目的:分析黏质沙雷菌携带KPC-2型碳青霉烯酶的相关质粒特征。方法:4株碳青霉烯类抗生素耐药的黏质沙雷菌来自2016年我院肝胆病区的4位患者，使用仪器BD Phenix-100鉴定菌株并测定最小抑菌浓度(MIC)，脉冲场凝胶电泳分析菌株之间的同源性，改良Hodge试验检测碳青霉烯酶表型，PCR及产物测序检测基因型，接合试验检测质粒的转移性，质粒全基因组测序后比对，并分析其特征，使用软件DNAMAN比对复制起始蛋白氨基酸序列，软件MEGA7.0 Neighobor-Joining法构建系统发育树。结果:4株黏质沙雷菌对碳青霉烯类抗生素均表现耐药，菌株具有同源性，Hodge试验为阳性，碳青霉烯酶基因型为 blaKPC-2，接合试验阳性；质粒为42 742 bp的环状DNA，具有incX6质粒的类似骨架和相似的复制起始蛋白氨基酸序列，并和incX6具有共同的节点； blaKPC-2处于由Tn3家族转座子、重组酶基因、△ISKpn6和ISkpn27等插入元件构成的耐药核心区。 结论:未知质粒类型为incX6-like， blaKPC-2位于质粒的△Tn6296转座子上；携带KPC-2的此类质粒的细菌应引起重视。

目的:研究多重耐药霍氏肠杆菌霍夫曼亚种临床分离株C37携带 blaNDM-1基因质粒的遗传特征，并对目前可公开获得的66个霍氏肠杆菌霍夫曼亚种的核心基因组进行系统发育分析，以研究霍氏肠杆菌霍夫曼亚种的全球流行情况。 方法:收集2014年8月至2021年8月中山大学附属第一医院分离的耐碳青霉烯阴沟肠杆菌复合物（CRECC）。采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术（MALDI-TOF MS）和16S rRNA Sanger测序对C37进行菌种鉴定。使用微量肉汤稀释法进行抗菌药物敏感性试验。采用聚合酶链反应（PCR）检测C37菌株携带的β内酰胺酶耐药基因和质粒介导的喹诺酮类耐药（PMQR）基因。使用接合试验确认C37菌株抗性基因的接合转移性。对C37菌株进行全基因组测序，提取霍氏肠杆菌霍夫曼亚种的核心基因组，对目前可公开获得的66个霍氏肠杆菌霍夫曼亚种进行系统发育分析。结果:霍氏肠杆菌霍夫曼亚种C37菌株对三代头孢、碳青霉烯类、氨基糖苷类及喹诺酮类抗菌药物耐药，携带 blaACT-5、 blaNDM-1、 qnrA1、 aac（ 6′） -Ib-cr、 oqxAB、 fosA、 dfrA15等多种抗性基因及IncX3、IncX4、IncFIB和IncFII质粒。多位点序列分型（MLST）分析显示其属于阴沟肠杆菌复合体（ECC）ST78型。系统发育分析显示ST78型霍氏肠杆菌霍夫曼亚种与碳青霉烯耐药基因传播密切相关。 结论:ST78型霍氏肠杆菌霍夫曼亚种与碳青霉烯耐药基因传播密切相关，是传播碳青霉烯耐药基因的高风险克隆，需密切监测其流行情况。

目的 分析碳青霉烯类耐药阴沟肠杆菌复合群(CRECL)的耐药谱和分子流行病学特征,指导临床抗感染治疗.方法 收集丽水市中心医院2012-2022年分离的非重复CRECL菌株,采用VITEK MS全自动快速微生物质谱检测系统进行菌种鉴定,以微量肉汤稀释法检测最小抑菌浓度值(MIC),利用聚合酶链式反应(PCR)扩增bla KPC、bla NDM、bla IMP、bla VIM、bla OXA-48等碳青霉烯酶基因并测序确认.通过接合实验和复制起始子扩增检测分析耐药基因定位及质粒类型;采用多位点序列分析(MLST)确定各菌株ST型,并结合BV-BRC数据库来源的CRECL构建系统发育树和最小生成树,分析CRECL的分子流行病学特征.结果 共收集非重复CRECL菌株22株,分布于14个临床科室,分属于16个ST型;22株菌对美罗培南、头孢他啶、头孢噻肟均100.00％耐药,对左氧氟沙星、氨曲南和多黏菌素的耐药率分别是81.81％、63.63％和31.81％,仅对替加环素100.00％敏感;经测序确认,17株CRECL菌株携带blaNDM基因,占77.27％,且其中15株位于IncX3型质粒,2株位于IncFⅡ型质粒;根据系统发育树和最小生成树分析,CRECL呈散发分布,未发现优势克隆群.结论 CRECL呈散发流行,医院分离菌株主要携带bla NDM基因,IncX3型质粒是介导该基因转移的主要原因.

Conjugative transfer of antibiotic resistance genes(ARGs)by plasmids is an important route for ARG dissemination.An increasing number of antibiotic and nonantibiotic compounds have been reported to aid the spread of ARGs,highlighting potential challenges for controlling this type of horizontal transfer.Development of conjugation inhibitors that block or delay the transfer of ARG-bearing plasmids is a promising strategy to control the propagation of antibiotic resistance.Although such inhibitors are rare,they typically exhibit relatively high toxicity and low efficacy in vivo and their mechanisms of action are inadequately understood.Here,we studied the effects of dihydroartemisinin(DHA),an artemisinin derivative used to treat malaria,on conjugation.DHA inhibited the conjugation of the Incl2 and lncX4 plasmids carrying the mobile colistin resistance gene(mcr-1)by more than 160-fold in vitro in Escherichia coli,and more than two-fold(Incl2 plasmid)in vivo in a mouse model.It also suppressed the transfer of the IncX3 plasmid carrying the carbapenem resistance gene blaNDM-5 by more than two-fold in vitro.Detection of intracellular adenosine triphosphate(ATP)and proton motive force(PMF),in combination with transcriptomic and metabolomic analyses,revealed that DHA impaired the function of the electron transport chain(ETC)by inhibiting the tricarboxylic acid(TCA)cycle pathway,thereby disrupting PMF and limiting the availability of intracellular ATP for plasmid conjugative transfer.Furthermore,expression levels of genes related to conjugation and pilus generation were significantly down-regulated during DHA exposure,indicating that the transfer apparatus for conjugation may be inhibited.Our findings provide new insights into the control of antibiotic resistance and the potential use of DHA.

目的 探讨栖冷克吕沃尔氏菌临床株PD49对碳青霉烯类耐药的分子机制.方法 细菌鉴定和药敏分别通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪和VITEK 2 Compact系统.碳青霉烯酶的检测通过NG-Test CARBA 5卡.基于Illumina MiSeq和Nanopore MinION技术平台对菌株测序,然后进行生物信息学分析.通过液相接合试验和S1核酸酶切脉冲场凝胶电泳(S1-PFGE)检测菌株所携带质粒的水平转移能力.结果 栖冷克吕沃尔氏菌临床株PD49对广谱头孢菌素敏感,环丙沙星和左氧氟沙星中介,厄他培南、亚胺培南和美罗培南耐药.通过测序平台获得了 PD49株的基因组序列,进一步的生物信息学分析显示:PD49株的染色体(命名为PD49-chr,4844 054 bp)携带blaKLUC-1基因以及多个外排泵基因;该菌株携带1个Co1KP3/IncX3型杂合质粒(命名为pPD49-OXA-181,51 479 bp),且blaOXA-181和qnrS1基因位于该质粒上.液相接合和S1-PFGE结果显示PD49株将携带的pPD49-OXA-181质粒传递到大肠埃希菌J53AziR.结论 本研究表明栖冷克吕沃尔氏菌临床株PD49对碳青霉烯类耐药的分子机制是因为该菌携带了blaOXA-181基因.经检索,同时携带blaKLUC-1、blaOXA-181和qnrS1基因的克吕沃尔氏菌为国内外首次报道.

目的 探讨烧伤患者感染肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗生素高水平耐药的分子机制.方法 采用回顾性分析方法,收集南昌大学第一附属医院2014年7月至2015年6月烧伤患者分离的非重复碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌(CR-KP)18株.测定菌株最低抑菌浓度(MIC),对菌株进行特异性PCR扩增和序列分析、质粒接合试验、Southern杂交以及外膜蛋白分析.多位点序列分型(MLST)分型技术和脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析菌株同源性.结果 药敏试验显示所有碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌(CR-KP)具有多重耐药,对哌拉西林/他唑巴坦、头孢曲松、左氧氟沙星、环丙沙星、庆大霉素、妥布霉素、头孢替坦、头孢他啶、头孢吡肟、氨曲南、亚胺培南、美罗培南全部耐药,耐药率100％(18/18);对替加环素、复方新诺明、阿米卡星对耐药率分别为0％(0/18)、61.1％(11/18)、72.2％(13/18).接合试验可使受体菌大肠埃希菌J53对碳青霉烯的MIC值从≤0.0625或0.125μg/ml上升到16或32μg/ml.特异性PCR扩增和序列分析发现18株产NDM-1菌株,5株KPC-2菌株.接合试验证实blaNDM-1可以通过质粒传播.Southern杂交显示blaNDM-1基因定位于46Kb大小的质粒上,质粒复制子分型显示为IncX3型.PFGE共7种细菌基因型,而MIST分型发现18株CR-KP分别属于ST11、ST395、ST17、ST37、ST263、ST14和ST76型.外膜蛋白的SDS-PAGE和ompK35/36基因序列分析发现ST11、ST395和ST37型CR-KP菌株OmpK36膜孔蛋白缺失,而其他ST分型菌株OmpK36膜孔蛋白表达量降低.结论 本院烧伤患者分离的肺炎克雷伯菌对碳青酶烯类药物高水平耐药的主要机制是质粒介导的NDM-1型金属β-内酰胺酶的产生合并OmpK36膜孔蛋白表达降低或缺失,并且发现了同时携带NDM-1和KPC-2种碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌.

目的 分析浙江省丽水地区产NDM菌株的耐药表型及基因结构特征,为临床抗感染治疗和防控提供实验依据.方法 收集浙江省丽水市中心医院2012年1月至2016年12月临床分离的所有无重复亚胺培南耐药性肠杆科细菌,以梅里埃Vitek 2 Compact系统鉴定菌种并以PCR筛选blaNDM基因阳性菌株,采用KB法和GN13卡检测菌株药敏性,利用复制起始子分析法鉴定质粒类型,通过转化或接合试验纯化质粒并采用PCR和全基因组测序分析blaNDM周围基因结构.结果 共分离碳青霉烯耐药肠杆科细菌(CRE)菌株102株,其中blaNDM阳性15株,阳性检出率为14.7%,主要为大肠埃希菌和阴沟肠杆菌.各菌株对β-内酰胺类抗菌药物的耐药率为100%,对氨曲南、复方磺胺甲噁唑、妥布霉素、庆大霉素的耐药率均＞80%;对喹诺酮类药物的耐药率＞50%. 15株产NDM菌株中, 12株改良Hodge试验阳性,另有2株阴沟肠杆菌和1株大肠埃希菌呈阴性结果.其中blaNDM-1型11株,blaNDM-5型4株.检到IncX3、IncFIIγ和IncA/C等多种质粒类型,且4例blaNDM-5基因均位于IncX3质粒.发现4 种 blaNDM周围基因结构,其中8 例 blaNDM-1基因位于 ISAb125-hyp-blaNDM-1-bleMBL-TrpF-DsbC-IS26,而blaNDM-5均位于IS3000-IS5-blaNDM-5-bleMBL-TrpF-DsbC-IS26结构,且前者在国内尚属首次报道.结论 丽水地区NDM菌株呈低水平流行,并对磷霉素和多黏菌素敏感性较高;blaNDM基因可能有多种来源,但IncX3型质粒仍是介导该基因转移的主要原因,并发现新型blaNDM-1基因结构.

目的 对分别分离自我国两家医院的多药耐药菌株肺炎克雷伯菌10677和霍氏肠杆菌128379进行耐药机制研究.方法 通过16S rDNA鉴定菌种,PCR筛查菌株携带的耐药基因,应用改良Carba NP法检测菌株产碳青霉烯酶的类型,接合转移和电转化试验验证携带IMP和NDM的质粒是否具有可转移性,全基因组测序获得细菌所携带的所有质粒序列,应用RAST、BLAST等对序列进行生物信息学分析.结果 10677和128379两株菌均产B类酶,且均携带碳青霉烯酶基因bla IMP和bla NDM.全基因测序结果显示10677和128379各包含两个分别携带bla IMP-4和blaNDM-1的质粒,分别为p10677-IMP、p10677-NDM、p128379-IMP和p128379-NDM.其中p10677-IMP、p10677-NDM和p128379 NDM可通过接合转移得到相应的接合子,p128379-IMP仅可通过电转的方式得到其电转化子.p10677-IMP和p128379-IMP均为IncN1型质粒,有三个共有的外源插入区,分别为包含有携带bla IMP-4的整合子In823b,IS1插入区,携带qnrS1基因的转座子Tn6292,除此外,p10677-IMP还包括携带fosA 5基因的转座子Tn6412区以及IS26插入区.p10677-NDM和p128379-NDM为IncX3型质粒,包含两个共有的外源插入区,分别为ISKox3和携带blaNDM 1的耐药区,此外,p10677-NDM还包含一个独有的插入区ISEhe3.结论 质粒p10677-IMP、p10677-NDM和p128379-IMP、p128379-NDM分别介导10677和128379多药耐药且均具有转移性,是这两株耐药菌传播的重要载体.

目的 分析新生儿科3株产NDM-5型碳青霉烯耐药大肠埃希菌的分子流行特征.方法 收集2017年8-9月新生儿科病房分离的3株碳青霉烯耐药大肠埃希菌(E1、E2和E3).采用Vitek 2 Compact系统联合K-B法、E-test法进行药物敏感性试验;PCR扩增碳青霉烯耐药基因及其他相关耐药基因;PCR技术检测质粒复制子分型;质粒接合试验探讨质粒的可接合传递性;多位点序列分析(MLST)和脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析菌株同源性.结果 3株细菌对绝大多数β-内酰胺类药物耐药,除外氨曲南(E1、E3敏感,E2耐药),对喹诺酮类药物、复方磺胺甲噁唑耐药,对氨基糖苷类药物敏感.PCR及测序提示3株细菌均检出blaNDM-5基因,同时检出部分超广谱β-内酰胺酶基因(blasHv、blaTEM或blaCrx-M);质粒复制子类型均为IncX3,E1质粒接合转移试验成功;MLST提示3株细菌均为ST1642型,PFGE显示3株细菌条带一致.结论 新生儿科3株碳青霉烯耐药大肠埃希菌均产NDM-5型碳青霉烯酶,同时携带超广谱β-内酰胺酶基因,MLST和PFGE提示3株细菌为同一克隆来源.

目的 了解住院患者及体检人群肠道中携带mcr-1基因的革兰阴性杆菌的定植情况,阐明mcr-1基因流行的分子特性.方法 收集广州医科大学附属第一医院临床粪便标本1263份和广州金域体检中心粪便标本750份,在含黏菌素的麦康凯培养基上分离耐药菌株;PCR法检测耐药菌株中的mcr-1基因,多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)及肠杆菌基因间重复共有序列PCR(enterobacterial repetitive intergenic consensus-PCR,ERIC-PCR)对菌株进行同源性分析;用质粒接合试验验证mcr-1基因的可转移性,用基于PCR的复制子分型法对质粒进行分型,用PCR法检测12种毒力基因.结果 1263份住院患者标本中共筛选到92株耐药菌(7.3％,92/1263),其中2株携带mcr-1(1株同时携带碳青霉烯酶基因blaNDM-5);750份体检标本中筛选到36株耐药菌(4.8％,36/750),其中1株携带mcr-1基因.MLST分析显示3株mcr-1阳性大肠埃希菌(MIC均为8μg/ml)为不同的序列型(sequence type,ST),ERIC-PCR显示为3种不同的克隆株.3株携带mcr-1基因的菌株均接合成功.mcr-1基因阳性菌株携带6种质粒型(IncFⅡ、IncX2、IncHI2、IncFIB、IncX4和IncX1)及毒力基因fimH、iutA、fyuA.结论 耐黏菌素菌株及mcr-1基因在住院患者及体检人群中均存在一定的流行率,为临床抗感染治疗带来潜在风险.