(CLA-PTX),简称iRGD-LTSL-CLA-PTX.在B16-F10黑色素瘤细胞上评估了iRGD-LTSL-CLA-PTX的体外细胞摄取和体外细胞毒性.在荷B16-F10黑色素瘤的C57BL/6小鼠上评价了iRGD-LTSL-CLA-PTX的体内抗肿瘤作用.细胞摄取实验结果表明,与SSL-CLA-PTX组相比,在42℃分别孵育2、4和6h,iRGD-LTSL-CLA-PTX给药组中CLA-PTX的细胞摄取分别增加2.05、3.31和4.83倍.体内抗肿瘤效果表明,与CLA-PTX溶液、LTSL-CLA-PTX、LTSL-CLA-PTX(加热条件)和iRGD-LTSL-CLA-PTX相比,iRGD-LTSL-CLA-PTX(加热条件)可显着抑制B16-F10肿瘤的生长(P＜0.01).iRGD-LTSL-CLA-PTX对B16-F10黑素瘤的体外和体内抗肿瘤作用得到证实,这是iRGD和LTSL共同作用的结果.

目的 以树状大分子为载体材料并修饰血脑屏障(blood brain barrier,BBB)靶向短肽TGN和肿瘤靶向短肽iRGD构建脑胶质瘤靶向递药系统(iRGD/TGN-PEG-PAMAM/ATO),旨在解决三氧化二砷(arsenic trioxide,As2O3,ATO)在治疗脑胶质瘤过程中分布缺乏特异性、透BBB难等问题,使其具有更好抗脑胶质瘤作用.方法 核磁共振图谱(1H-NMR)、透射电子显微镜(TEM)等考察载体的理化性质;电感耦合等离子发射光谱(ICP)、透析袋法分析其包封率及体外释放情况;通过激光共聚焦及流式细胞仪分析iRGD、TGN对细胞摄取的影响;MTT法考察纳米载体对脑微血管内皮细胞(HBMEC)和脑胶质瘤U87细胞的毒性及BBB模型中递药系统抑制U87细胞生长的情况.结果 成功合成了iRGD/TGN-PEG-PAMAM载体,其形态规整,大小均匀,测得其粒径(24.87±0.84) nm,电位(17.26±1.64) mV;该载体对HBMEC和U87细胞均具有较小的毒性;递药系统iRGD/TGN-PEG-PAMAM/ATO的包封率为(71.92±1.17)％,体外释放表明ATO经载体包载后呈现一种缓慢释放趋势,且在酸性条件下更有利于ATO的释放;细胞摄取结果提示iRGD/TGN的修饰有利于U87细胞对递药系统的摄取;体外跨BBB抑制U87细胞生长实验结果表明,iRGD/TGN-PEG-PAMAM/ATO组具有更好的跨BBB抑制U87细胞生长效果.结论 iRGD/TGN-PEG-PAMAM/ATO脑胶质瘤靶向递药系统具有较好的体外跨BBB抑制U87细胞生长的效果,为脑胶质瘤治疗提供了新的策略.

目的 制备iRGD靶向造影剂,USMI解读大鼠激素性股骨头坏死发展过程中新生血管内皮细胞整合素αvβ3的时空信息,初步探索H亚型血管的存在.方法 制备iRGD靶向造影剂,检测其表征及体外成像性能.对大鼠行超声分子成像,股骨头切片行αvβ3、CD31、Emcn免疫荧光双染.结果 iRGD靶向造影剂制备成功.USMI检测第3周信号强度比第1周高,差异有统计学意义(P＜0.05),第5周比第1、第3周高,差异有统计学意义(P＜0.05),随坏死加重信号强度逐渐增强.免疫荧光双染显示整合素αvβ3与CD31融合,随SIONFH进展表达增多.空白组CD31和Emcn数量定位比造模5周组多.结论 成功制备iRGD靶向造影剂,超声分子信号随坏死加重逐渐增强,大鼠股骨头坏死中H亚型血管的低表达有望为今后治疗股骨头坏死提供新靶点.