产志贺毒素大肠埃希菌(Shiga toxin-producing Escherichia coli,STEC)是一类重要的动物源性病原菌,其感染人体后可引起腹泻甚至致死性的溶血性尿毒综合症(hemolytic uremic syndrome,HUS).志贺毒素(Shiga toxin,Stx)是STEC最重要的致病物质,由整合于宿主染色体特定位置的Stx前噬菌体(Stx-converting prophage)编码.在 自发或理化因素诱导下,Stx前噬菌体进入裂解周期,噬菌体颗粒组装并在宿主菌裂解后释放,成为游离的Stx噬菌体(Stx phage).Stx前噬菌体调控志贺毒素表达水平进而影响细菌毒力,而游离Stx噬菌体具有介导新的致病菌型或毒力增强的杂合型致病菌型产生的潜力.本文就Stx噬菌体的形态及基因组特征、诱导特性以及其作为可移动元件对菌株致病性的影响等方面的研究进展做一简要综述.

目的 利用噬菌体展示技术筛选特异性抗CD147人源单链抗体(human anti-CD147 scFvs)并进行生物特性鉴定.方法 以真核表达的CD147蛋白为抗原,采用“酸洗脱法”对库进行4轮富集性筛选、以ELISA法对筛选克隆的结合活性进行测定,以竞争ELISA和Western blot实验对获得的噬菌体抗体和可溶性scFv的特异性进行鉴定,通过DNA测序核实特异性scFvs的人源性及其亚群,以硫氰酸盐洗脱法对获得的抗体进行相对亲和力分析.结果 经过4轮的富集性筛选,共筛出4个与CD147特异性结合的阳性克隆,其中3个获得可溶性表达,竞争抑制及Western blot实验证实其能与CD147特异性结合.DNA序列分析证实3个阳性克隆具有不同的基因型,三者的轻链可变区分别属于VλⅠ、VκⅡ、VλⅢ亚群,重链可变区分别属于VHⅠ、VHⅢ、VHⅢ亚群.硫氰酸盐洗脱法测出13号、15号和168号3个human anti-CD147 scFvs的亲和力分别为0.20 mol/、0.35 mol/L和0.6 mol/L.结论 成功从大容量噬菌体抗体库中筛选到特异性human anti-CD147 scFvs,为进一步研究该抗体的功能及应用前景奠定了基础.

目的 构建天然人源噬菌体抗体库,初步筛选人源抗丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)多肽抗原的单克隆重组噬菌体抗体.方法 以健康成人外周血淋巴细胞cDNA为模板,采用PCR技术扩增轻(VL)、重链(VH)可变区基因;重叠PCR法拼接生成单链抗体可变区基因片段(single chain fragment variable,scFv),并克隆至噬菌体载体pCANTAB5e,得到初级抗体库;使用HCV多肽混合抗原,经3轮淘筛富集噬菌体抗体;Phage ELISA法初步筛选HCV重组噬菌体抗体.结果 成功构建了天然人源噬菌体抗体库.scFv(VH-κ)库的库容为6.0×107 PFU/mL,scFv(VH-λ)库的库容为4.28×109 PFU/mL;经初步淘筛,成功获得HCV三级抗体库;Phage ELISA得到了3株候选重组噬菌体抗体.结论 初步得到HCV多肽抗原重组噬菌体抗体,为今后进一步筛选高亲和力噬菌体抗体和可溶抗体奠定了基础.

目的 设计检测多个靶基因的炭疽多重荧光定量PCR反应系统,建立快速准确的基因诊断方法,解决蜡样芽胞菌群基因诊断交叉反应问题. 方法 选择炭疽杆菌PX01毒素质粒基因pagA,PX02毒素质粒基因capB,以及染色体上的前噬菌体λBa03基因PL3作为靶基因,利用在线荧光定量PCR引物设计软件设计、优化多重PCR引物以及相应的TaqMan探针序列,对探针进行LNA标记并优化荧光PCR反应体系,构建多重实时荧光定量PCR反应系统.以3对引物PCR扩增并克隆靶基因的质粒标准品,倍比稀释后进行敏感度试验,以炭疽、蜡样芽胞杆菌、苏云金杆菌、蕈状杆菌以及常见肠道致病菌进行特异度试验,利用炭疽弱毒株污染土壤及奶粉进行模拟检测. 结果 TaqMan-LNA多重实时荧光定量PCR可迅速检出3个炭疽杆菌靶基因,常用的探针法荧光定量PCR反应液均适用;pagA、CapB、PL3基因克隆标准品序列正确;该方法对pagA、CapB、PL3基因的检出限分别为63、398、114copies/μl,且仅检出炭疽杆菌基因,其余4种蜡样芽胞菌扩增均阴性.土壤及奶粉样品检测均阳性,其中pagA近检出限为6.6×104/ml,PL3基因检出限为6.6×105/ml. 结论 TaqMan-LNA多重实时荧光定量PCR方法具有适用性广,检测迅速,灵敏度及特异度高等特点,能够将炭疽杆菌与蜡样芽胞菌群中其他细菌相鉴别,可试用于炭疽杆菌的感染检测.

志贺毒素(Shiga toxin,Stx)是志贺菌和某些大肠埃希菌等产生的一种重要的毒力因子,包括志贺毒素1(Stx1)和志贺毒素2(Stx2)两种型别.该毒素由λ样志贺毒素噬菌体编码,通过切割核糖体28S rRNA 3′端腺苷酸从而抑制蛋白质合成,也可通过多种途径诱导细胞凋亡.人感染产志贺毒素的细菌可出现腹泻或出血性结肠炎(hemorrhagic colitis,HC),严重者可导致溶血性尿毒综合征(hemolytic uremic syndrome,HUS),甚至死亡.目前,尚无特异性治疗志贺毒素所致疾病的方法,但近年来志贺毒素在癌症靶向治疗或成像等医学领域的应用前景已引起人们的兴趣.本文就志贺毒素的命名、分型、分子结构、遗传学基础、作用机制、应用前景等方面的研究进展做一简要综述.

为建立人血小板cDNA文库，作者用人新鲜血小板悬液纯化血小板，加入变性液作匀浆，经苯酚、氯仿、异丙醇等抽提RNA，以所得RNA为模板合成cDNA，并将其连接λgt11臂，用噬菌体包装蛋白"包装"，再进行连续稀释，然后将不同稀释度的噬菌体转染宿主菌Y1090。结果：从纯化血小板2.8 × 10 12中获得约1.5mg RNA，其 A（吸光度，曾称光密度 OD） 260nm/ A280nm为1.721,RNA变性电泳可见18s和28s条带，且无RNA降解。由该RNA合成的第一条cDNA链产量为1.82μg，第二条cDNA链产量为3.79μg，放射自显影显示双链cDNA分子大小范围在0.5~5.0kb，大部分位于1.0~4.0kb之间。基因库效价为：总效价1.52 × 10 8，重组子效价1.38 × 10 8，重组百分比83.1%；克隆效率6.90 × 10 8。

[目的]为探究脂多糖对O1、O78血清型禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)致病作用的影响.[方法]选取负责脂质A生物合成相关基因lpxL和lpxM,利用λ噬菌体的Red同源重组系统分别构建APEC E516 (O1血清型)和APEC E522 (O78血清型)缺失株E516△lpxL、E516△lpxM、E516△lpxL△lpxM、E522△lpxL、E522△lpxM和E522△lpxL△lpxM,并通过体内外试验对其生物学特性及致病性进行研究.[结果]各菌株生长速度基本一致.E516△lpxL、E516△lpxL△lpxM、E522△lpxM和E522△lpxL△lpxM的抗血清补体杀菌能力和抗鸡巨噬细胞HD-11吞噬能力较野生株显著下降,而缺失株E516△lpxM、E522△lpxL与野生株相比无明显差异;半数致死剂量测定结果显示,除E516△lpxM、E522△lpxL外,各缺失株毒力降低1000倍左右;SPF鸡体内动态分布试验结果显示,各缺失株在鸡体内定殖能力较野生株显著下降,但回补株的毒力未能恢复至野生株水平.[结论]lpxL和lpxM基因与O1血清型APEC E516株和O78血清型APEC E522株的毒力有关,但是lpxL和lpxM基因对E516和E522菌株毒力的影响存在差异.

噬菌体在维持宿主肠道微环境中起着重要作用.运用宏基因组学方法全面探究大熊猫肠道噬菌体的多样性.共注释到548种噬菌体,主要来自11个科38个属548个种.大多数噬菌体主要来自长尾病毒科Siphoviridae、肌尾噬菌体科Myoviridae和短尾噬菌体科Podoviridae,所占比例分别为41.7％、27.6％和19.5％.其中未分类到科的噬菌体占10.5％.38个属主要为λ样病毒属(10.3％)、T4样病毒属(8.0％)、P1样病毒属(7.1％)、Phieco32样病毒属(5.3％)、T5样噬菌体属(3.4％)等.548个噬菌体中有22种丰度超过了1％,主要为肠细菌噬菌体P1(7.0％)、链球菌噬菌体LYGO9(6.1％)、肠细菌噬菌体λ(5.3％)、肠细菌噬菌体Phieco32(5.2％)、链球菌噬菌体phi30c(3.8％)等.此外,不同大熊猫繁育基地之间噬菌体群落结构存在显著差异(科水平:R=0.168,P＜0.01;属水平:R=0.128,P＜0.01;种水平:R=0.291,P＜0.01),在α多样性指数方面SSP基地的Chao1指数与其他两个基地之间存在着显著差异.本研究发现大熊猫肠道噬菌体种群丰富多样,且因生境不同而显著变化;结果有助于挖掘大熊猫肠道噬菌体在疾病防控及治疗的潜力,为保障大熊猫的肠道健康提供新的思路.

人工转录装置可以按照所设计的方式在原核细胞和真核细胞中调节基因表达.本研究在大肠杆菌中设计并构建了一种由合成启动子和人工转录因子构成的人工转录装置:其中,合成启动子包含了一种弱启动子Pk突变体与位于其上游的λ噬菌体操纵区(OR2或OR3)的不同组合,而人工转录因子则利用细菌RNA聚合酶α亚基的N端和λ噬菌体CI蛋白的C端组成的融合蛋白α-CI作为效应域,CI蛋白作为DNA结合结构域.利用绿荧光蛋白作为报告基因对这一人工转录装置检测发现,它可以成功开启报告基因的转录活性.随后通过改变这一人工转录装置的某些参数,例如,增加启动子上游操纵序列的拷贝数、使用温敏型CI取代野生型CI、在系统中引入CI的阻遏蛋白Cro等多种方式,实现了对报告基因转录强度的精细调控.这一人工可调控转录装置可以在原核细胞中实现对报告基因表达强度的精细调控,在原核细胞中调节基因线路的信号输出强度方面具有一定的应用前景.

自2例人脑胶质瘤手术标本中纯化mRNA，逆转录合成双链cDNA分子。在T 4DNA连接酶作用下，与Adaptor插头相连。经T 4多聚核苷酸激酶磷酸化后，再与脱磷酸处理过的λgt11臂连接，得到重组λgt11DNA。体外包装，构建了一个库容量含1.02×10 6重组子的人脑胶质瘤cDNA基因文库，该文库的克隆效率为1.08×107pfu/μgcDNA，重组百分比为96.2%。并初步筛选出了胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的cDNA克隆，其频率为0.02%。