目的 原核表达并纯化麻疹病毒(measles virus,MV)核蛋白(N),免疫家兔后制备兔抗MV N抗血清,并鉴定其特异性.方法 以MV-S191疫苗株基因组为模板,PCR扩增N基因3个片段,构建重组表达质粒pGEX-MV-N1、pGEX-MV-N2和pGEX-MV-N3,分别转化至E.coli BL21(DE3)中诱导表达N-末端带有GST标签的融合蛋白GST-MV-N1、GST-MV-N2和GST-MV-N3,纯化后,分别与等体积弗氏完全佐剂(初次免疫)、弗氏不完全佐剂(加强免疫)混合,乳化均匀后各免疫1只雌性家兔,共免疫6次,采集全血,分离血清获得兔抗MV N抗血清,Western blot法及间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence assay,IFA)鉴定其特异性.结果 重组表达质粒 pGEX-MV-N1、pGEX-MV-N2 和pGEX-MV-N3经双酶切、PCR及测序鉴定证明构建正确;表达的GST-MV-N1和GST-MV-N3融合蛋白相对分子质量分别约42 000和39 000,主要以包涵体形式存在,纯度分别为96％和85％,而上清和沉淀中均未见GST-MV-N2融合蛋白的表达;兔抗MVN3抗血清能特异性识别MV-S191感染细胞后表达的N蛋白,且特异性高于兔抗MV-N1抗血清.结论 成功制备了兔抗MV N抗血清,为重组MV疫苗的研发以及MV结构蛋白抗体的制备提供了技术支持.

目的:探讨GATA3与FOXA1在luminal亚型乳腺癌细胞中的相互作用.方法:基于cBioportal For Cancer Genomics公共数据库中乳腺癌临床病例数据集,分析luminal A、luminal B和basal-like亚型乳腺癌组织中GATA3与FOXA1mRNA表达水平的相关性;利用蛋白-蛋白相互作用数据库STRING和分析工具Cytoscape预测GATA3与FOXA1的相互作用.以luminal亚型的MCF-7和T-47D乳腺癌细胞以及basal-like亚型的MDA-MB-231和SUM-149PT乳腺癌细胞为研究对象,采用RT-qPCR和Western印迹检测GATA3和FOXA1的mRNA和蛋白表达水平;细胞免疫荧光检测GATA3和FOXA1的细胞定位;蛋白质免疫共沉淀验证GATA3与FOXA1之间的相互作用.结果:临床病例数据分析显示GATA3与FOXA1在luminal A、luminal B和basal-like亚型乳腺癌组织中mRNA的表达均呈正相关(r=0.404 7、0.476 1、0.587 6,均P＜0.000 1).蛋白质相互作用预测显示GATA3与FOXA1存在潜在的相互作用关系.Luminal乳腺癌细胞中GATA3和FOXA1的mRNA(t=80.95、79.73、33.84、33.60,均P＜0.000 1;t=15.24、5.21、14.95、14.93,均 P＜0.001)和蛋白(t=29.63、28.48、36.60、35.60,均 P＜0.000 1;t=34.06、35.30、75.01、74.32,均P＜0.000 1)表达水平显著高于basal-like细胞.GATA3与FOXA1在MCF-7和T-47D细胞核中共定位.GATA3与FOXA1存在蛋白相互作用.结论:GATA3与FOXA1可能通过相互作用维持luminal亚型乳腺癌表型稳态,抑制肿瘤恶性进展.

目的 探讨lncRNA LINC01612(LINC01612)对食管鳞状细胞癌(ESCC)细胞生物学功能的影响及机制.方法 收集42例ESCC患者的肿瘤组织和癌旁组织,采用RT-qPCR法分别检测ESCC肿瘤组织、癌旁组织及ESCC细胞系和正常食管上皮细胞(Het-1A细胞)中LINC01612相对表达水平.将KYSE30细胞分为对照组(不进行转染)、shRNA-NC组(转染shRNA-NC)、sh-LINC01612 组(转染 LINC01612 shRNA)、Vector 组(转染 Vector)、ALKBH5 组(转染 ALKBH5 过表达载体)、IGF2BP1 组(转染IGF2BP1 过表达载体)和ALKBH5+LINC01612组(共转染ALKBH5和LINC01612过表达载体).甲基化RNA免疫沉淀(MeRIP)分析评估LINC01612的m6A修饰水平;RIP分析评估m6A修饰的LINC01612与ALKBH5或IGF2BP1的结合;放线菌素D实验检测LINC01612的稳定性;CCK-8和Transwell实验检测细胞的增殖和侵袭能力,流式细胞术分析细胞凋亡率.结果 与癌旁组织相比,LINC01612在ESCC组织中表达显著上调(P＜0.01).此外,ESCC细胞LINC01612表达水平较人正常食管上皮细胞Het-1A显著上调(P＜0.01).沉默LINC01612显著抑制KYSE30细胞增殖和侵袭,诱导细胞凋亡和Caspase-3活性升高(P＜0.05).ALKBH5通过与LINC01612结合去除LINC01612的m6A修饰,从而下调LINC01612的表达.过表达ALKBH5抑制细胞增殖和侵袭,诱导细胞凋亡,而过表达LINC01612抵消了 ALKBH5过表达对KYSE30细胞的影响(P＜0.05).RIP分析结果显示,IGF2BP1通过识别m6A修饰的LINC01612并与其结合,增强LINC01612稳定性,促进其表达.结论 LINC01612在ESCC中的表达显著上调.ALKBH5-m6A-IGF2BP1以m6A依赖性介导LINC01612上调,促进ESCC细胞增殖和侵袭,抑制细胞凋亡.

目的:基于TGF-β1-Smads信号通路探讨活血利水复方治疗自发性高血压的潜在机制,为阐明活血利水复方治疗自发性高血压药效提供基础理论和实验依据.方法:选取14周龄雄性自发性高血压大鼠,随机分为正常对照组、模型组、卡托普利组、活血利水复方低剂量组和活血利水复方高剂量组,每组20只.采用尾动脉无创血压仪监测大鼠血压;采用苏木精—伊红(HE)染色检测大鼠主动脉超微结构.免疫组化染色检测各组主动脉转化生长因子-β1(TGF-β1)、结缔组织生长因子(CTGF)、金属蛋白酶组织抑制剂1(TIMP1)、Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白表达情况.免疫共沉淀检测各组Smad2-Smad3复合物、Smad2-Smad3-Smad4复合物的表达情况.酶联免疫吸附法(ELⅠSA)检测大鼠血清TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad4、Smad7、CTGF的表达情况.结果:与正常对照组比较,模型组血压增高(P＜0.01);与模型组比较,卡托普利组从治疗后第2周开始到第4周血压降低(P＜0.01),活血利水复方低剂量组从治疗后第3周至第4周血压降低(P＜0.05,P＜0.01),活血利水复方高剂量从治疗后第1周至第4周血压显著下降(P＜0.01).经活血利水复方干预后缓解了自发性高血压大鼠的病理改变,改善了高血压血管重构.模型组TGF-β1、CTGF、TIMP1、Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白表达显著升高,卡托普利组、活血利水方高剂量组、活血利水方低剂量组的TGF-β1、CTGF、TIMP1、Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白表达降低,尤其卡托普利组和活血利水方高剂量组降低尤为显著.卡托普利组、活血利水复方高剂量组、活血利水复方低剂量组相对于模型组Smad2-Smad3、Smad2、Smad3、Smad4表达减少,尤其卡托普利组、活血利水复方高剂量组相对于模型组Smad2-Smad3、Smad2、Smad3、Smad4表达显著减少.与模型组对比,活血利水复方低剂量组TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad4表达显著下降(P＜0.05),Smad7、CTGF表达差异无统计学意义(P＞0.05).与模型组对比,卡托普利组TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad4、CTGF表达显著下降(P＜0.05或P＜0.01),Smad7表达显著升高(P＜0.05);活血利水复方高剂量组TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad4、CTGF均有不同程度的降低(P＜0.05或P＜0.01),Smad7表达升高(P＜0.05).结论:活血利水复方可以通过TGF-β1-Smads信号通路干预有效治疗自发性高血压,为自发性高血压后期的临床治疗及相关研究提供了理论依据.

目的 探讨牙龈卟啉单胞菌(Pg)的毒力因子RgpB在食管鳞癌化疗耐药中的作用机制.方法 采用免疫沉淀-质谱联用技术筛选与Pg的毒力因子RgpB互作的自噬调节因子;运用免疫共沉淀实验探索RgpB和自噬调节因子TBC1D5之间的相互作用;采用蛋白免疫印迹法测定Pg感染对食管癌细胞膜受体分子Cx43表达的影响;使用细胞免疫荧光检测Lamp1、Cx43与TBC1D5的关系;利用自噬双荧光观察Pg感染对自噬小体与溶酶体融合的影响;使用平板克隆及CCK-8法检测Pg感染及Cx43抑制剂在使用化疗药后对食管癌细胞系增殖作用的影响.结果 免疫沉淀-质谱联用技术筛选出与RgpB互作的自噬调节因子TBC1D5;免疫共沉淀结果显示,Pg分泌的毒力因子 RgpB可与自噬调节因子TBC1D5直接结合并相互作用;蛋白免疫印迹法结果显示,感染Pg后食管癌细胞膜Cx43表达量高于未感染组(P<0.05);细胞免疫荧光结果显示,在感染Pg后,Cx43在细胞膜表面的表达量增加(P<0.05);stubRFP-sensGFP-LC3自噬双荧光结果显示,在Pg感染时,自噬体与溶酶体融合受到阻断;平板克隆及CCK-8法结果显示,使用化疗药后,Cx43抑制剂能够逆转Pg感染对食管癌细胞系的促进作用.结论 Pg入侵食管癌,其毒力因子RgpB阻碍自噬小体与溶酶体融合,从而使膜受体分子Cx43免受溶酶体降解,导致食管癌化疗耐药.

目的:本研究探讨布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)对阿尔茨海默样病变及NIMA相关激酶7(NEK7)-核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)信号通路的调控作用.方法:选取2、4、6月龄的5xFAD阿尔茨海默病(AD)模型小鼠和野生型(WT)小鼠,采用Western blot检测脑内BTK、NEK7及NLRP3等蛋白水平,免疫荧光染色法检测BTK、NEK7及NLRP3等蛋白的表达,免疫沉淀法检测NEK7和NLRP3的相互作用;选取3月龄5xFAD小鼠,随机分为BTK抑制剂依鲁替尼处理组和溶剂对照组,腹腔注射依鲁替尼(10 mg/kg)或溶剂连续14 d,随后进行Morris水迷宫和Y迷宫行为学实验分析各组小鼠学习与记忆能力;采用β-淀粉样蛋白42(Aβ42)侧脑室注射法构建AD模型,注射14 d后进行Morris水迷宫实验,Western blot检测脑内BTK蛋白水平;在BV2细胞中分别使用依鲁替尼预处理脂多糖(LPS)诱导的神经炎症模型或者Aβ42刺激的AD细胞模型,Western blot检测细胞NEK7、NLRP3、BTK以及p-BTK(Y223)蛋白水平的变化,免疫荧光染色法检测炎症小体,包括ASC、caspase-1、NEK7及NLRP3等蛋白的表达.结果:与WT组小鼠相比,5xFAD小鼠脑内炎症小体通路相关蛋白表达增加,NEK7蛋白表达增加,NEK7与NLRP3之间存在相互作用,AD模型小鼠脑内BTK蛋白围绕4G8斑块表达,表达量增加,且与Iba1存在共定位现象;与AD模型组小鼠相比,BTK抑制剂依鲁替尼处理组小鼠学习记忆功能有所改善;细胞实验结果显示,依鲁替尼预处理有效的抑制了Aβ42刺激后BV2细胞NLRP3炎症小体通路相关蛋白以及NEK7的表达.结论:BTK能够通过NEK7-NLRP3相互作用介导神经炎症,抑制BTK可减轻神经炎症、从而改善阿尔茨海默样病变小鼠的学习记忆功能.

目的:探讨高氧环境对氧诱导视网膜病变(OIR)模型小鼠肾脏代谢物的影响，了解病理性视网膜血管新生和肾损伤之间的潜在机制。方法:采用随机数字表法将16只健康SPF级C57/B6J新生小鼠随机分为OIR组与正常对照组，每组8只。小鼠自出生后标准饲养至第7天(P7)，OIR组小鼠和母鼠置于(75±2)%的高氧箱中饲养至P12，然后正常饲养；正常对照组一直在正常环境下饲养。各组小鼠在饲养P17时采用二氧化碳安乐死，取视网膜组织铺片并行血管异凝集素(IB4)染色，观察视网膜血管形态、中央无灌注区及病理性新生血管情况；另取小鼠肾组织进行液相色谱－质谱分析，取其对应小鼠的全血进行抗凝处理，通过离心沉淀，获得不含细胞成分的血浆，对血浆进行靶向代谢组学分析。使用代谢组学数据处理软件Progenesis QI v2.3对质谱信息进行解析，用无监督的主成分分析及正交偏最小二乘法分析(OPLS-DA)来区分各组间代谢轮廓的总体差异，比较2个组间代谢物的倍数变化。以变量权重值>1且 P<0.05为条件筛选出差异代谢物。基于KEGG数据库对差异代谢物进行代谢通路富集分析。 结果:视网膜铺片IB4染色结果显示，P17时正常对照组小鼠视网膜血管分布均匀；OIR组小鼠视网膜周边血管迂曲、紊乱，中央可见大面积无灌注区域形成，在视网膜无灌注区和血管区交界处形成大量新生血管簇，呈强荧光染色。OIR组小鼠视网膜无灌注区相对面积为(25.16±3.50)%，明显大于正常对照组的(0.63±0.30)%，差异有统计学意义( t＝12.07， P<0.001)。OPLS-DA模型参数R2X cum、解释率R2Y cum、和预测率Q2 cum分别为0.578、0.978和0.857，表明OPLS-DA模型具有较好的预测能力。共筛选鉴定到26个主要的差异代谢物，其中上调表达17个，下调表达9个，包括甘油磷脂类化合物[PC 20∶4(5Z，8Z，11Z，14Z)/0∶0、PC 22∶6(4Z，7Z，10Z，13Z，16Z，19Z)/0∶0、PC 14∶1(9Z)/20∶2(11Z，14Z)、PE P-18∶0/20∶4(6E，8Z，11Z，14Z)(5OH[S])]、氨基酸类代谢物(精氨酸、鸟氨酸、哌可酸和羟基赖氨酸)、嘌呤类(鸟嘌呤、次黄嘌呤、羟嘌醇)和脂肪酸类(15-棕榈酸甲酯、2，6，8，12-Tetramethyl-2，4-tridecadien-1-ol)等。差异代谢物主要富集于ABC转运蛋白(L-精氨酸、牛磺酸、肌醇、腺苷、N-乙酰基-D-氨基葡萄糖、L-谷氨酰胺)、氨酰-tRNA生物合成(L-异亮氨酸、L-脯氨酸、L-精氨酸、L-组氨酸、L-谷氨酰胺)、精氨酸生物合成(L-精氨酸、L-鸟氨酸、L-谷氨酰胺)等代谢通路。血浆的靶向代谢组学结果显示，差异的氨基酸类代谢产物主要富集于氨酰-tRNA生物合成、精氨酸生物合成代谢以及ABC转运蛋白等代谢通路。 结论:OIR小鼠的ABC转运蛋白、氨酰-tRNA生物合成、精氨酸生物合成代谢通路可能参与了肾损伤及早产儿视网膜病变新生血管形成的病理变化过程。

目的:研究突变型RAB39B基因的表达水平及RAB39B对细胞自噬水平和α-突触核蛋白的影响，并初步探索RAB39B基因c.536dupA突变在帕金森病发病机制中的作用。方法:基于前期发现由RAB39B基因新的突变c.536dupA导致青少年型帕金森综合征家系的工作背景，构建含有RAB39B基因c.536dupA突变型的重组表达质粒（pcDNA3.1-HA-RAB39B-536），与RAB39B野生型重组表达质粒（pcDNA3.1-HA-RAB39B），利用脂质体法将重组表达质粒转染至N2a细胞培养作为实验组。对照组为接受pcDNA3.1-HA转染的N2a细胞。利用实时荧光定量聚合酶链反应、蛋白质印迹、免疫荧光及免疫共沉淀等技术来明确突变型RAB39B的表达水平及RAB39B对自噬功能和α-突触核蛋白的影响。结果:在N2a细胞模型中，突变型RAB39B的转录水平约为野生型RAB39B的2倍，而突变型RAB39B的蛋白水平（0.30±0.00）明显低于野生型（1.50±0.25， t=8.313， P<0.05），加入蛋白酶体抑制剂MG132后突变型RAB39B蛋白水平有所升高（0.70±0.10， t=6.925， P<0.05）；RAB39B基因突变组的微管相关蛋白1轻链3BⅡ/Ⅰ值（3.11±0.30）显著低于野生组（7.03±0.20， t=18.831， P<0.05）；过表达野生型和突变型的RAB39B不影响内源性α-突触核蛋白水平，而过表达野生型的RAB39B会导致外源性的野生型和突变型（p.A53T）α-突触核蛋白水平升高[野生型：由0.60±0.11上升至1.25±0.08， t=8.254， P<0.05；突变型：由0.55±0.08上升至1.15±0.08， t=9.293， P<0.05]。 结论:RAB39B基因c.536dupA突变型蛋白稳定性下降，突变型蛋白可能通过泛素-蛋白酶体通路降解，且该突变可能影响细胞的自噬水平；RAB39B蛋白可能与α-突触核蛋白存在体内相互作用关系，可能参与α-突触核蛋白的稳态水平的维持。

目的:探讨胰岛素游离率在胰岛素自身免疫综合征（IAS）诊断和治疗中的价值。方法:检索美国国立医学图书馆数据库（PubMed）、荷兰医学文摘数据库（Embase）和中国生物医学文献数据库（CBM）自建库至2023年1月1日中明确诊断为IAS、使用聚乙二醇（PEG）沉淀法测定患者治疗前后游离胰岛素（FI）及总胰岛素（TI）值的文献。对纳入文献的基本信息进行摘录和整理分析，计算FI与TI之比胰岛素游离率（IFR）。结果:共纳入8篇文献，共7例IAS患者纳入研究。其中，2例IAS患者存在高血糖（包括1例极度胰岛素抵抗），5例仅表现为低血糖。7例患者均采用PEG沉淀法在治疗前后测定FI及TI。尽管各患者间FI及TI差异较大，但持续高血糖及严重胰岛素抵抗的IAS患者IFR较低。患者的治疗选择包括血浆置换、激素、免疫抑制剂及抗CD20单抗。TI下降、IFR升高是治疗起效的重要指标。结论:在IAS的诊断和治疗中应使用PEG沉淀法测定FI和TI，并进一步计算IFR。IFR是IAS诊治中的重要指标。

目的:分析序列相似家族3成员C(FAM3C)在胰腺癌中的表达以及对胰腺癌细胞增殖、迁移、侵袭等影响和相关机制。方法:收集2022年7月至2023年6月在江南大学附属医院手术切除的4例胰腺癌患者的癌组织和癌旁组织。聚合酶链反应和Western印迹检测组织和胰腺癌细胞PANC-1、MIA PaCa-2中FAM3C的表达。选取PANC-1、MIA PaCa-2细胞(FAM3C高表达)设置FAM3C-siRNA干扰组和甲基转移酶样蛋白3(METTL3)-siRNA干扰组，予以相应干扰小RNA处理，同时设置阴性对照组。细胞计数检测增殖能力，Transwell检测细胞迁移及侵袭。免疫共沉淀甲基化抗体检测FAM3C是否发生甲基化以及METTL3是否介导此甲基化。结果:4例胰腺癌患者癌组织中FAM3C的mRNA相对表达为(1.29±0.19)，高于癌旁组织(0.47±0.17)，差异有统计学意义( t＝－6.48， P＝0.001)。与阴性对照A组相比，FAM3C-siRNA干扰组增殖能力下降，迁移和侵袭细胞数减少，差异均有统计学意义(均 P<0.05)。在PANC-1细胞阴性对照B组中，IgG处理的细胞FAM3C mRNA相对表达为(1.05±0.53)，低于甲基化抗体处理组的(30.57±1.09)，差异有统计学意义( t＝－42.04， P＝0.001)。PANC-1细胞经甲基化抗体处理后，阴性对照B组FAM3C mRNA相对表达高于METTL3-siRNA干扰组(30.57±1.09)比(18.17±0.50)，差异有统计学意义( t＝17.89， P＝0.001)。与阴性对照B组相比，METTL3-siRNA干扰组PANC-1细胞增殖能力、迁移和侵袭细胞数降低，差异均有统计学意义(均 P<0.05)。MIA PaCa-2与PANC-1细胞检测结果一致。 结论:FAM3C在胰腺癌中高表达，且促进胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭，METTL3通过甲基化修饰FAM3C影响其表达，进一步影响胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭。