目的:探讨腺病毒介导的人工合成东亚钳蝎氯毒素（Ad-rBmK CTa）对人胶质瘤U251细胞的抑制作用及其相关机制。方法:设置3.5×10 9、7.0×10 9、3.5×10 10pfu/ml三个效价梯度Ad-rBmK CTa组，分别作用于U251细胞24、48、72 h，同时设置空白对照组（不加入细胞和Ad-rBmK CTa）、阴性对照组（只加入U251细胞）。通过激光共聚焦荧光显微镜观察病毒感染情况；采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测各组细胞增殖情况；采用流式细胞术检测各组细胞周期及细胞凋亡；采用蛋白质印迹法检测凋亡相关蛋白bax、bcl-2和caspase-3表达情况。 结果:Ad-rBmK CTa作用于U251细胞24 h后感染效率达90%以上。随着Ad-rBmK CTa效价升高，作用相同时间的U251细胞增殖抑制率逐渐升高（均 P<0.01）；随着时间延长，同一效价Ad-rBmK CTa作用的U251细胞增殖抑制率亦逐渐升高（均 P<0.01）。7.0×10 9 pfu/ml Ad-rBmK CTa作用于U251细胞48 h后，G 0/G 1期细胞比例为（40.7±0.8）%，S期和G 2期细胞比例分别为（35.7±0.6）%、（23.6±1.4）%，差异具有统计学意义（ F=225.119， P<0.01）。7.0×10 9 pfu/ml Ad-rBmK CTa作用于U251细胞24、48、72 h时，细胞凋亡率分别为（7.4±1.4）%、（19.2±1.7）%和（22.3±1.7）%，差异有统计学意义（ F=49.470， P<0.01）。7.0×10 9 pfu/ml Ad-rBmK CTa作用于U251细胞48 h后，与阴性对照组相比，bax、caspase-3蛋白的表达水平升高，bcl-2蛋白表达水平下降。 结论:Ad-rBmK CTa可能作用于DNA损伤诱导的G 1/S检测点，使细胞周期停滞于G 0/G 1期，从而抑制U251细胞的体外增殖，但其诱导U251细胞凋亡的作用并不明显。其机制可能与氯离子 -通道直接或间接受到抑制相关。

蝎子作为世界上广泛分布的最古老的动物之一,有着悠久的药用历史.在我国,中药全蝎即为东亚钳蝎Buthus mar-tensii的干燥体,是传统名贵药材,主要用于治疗肝风内动、痉挛抽搐、小儿惊风等.一直以来,蝎毒被认为是蝎子的活性物质,对小分子物质的研究相对匮乏.通过查阅近年来国内外的相关文献,发现蝎子中含有氨基酸类、脂肪酸类、甾类、生物碱类等化学成分,并显示抗菌、抗凝血、代谢调节、抗肿瘤等多种活性.该文对蝎子中小分子化学成分和药理活性等方面进行综述,以期为蝎子中的新颖活性分子的发现以及临床应用提供参考依据.

全蝎是我国临床常用动物药材,《中国药典》规定全蝎的唯一基原为钳蝎科动物东亚钳蝎,但目前我国蝎目物种丰富,全蝎药材及其深加工制品都存在混伪现象,其中全蝎深加工制品在加工过程中,其显微特征可能不完整或丢失,使得基原鉴别变得困难.该研究基于东亚钳蝎与其他蝎物种的形态和氧化酶亚基1(COⅠ)序列,构建ML系统发育树进行物种鉴定,从而发现全蝎主要混伪品为细尖狼蝎;使用特异性聚合酶链式反应(PCR)鉴定方法,通过CO Ⅰ序列的差异SNP位点设计东亚钳蝎特异性鉴别引物,并筛选出全蝎药材与其配方颗粒的稳定引物区间,对全蝎药材及配方颗粒进行鉴定.通过优化PCR反应体系,当退火温度61 ℃、循环次数30次时,东亚钳蝎及其配方颗粒均可扩增出约150 bp明亮的特异性条带,其他混伪品均无条带.并对该方法的适应性进行考察,全蝎药材到冻干粉再到配方颗粒以及市售配方颗粒均可扩增出约150 bp的条带.研究结果表明,该方法可用于全蝎药材及其配方颗粒真伪鉴别,有利于完善全蝎配方颗粒的质量控制体系,为其临床应用提供保障.

目的:建立一种能同时鉴别全蝎(东亚钳蝎)及其混伪品细尖狼蝎的有效方法.方法:基于东亚钳蝎和细尖狼蝎的线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(CO Ⅰ)基因差异,设计区分东亚钳蝎、细尖狼蝎的特异性引物,建立多重PCR方法,并对退火温度、引物浓度、循环次数、DNA模板用量等条件进行优化筛选.对不同来源的东亚钳蝎和细尖狼蝎样品进行实测验证,根据特异性条带大小进行鉴别.结果:当退火温度为51.6℃,循环次数为30,DNA模板用量为30 ng时,东亚钳蝎和细尖狼蝎分别出现约342 bp和108 bp的特异性条带.结论:该方法可以实现东亚钳蝎、细尖狼蝎及掺杂样品的快速而又准确地鉴别,并可弥补传统鉴别方法的不足.

东亚钳蝎是我国传统名贵中药材,由于其具有抗微生物、抗肿瘤、镇痛等多种药理作用而被广泛深入地研究.现代研究表明,东亚钳蝎毒液中的活性多肽是其发挥药理作用的主要功能分子.通过对国内外有关东亚钳蝎多肽药理活性的研究进展进行概述,以期为东亚钳蝎潜在药用活性多肽的开发利用提供参考.

东亚钳蝎氯离子通道毒素(Buthus martensii Karshch chlorion channel toxin,BmK CT)是一类短链神经毒素,在体内和体外均能有效抑制神经胶质瘤细胞侵袭和增殖.然而,BmK CT抑制胶质瘤细胞增殖活性的机制尚不清楚.本研究采用代谢组学的方法探索BmK CT抑制人脑神经胶质瘤细胞增殖的分子机制.首先,通过蛋白质表达纯化获得带有谷胱甘肽S转移酶(glutathione S-transferase,GST)标签的BmK CT蛋白和GST蛋白.利用圆二色谱检测两种蛋白质均具有α-螺旋二级结构,并且融合蛋白质GST-BmK CT热稳定性较好.通过噻唑蓝(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide,MTT)法检测GST-BmK CT对神经胶质瘤细胞(U251和A172)增殖的影响.结果显示,与GST处理组相比,1 μmol/L GST-BmK CT处理组对U251细胞的抑制率更明显(U251细胞19±1.1 vs.2.25±0.95,P＜0.001,48 h;A172细胞12±1.4vs.2.25±1.25,P＜0.001,48 h).利用气相色谱-质谱联用仪(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)分析鉴定出细胞内的63种代谢物,通过通路分析和聚类分析证实,GST-BmK CT处理影响神经胶质瘤细胞的有氧糖酵解.根据峰面积统计数据显示,GST-BmK CT处理降低胞内丙酮酸的含量.GST-BmK CT处理组相比GST组,明显下调胞外培养基的乳酸分泌(16.33±3.78 vs.35.6±2.31,P＜0.001,48 h),葡萄糖消耗(2.04±0.09 vs.2.64±0.04,P＜0.05,48 h)和胞内腺苷三磷酸(ATP)含量(633.79±0.001 vs.5392.71±266.67,P＜ 0.05,48h).结果表明,GST-BmK CT通过下调胶质瘤细胞有氧糖酵解水平降低ATP的生成.实时荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹结果显示,GST-BmK CT降低U251细胞丙酮酸激酶(pyruvate kinase M2,PKM2)在转录水平和翻译水平的表达,进一步发现GST-BmK CT通过下调低氧诱导因子(hypoxiainducible factor-1α,HIF-1α)降低PKM2在转录水平的表达.以上结果表明,BmK CT通过下调HIF-1α的表达,降低PKM2介导的有氧糖酵解从而抑制神经胶质瘤细胞的增殖活性.

目的:本研究通过COI序列对全蝎及其混伪品进行DNA条形码鉴别,为全蝎药材分子鉴定提供科学依据.方法:通过野外采集东亚钳蝎正品,对采集样品形态学鉴定、DNA提取、PCR扩增COI序列,测序建立东亚钳蝎的正品COI数据库,通过比对确定东亚钳蝎正品和伪品的DNA条形码.结果:实验共获取310份东亚钳蝎样本.通过序列分析,确定东亚钳蝎COI序列长度为658 bp.采用MEGA 6.0软件对东亚钳蝎样品及混伪品进行序列比对,构建邻接(NJ)树.结果表明东亚钳蝎COI序列扩增成功,与混伪品COI序列明显区分.结论:本研究运用COI条形码序列可准确鉴定全蝎的基原动物及其混伪品,为后续全蝎药材的分子鉴定提供了新的可行性方法.

目的 建立正品全蝎(东亚钳蝎)的特异性DNA分子鉴别方法.方法 采用DNA条形码技术,基于线粒体细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ (COⅠ)基因序列,设计全蝎的特异性引物,对全蝎药材及含全蝎的中成药脑心通胶囊进行PCR扩增及测序,将获得的序列在GenBank数据库中应用BLAST进行结果判定,结果中相似性最高的序列对应物种为待测样品最接近的物种.结果 引物SF1R1和SF2R4均可特异性扩增东亚钳蝎的DNA,产生大小为250～260 bp的条带;且应用这两对引物均在脑心通胶囊中检测到东亚钳蝎,与胶囊所用投料药材一致.结论 基于COⅠ序列的DNA条形码技术可用于全蝎药材及脑心通胶囊中全蝎的鉴定,该方法准确、简便、具有高特异性和灵敏度,具有实际应用价值.

本研究通过以东亚钳蝎毒腺为研究材料,采用TRIzo1法分离透明质酸酶的全基因序列,并从中分离出4个东亚钳蝎透明质酸酶序列,分别命名为BmHY Ⅰ、BmHYⅡ、BmHYⅢ和BmHY Ⅳ.BmHY Ⅰ cDNA全长是1 423 bp,包括42 bp的5'非翻译区,1 230 bp的开放阅读框,编码了一个410个氨基酸,还有151bp的3'非翻译区;BmHY Ⅰ中包含5个糖基化位点;与其它物种蛋白质比对结果显示,BmHYⅠ中有10个高度保守半胱氨酸残基形成5个二硫键.BmHY Ⅰ在二级结构中形成了13个螺旋和14个折叠,其中折叠主要分布在N端和C端.系统进化树结构表明,东亚钳蝎BmHY Ⅰ与其它蝎子物种透明质酸酶亲缘关系最近,其次是蜘蛛,最后是脊椎动物.而BmHY Ⅱ、BmHY Ⅲ和BmHY Ⅳ序列缺少终止密码子,蛋白序列与BmHY Ⅰ具有高度同源性.本研究结果为进一步透明质酸酶的功能提供数据参考.

目的 基于毒素多肽建立一种新型的全蝎质量检测工艺.方法 从东亚钳蝎毒液中分离得到了一种新型钠通道毒素BmK NaTx-13,制备并鉴定了BmK NaTx-13的特异性抗体,并通过竞争性ELISA法检测全蝎提取物中的BmK NaTx-13的含量.结果 建立的竞争性酶联免疫吸附法可快速检测全蝎提取物中的BmK NaTx-13的含量并呈现良好的浓度线性依赖.结论 该研究为全蝎质控提供了一种快速免疫检测方法,为提升全蝎入药质量标准提供了借鉴.