目的:利用指数富集的配体系统进化技术(SELEX)筛选与大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)特异性结合的核酸适配子(apt)，探讨apt与BMSCs的结合方式及能力。方法:利用SELEX技术，以大鼠BMSCs为靶点，从构建的核酸文库中反复筛选、克隆、测序及分析，获得候选apt。流式细胞术测定和软件分析获得不同浓度(0、4、8、16、32、64、128、256 nmol/L)候选apt与BMSCs的结合曲线及平衡解离常数。胰酶消化实验探究apt与BMSCs结合的靶点，并观察apt体外捕获BMSCs的能力。结果:流式细胞术与荧光共聚焦实验表明SELEX筛选第9轮文库与BMSCs结合能力最高。经序列分析适配子apt7与BMSCs的亲和力最高，平衡解离常数为(11.79±0.72) nmol/L。胰酶消化实验表明当胰酶消化细胞时间超过10 min后，apt7与BMSCs的亲和力下降甚至消失。体外捕获实验表明固定于培养皿上面的apt7能体外捕获骨髓细胞液中的大鼠BMSCs。结论:本研究通过SELEX技术成功分离出能高亲和力、高特异性结合大鼠BMSCs的特异性适配子apt7，为进一步将适配子应用于组织工程支架表面招募循环干细胞研究提供了实验依据。

开发了石英晶体微天平(QCM)-指数富集配体系统进化(SELEX)技术,用于筛选出与砷(Ⅲ)有高亲和力的适配体.设计随机单链DNA文库,以砷(Ⅲ)为靶标固定在巯基乙胺修饰的晶振片上,捕获溶液中处于游离状态的适配体,构建QCM-SELEX筛选方法.经过6轮筛选,对次级文库进行高通量测序,通过QCM共振频率变化计算得出6S1解离系数Kd值为0.36 μmol/L.将6S1作为探针,构建QCM生物传感器用于检测砷(Ⅲ),该传感器在0.01 μmol/L～0.2 μmol/L范围内有较好的线性关系,对砷(Ⅲ)检测限为5.2 nmol/L(3σ),具有良好的选择性.

目的:筛选血管炎性标志物脂蛋白相关磷脂酶A2（Lp-PLA2）的DNA适体，并建立以非标记核酸适体-纳米金为探针的可视化检测方法。方法:方法学建立。通过磁珠固定SELEX技术经孵育结合、ssDNA分离、PCR扩增、单链回收的8轮循环筛选Lp-PLA2适体，利用表面等离子体共振技术和流式细胞术验证适体的亲和力和特异性，并通过计算机软件模拟适体二级结构及其与靶蛋白的三维分子对接。随后制备适体-纳米金复合物，利用靶标竞争结合导致纳米金溶液在盐诱导下凝聚引起颜色变化，分光光度计检测溶液的吸光度检测靶标浓度，建立样品溶液中Lp-PLA2浓度与吸光度的线性关系。结果:筛选获得3条高亲和力、强特异性的Lp-PLA2核酸适体B76-2、B76-4及B76-5，解离常数分别为1.07、1.26及1.75 nmol/L；并成功基于B76-2适体构建纳米金比色传感方法，其线性范围和检测限分别是20~500 ng/ml和78 ng/ml，反应时间30 min，可特异性区分靶标与其他血栓标志物如凝血酶和髓过氧化物酶。结论:利用核酸适体-纳米金显色实现了简单、快速、特异的Lp-PLA2可视化检测。

核酸适配体是由 20-100 个核苷酸组成的单链脱氧核糖核酸(ssDNA)或核糖核酸(RNA),一般是通过指数富集的配体系统进化技术(SELEX)进行筛选.核酸适配体可以与多种靶标物质特异性结合,包括毒素、金属离子、生物大分子、微生物等,已被广泛应用于食品检测、医疗诊断等领域.细胞作为人体最基本的组成单位是大多数疾病病理机制和治疗策略的研究重心.近年来,核酸疗法以更安全更高效的优势成为疾病治疗领域的研究重心,研究人员认识到核酸适配体的靶向结合能力可以应用到细胞的靶向治疗中.因此,开发出Cell-SELEX技术用于筛选可以靶向细胞标志物的核酸适配体.细胞特异性核酸适配体与传统的核酸适配体的区别,在于它们的特异性靶标是细胞成分,它们可以直接结合与细胞生长和代谢相关的物质影响细胞生理活动,也可以作为靶向递送工具递送药物,在疾病的精准治疗中具有突破性影响.因此,细胞特异性核酸适配体引发了广泛关注.本文对细胞特异性核酸适配体在多种疾病治疗中的研究进展进行了综述,以期为其在人类疾病治疗中的应用提供参考.

核酸适配体以其类似抗体的功能及诸多优于抗体的特点引起人们的广泛关注,如何利用指数富集的配基系统进化技术(SELEX技术)来高效地筛选核酸适配体是其应用的关键.结合近些年核酸适配体的研究进展,为提高筛选效率及核酸适配体性能,针对适配体筛选三大不同环节所做的尝试及改良进行相关的阐述,包括初始随机寡核苷酸文库的设计与修饰、筛选过程所用方法及次级文库的制备、筛选过程后(Post-SELEX)核酸适配体性能的优化等;特别比较了筛选方法包括毛细管电泳SELEX、细胞SELEX、磁珠SELEX、加尾SELEX、微流控SELEX、微阵列SELEX和高通量SELEX,以及次级文库的制备方法诸如不对称PCR法、λ核酸外切酶法、磁珠法、不等长PCR法、综合性方法等;对核酸适配体发展面临的问题及发展前景进行探讨,以期为相关科研人员的研究提供参考.

核酸适体是运用指数富集的配体系统进化(systematic evolution of ligand and by exponential enrichment,SELEX)技术从人工体外合成的随机寡核苷酸序列库中,经过多轮筛选后得到的单链DNA或RNA,具有识别靶标范围广、亲和力高和稳定性好等优势.Cell-SELEX技术是指将整个细胞作为靶标筛选特异性核酸适体的技术,近年来已经广泛应用于肿瘤细胞特异的核酸适体筛选.本研究综述了Cell-SELEX技术的筛选过程以及通过cell-SELEX技术产生的核酸适体在肿瘤标志物、肿瘤靶向治疗和循环肿瘤细胞的识别与检测等方面的应用研究进展.

目的 应用SELEX技术筛选与HER2蛋白特异性结合的适配子(aptamer),探讨其对胃癌的抗肿瘤活性.方法 (1)建立DNA寡核酸文库,通过SELEX技术筛选出HER-2核酸适配子,并行核酸适配子的鉴定及结构修饰.(2)采用胃癌细胞株的细胞增殖试验(MTT)及流式细胞术的细胞凋亡与增殖体外研究HER-2核酸适配子对高表达HER-2胃癌细胞的抑瘤活性.(3)建立Balb/C裸鼠胃癌模型,研究HER-2核酸适配子对高表达HER-2胃癌细胞的抗瘤活性.结果 (1)筛选获得的胃癌细胞HER-2核酸适配子86个核苷酸序列,对NCI-N87蛋白裂解液中HER-2具有较好的亲和反应.(2)细胞增殖试验(MTS)显示HER-2适配子对NCI-N87细胞增殖活力具有显著的抑制作用,流式细胞术显示其能显著诱导NCI-N87细胞的凋亡.(3)体内胃癌模型实验显示HER-2核酸适配子能抑制肿瘤生长.结论 采用SELEX技术筛选出高特异性及高亲和力结合HER-2的核酸适配子,通过体内外实验均证实HER-2核酸适配子可以抑制胃癌细胞生长、促进胃癌细胞凋亡而呈现良好的抗瘤活性.

肿瘤干细胞具有自我更新和多向分化潜能,在肿瘤生成、转移、复发和放化疗抗性等方面起着重要作用,是近年来肿瘤研究的热点.适配子是小分子寡核苷酸,具有极强的靶向性和亲和力,是肿瘤诊断和治疗的新型核酸分子.目前利用适配子进行肿瘤干细胞的诊断和治疗的研究越来越多,为肿瘤的诊断和治疗提供新的研究工具.

节球藻毒素-R(nodularin-R,NOD-R)是具有强烈肝毒性的蓝藻毒素.然而,现有的NOD-R检测技术均存在一定的局限性,亟待开发一种新的检测方法.本文利用指数富集的配基系统进化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)技术结合高通量测序(HT-SELEX),筛选出NOD-R特异的高亲和力适配体.生物膜干涉(biolayer interferometry,BLI)技术对适配体的鉴定结果表明,适配体H62与NOD-R之间的亲和力最高,达到了168 nM.而且,该适配体不与其他毒素结合,具有较高的特异性.以上结果表明,适配体H62有望作为NOD-R检测新方法——适配体生物传感器的分子识别元件.

指数富集的配基数系统进化(SELEX)技术的基本过程是用化学方法合成一个单链寡核苷酸库,将之于与靶标物质混合,寡核苷酸链与靶标物质结合形成复合物,去除未结合的核酸链后,再将结合的核酸分子与靶标物质分离,以此寡核苷酸分子为模板进行PCR扩增,用其产物进行下一个循环的筛选.经过数次循环,即可得到能与靶标物质高亲和力高特异性结合的核酸适配体分子.本文综述了SELEX技术筛选核酸适配体技术的一些研究进展.