目的:研究Ⅵ型分泌系统(type Ⅵ secretion system，T6SS)在鲍曼不动杆菌致病性和耐药性中的作用。方法:收集2016年1月1日至12月31日温州医科大学附属第一医院分离自血流感染患者血液标本的45株鲍曼不动杆菌株，采用VITEK 2 Compact全自动微生物分析仪测定其对抗菌药物的敏感性，通过聚合酶链反应检测菌株T6SS主要效应蛋白编码基因溶血素调节蛋白的携带情况，对T6SS阳性鲍曼不动杆菌和T6SS阴性鲍曼不动杆菌分别进行生物膜形成能力检测、抗血清试验和体外竞争试验，收集并分析鲍曼不动杆菌血流感染患者的临床资料及转归情况。统计学分析采用 t检验、秩和检验和 χ2检验。 结果:45株鲍曼不动杆菌中24株T6SS阳性，阳性率为53.3%。T6SS阳性鲍曼不动杆菌对头孢他啶、环丙沙星、庆大霉素、亚胺培南、左氧氟沙星、哌拉西林/他唑巴坦、妥布霉素和头胞吡肟的耐药率分别为95.8%、95.8%、66.7%、95.8%、79.2%、95.8%、79.2%和91.7%，高于T6SS阴性鲍曼不动杆菌的28.6%、28.6%、28.6%、28.6%、9.5%、23.8%、23.8%和28.6%，差异均有统计学意义( χ2＝22.12、22.12、6.51、22.12、21.83、24.72、13.79、18.97，均 P<0.05)。T6SS阳性鲍曼不动杆菌的生物膜形成能力、血清抗性和竞争能力均高于T6SS阴性鲍曼不动杆菌，差异均有统计学意义( t＝4.99、 Z＝－2.61、 Z＝－2.27，均 P<0.05)。重症监护病房(intensive care unit，ICU)来源鲍曼不动杆菌的T6SS阳性率为80.0%(16/20)，高于非ICU来源菌株的32.0%(8/25)，差异均有统计学意义( χ2＝10.29， P<0.05)，但鲍曼不动杆菌是否携带T6SS对患者病死率的影响差异无统计学意义( χ2＝1.74， P＝0.188)。 结论:T6SS阳性鲍曼不动杆菌具有较高的致病性，且其高耐药率使得治疗较困难，亟需引起临床医师尤其是ICU医师的高度重视。

目的:通过突变的方式构建含有鼠 Thy1.1基因或鼠 Thy1.2基因的HIV-1 CRF07_BC感染性克隆，建立CRF07_BC亚型体外竞争试验。 方法:用鼠 Thy1.1基因和鼠 Thy1.2基因替换CRF07_BC亚型感染性克隆pXJDC6291-13 Nef区前218个碱基，构建成CRF07_BC感染性克隆BCEA1和BCEA2质粒。BCEA1和BCEA2进行293T细胞转染后获得病毒，测定病毒滴度，以等比例病毒含量共感染PM1细胞，在感染的第3、4、5、6天收集细胞并用 Thy1.1和 Thy1.2特异性抗体标记细胞，并进行流式细胞检测病毒适应性。通过"TFitness"程序(http：//bis.urmc.rochester.edu/vFitness)计算病毒相对适应性。并观察耐药位点K103 N、多态性位点K166R相对于CRF07_BC亚型相对适应性的影响。 结果:CRF07_BC亚型BCEA1和BCEA2两病毒的相对适应性(1+s)结果为1.06±0.23693，无统计学差异，建立了CRF07_BC亚型体外生长竞争性试验。利用该体外生长竞争试验验证K103 N和K166R突变株与野生株的相对适应性，BCEA2-K103 N/BCEA1相对适应性是0.728282±0.16608、BCEA2-K166R/BCEA1是0.883385±0.19023、BCEA2-K103 N+K166R/BCEA1是0.804604±0.06164。K103耐药位点突变株与野生株相对适应性存在统计学差异。结论:建立HIV-1 CRF07_BC病毒适应性的体外生长竞争试验，基于该体外竞争试验，HIV-1 K103 N的耐药毒株的病毒适应性降低。

紧密连接广泛存在于上皮细胞间和内皮细胞间,能够调控旁细胞途径的物质转运并维持细胞极性.其中,肠上皮细胞间的紧密连接可阻止各种抗原渗漏至血液循环,维持机体稳态,而这一机制的破坏可能导致多种肠道以及肠外疾病.连蛋白作为肠上皮紧密连接开放剂,其水平升高是乳糜泻等肠道疾病发生的早期事件,而醋酸拉唑肽(larazotide acetate,亦称AT-1001)是连蛋白竞争性抑制剂,已有体外实验和临床试验表明AT-1001可有效稳定紧密连接复合物的结构、增强屏障功能,缓解由紧密连接屏障功能破坏所引起的疾病的发生和发展.本文重点综述了 AT-1001的作用机制及近年来在乳糜泻等多种疾病中应用的研究,为AT-1001未来的临床应用提供了全面的认识.

背景与目的 长非编码RNAs(long noncoding RNAs,lncRNAs)在各种癌症中发挥至关重要的作用.在本研究中,我们旨在研究肺腺癌(lung adenocarcinoma,LUAD)中上调以及和生存相关的lncRNA LINC00525的功能和分子机制.方法 采用定量逆转录聚合酶链式反应(quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,RT-qPCR)和原位杂交(in situ hybridization,ISH)测定组织中LINC00525的表达水平.在体内外实验中,采用功能获得和功能丧失的方法研究LINC00525在LUAD中的功能作用.RNA pull-down,RNA免疫沉淀(RNA immunoprecipitation,RIP)、染色质免疫沉淀(chromatin immunoprecipitation,ChIP)、三联体捕获试验、双荧光素酶检测试验、基因表达芯片和生物信息学等手段用于研究潜在机制.结果 LINC00525在LUAD细胞和组织中高表达.生存分析表明,LINC00525的上调与LUAD患者的不良预后相关.体外敲低LINC00525可抑制细胞增殖和细胞周期进程.在异种移植模型中,LINC00525的敲低抑制了荷瘤小鼠的肿瘤生长和肿瘤发生.其机制为LINC00525通过与p21启动子形成RNA-DNA三联体,引导Zeste增强子多聚梳抑制复合物2亚基(zeste 2 polycomb repressive complex 2 subunit,EZH2)至p21启动子,导致p21启动子的组蛋白3(trimethylation of lysine 27 on histone 3,H3K27me3)Lys27三甲基化增加,从表观遗传水平抑制p21表达.另外,LINC00525还通过与RNA结合基序单链相互作用蛋白2(RNA binding motif single stranded interacting protein 2,RBMS2)竞争性结合,促进p21 mRNA的衰变,从而在转录后水平抑制p21的表达.结论 我们的研究结果表明,LINC00525与EZH2和RBMS2协同降低p21 mRNA的转录和稳定性,从而促进LUAD的进展,表明LINC00525可能是LUAD临床干预的潜在治疗靶点.

目的 构建阴沟肠杆菌blaNDM-1基因敲除株,并探讨blaNDM-1基因缺失对阴沟肠杆菌生物学特性的影响.方法 采用Red同源重组技术构建阴沟肠杆菌blaNDM-1敲除株并通过PCR和RT-qPCR法进行验证,对原始菌株和blaNDM-1敲除株进行药敏试验、生长曲线绘制和体外竞争试验.结果PCR、DNA测序和RT-qPCR表明成功构建阴沟肠杆菌blaNDM-1敲除株.药敏试验显示原始菌株对亚胺培南、美罗培南和厄他培南均耐药,而blaNDM-1敲除株对其均敏感;原始菌株和基因敲除株在LB液体培养基中具有相似的增殖曲线;两者体外竞争试验的竞争指数值为0.69.结论 Red同源重组技术可用于阴沟肠杆菌基因的敲除,且blaNDM-1基因对阴沟肠杆菌的耐药性及竞争力都有影响.

目的 研究体外诱导多黏菌素耐药肺炎克雷伯菌的适合度代价,并分析耐药株的分子特性.方法 采用体外诱导方法将临床分离的3株多黏菌素敏感肺炎克雷伯菌诱导成多黏菌素耐药株;微量肉汤稀释法检测体外诱导耐药前后菌株对临床常用抗菌药物的最低抑菌浓度(minimal inhibititory concentration,MIC);采用PCR方法检测多黏菌素耐药相关基因pmrA、pmrB、mgrB、phoP和hoQ,并对阳性片段进行测序比对分析;对诱导耐药菌株及其对应敏感菌株进行生长曲线分析、生物膜形成能力检测及体外竞争和抗血清试验,分析研究多黏菌素耐药肺炎克雷伯菌的适合度代价.结果 3株诱导耐药株中均检出pmrB(T157P)突变,在诱导株FK713R和FK729R携带的mgrB基因中分别检出ISkpn14和IS51ike插入序列.诱导耐药株与敏感株相比,24h生长曲线未发现明显差异;生物膜形成能力检测结果发现诱导耐药株与敏感株生物膜形成能力无明显差异;3株菌获得多黏菌素耐药后均表现出一定程度的体外竞争缺陷,竞争指数(CI值)分别为0.01、0.54和5× 10-4;3株诱导耐药菌中有2株(FK713R和FK729R)与其敏感菌相比出现抗血清作用增强现象.结论 肺炎克雷伯菌获得多黏菌素耐药后会出现一定的适合度改变,不同的耐药机制可能会引起不同的适合度表现.

为了探讨绿木霉与褐环乳牛肝菌的互作机理,在体外共培养条件下,采用光学显微镜和扫描电镜对二者生长重叠部分进行体外观察,发现二者生长无相互影响,在营养生长方面几乎不存在竞争关系.为进一步揭示绿木霉与褐环乳牛肝菌的互作机制,采用体外诱导和生物化学等方法,向褐环乳牛肝菌发酵液中加入灭活绿木霉菌丝诱导物,每天对发酵液中的多酚氧化酶、几丁质酶、漆酶和中性蛋白酶等酶活性进行检测.试验结果表明,绿木霉诱导褐环乳牛肝菌产漆酶能力最强;在整个共培养过程中,多酚氧化酶和漆酶活力始终处于较高水平,在诱导培养第6天,这两种酶活性升至最高,分别达到25.2U/mL和1 580U/mL;灭活绿木霉菌丝对褐环乳牛肝菌几丁质酶的诱导具有“瞬时性”,在诱导培养第2天即检测到较高的几丁质酶活性;中性蛋白酶的活性变化基本上呈先上升后下降的规律,且能增大褐环乳牛肝菌中性蛋白酶的固有产量,形成“叠加效果”.综上所述,绿木霉对褐环乳牛肝菌几乎不存在营养竞争关系,但其灭活菌丝体对褐环乳牛肝菌发酵液的多种酶活性存在诱导增效作用.

目的 筛选和鉴定艰难梭菌毒素B适配子(Apt).方法 体外合成80 bp的单链DNA(ssDNA)随机文库,重组表达艰难梭菌毒素B蛋白,利用指数富集配体系统进化(SELEX)技术筛选艰难梭菌毒素B的核酸适配子.使用DNA MAN5.2.2.0软件和mfold软件筛选出的适配子序列进行同源性和二级结构的分析,并利用非竞争酶联免疫吸附试验(ELISA法)测定其亲和常数.结果 经过12轮筛选,文库中随机ssDNA与艰难梭菌毒素B的结合率从0.8％ 增加到39.6％,筛选出51条适配子,二级结构最稳定的是Apt-B20,其亲和常数为3.76×10-7.结论 利用SELEX技术成功筛选出高亲和力的Apt,为临床上艰难梭菌感染的实验室快速诊断提供一定的参考依据.

目的:利用噬茵体7肽库筛选子宫内膜异位症细胞表面的特异性结合肽.方法:利用噬菌体展示技术体外快速差减筛选子宫内膜异位症异位内膜细胞和在位内膜细胞,经过连续5轮生物淘洗,随机挑选50个噬茵体克隆,通过ELISA筛选并进行DNA测序,再通过噬茵体竞争抑制试验来验证阳性噬菌体的亲和性.结果:①经过ELISA实验,其中OD450值大于0.5的共有13个噬菌体克隆被选出,经DNA测序,13个噬菌体克隆中包含6个不同的氨基酸序列,其中5个克隆有共同序列为CGCACCCGCCTGCATACCCGC,其相应的氨基酸序列为RTRLHTR.②多肽RTRLHTR与子宫内膜异位症细胞的结合能力呈多肽剂量依赖性降低,而对照组多肽没有显示这种特异性结合活性.结论:噬茵体展示技术筛选的多肽RTRLHTR可望为子宫内膜异位症早期诊断及治疗提供新的方向.

目的 筛选和鉴定艰难梭菌(Cd)毒素A(TcdA)适配子(Apt).方法 体外合成80 bp的单链DNA(ssDNA)随机文库,采用指数富集配体系统进化(SELEX)技术筛选TcdA的核酸适配子.使用DNA MAN5.2.2.0软件和mfold软件对筛选出的适配子序列的同源性和二级结构进行分析,并采用非竞争酶联免疫吸附试验测定其亲和常数.结果 经过12轮筛选,文库中随机ssDNA与TcdA的结合率从1.4％ 增加到44.6％,筛选出来50条适配子,二级结构最稳定的是Apt-A22,其亲和常数为2.25×107 M-1.结论 采用SELEX技术成功筛选出高亲和力的TcdA适配子,为临床Cd感染的诊断和治疗提供参考依具.