目的 探讨磷酸二酷酶8(phosphodiesterase 8,PDE8)抑制剂PF-04957325对冈田酸(okadaic acid,OA)诱导阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)小鼠学习记忆、焦虑、抑郁的影响,并对其机制进行初步探讨.方法 选取21只2月龄雄性C57BL/6J小鼠进行实验,随机分为对照组、AD模型组、PDE8抑制剂组(0.1 mg·kg-1).模型组和PDE8抑制剂组小鼠双侧海马定位注射OA(每侧50 ng)诱导AD模型,注射OA2 d后,PDE8抑制剂组给予0.1 mg·kg-1抑制剂,AD模型组和对照组给予等剂量溶剂,共给药21 d.给予抑制剂d 13,对小鼠学习记忆能力及焦虑抑郁行为进行相关行为学检测,HE染色观察小鼠海马DG、CA1、CA3区神经细胞形态,Western blot检测小鼠海马内不同位点磷酸化Tau蛋白水平以及PDE8/cAMP/CREB通路相关蛋白的表达.结果 与对照组相比,AD模型组Y迷宫轮替比、新物体识别指数、被动回避逃避潜伏期明显缩短(P＜0.01),水迷宫穿越平台次数及在目标象限停留的时间减少(P＜0.05),表现出学习记忆能力的下降,而给予PF-04957325可明显改善AD小鼠学习记忆能力;AD模型组进入旷场中央区次数及在中央区停留时间明显减少(P＜0.05)、悬尾不动时间明显增加(P＜0.01),提示小鼠有焦虑抑郁情况,给予PF-04957325 后小鼠焦虑行为没有得到改善,对抑郁行为有一定改善;AD模型组小鼠海马DG、CA1、CA3区表现出核仁固缩、神经元排列不整齐,给予PF-04957325可缓解小鼠海马神经细胞的损伤.与对照组相比,AD模型组小鼠海马中Tau蛋白Ser199、Ser396和Ser202位点的磷酸化水平明显升高(P＜0.01)、PDE8A及PDE8B蛋白表达量明显增加(P＜0.01)、p-PKA/PKA和BDNF蛋白表达量降低(P＜0.05),给予PF-04957325后Tau蛋白Ser396和Ser202位点的磷酸化水平明显降低(P＜0.01)、PDE8A和PDE8B蛋白表达量明显降低(P＜0.01)、p-PKA/PKA、p-CREB/CREB 和 BDNF蛋白表达量明显升高(P＜0.01).结论 PDE8抑制剂PF-04957325 能够提高AD小鼠的学习记忆能力、降低认知功能障碍,恢复Tau蛋白功能,减轻AD小鼠海马内神经元细胞的损害,具有改善AD的作用.作用机制可能与激活PDE8/cAMP/CREB通路、抑制Tau蛋白磷酸化有关.

目的 探讨细胞程序性死亡因子10(programmed cell death 10,PDCD10)介导胶质瘤细胞迁移的分子机制.方法 siRNA构建siPDCD10胶质瘤细胞系(U251),同时采用蛋白磷酸化酶 2A(protein phosphatase 2A,PP2A)抑制剂冈田酸(Okadaic acid,OA)处理细胞,研究下调 PDCD10对胶质瘤细胞行为的影响;蛋白质印迹法(western blot,WB)分别检测对照组和PDCD10低表达组胶质瘤细胞PDCD10、PP2A,PP2Ac-307,p38和pP38的表达,研究PDCD10调控PP2A/p38信号的分子机制.结果 下调胶质瘤细胞PDCD10促进肿瘤细胞的迁移(P＜0.05),而这一效应可被PP2A抑制剂OA抑制(P＜0.01).进一步研究显示,siPDCD10通过降低PP2A的磷酸化水平,进而升高p38的活性,促进胶质瘤细胞的迁移(P＜0.01).结论 PDCD10可能通过调控PP2A/p38信号介导胶质瘤细胞的迁移.

目的:探讨二苯乙烯苷(TSG)经PI3K/AKT通路对冈田酸诱导的人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)凋亡的影响及调控机制.方法:CCK-8法筛选OA最佳浓度,将SH-SY5Y细胞分为对照组、模型组、TSG组、LY294002组和LY294002+TSG组.通过CCK-8法和TUNEL法检测各组细胞增殖和凋亡情况;Western blotting法和qRT-PCR法检测PI3K、P-PI3K(Y607)、AKT、P-AKT(Ser473)、Bcl-2、Bax蛋白及mRNA表达情况,通路及凋亡蛋白相对表达量以P-PI3K(Y607)/PI3K、P-AKT(Ser473)/AKT、Bcl-2/Bax灰度比值表示.结果:OA最佳处理浓度为40 nmol/L.与对照组相比,模型组细胞活力降低,细胞凋亡率升高,通路及凋亡蛋白、PI3K、AKT、Bcl-2 mRNA表达水平降低,Bax mRNA表达水平升高(均P<0.05);与模型组相比,TSG组细胞活力升高,细胞凋亡率降低,通路及凋亡蛋白、PI3K、AKT、Bcl-2 mRNA相对表达水平升高,Bax mRNA表达水平降低(均P<0.05),LY294002组细胞活力降低,细胞凋亡率升高,P-PI3K(Y607)/PI3K蛋白表达水平显著降低(P<0.05)、P-AKT(Ser473)/AKT、Bcl-2/Bax蛋白表达水平较明显降低,但未有统计学意义,PI3K、AKT、Bcl-2 mRNA表达水平降低,Bax mRNA表达水平升高(均P<0.05);与LY294002组相比,LY294002+TSG组细胞活力升高,细胞凋亡率降低,通路及凋亡蛋白相对表达水平、PI3K、AKT、Bcl-2 mRNA升高,Bax mRNA表达水平降低(均P<0.05).结论:二苯乙烯苷可能通过干预PI3K/AKT信号通路,进而调节Bcl-2、Bax等凋亡因子的表达,从而缓解冈田酸诱导的SH-SY5Y细胞凋亡.

目的 观察甲状腺激素受体在阿尔茨海默病(AD)PC12 细胞模型中异常表达.方法 将PC12 细胞扩增,通过MTT法选择浓度为 0、30、40 nmol/L的冈田酸(OA)分别加入培养液中处理 24 h后更换培养液;收集经前述方法处理后的细胞,以Western印迹和免疫荧光检测Aβ表达情况;Western印迹检测tau蛋白磷酸化情况;Western印迹和PCR方法检测经不同浓度OA处理后的PC12 细胞的甲状腺激素受体(THR)α,β及其基因表达情况.结果 与 0 nmol/L OA组相比,30、40 nmol/L 组Aβ蛋白表达明显升高(P<0.001)且 40 nmol/L组表达明显高于 30 nmol/L组(P=0.006),免疫荧光结果显示,30、40 nmol/L OA处理组Aβ蛋白表达明显高于0 nmol/L;30、40 nmol/L OA处理组蛋白磷酸酯酶(PP)2A表达明显下调,磷酸化的tau蛋白(P-tau)表达明显增加,酪氨酸 307 磷酸化的PP2A(PP2Ac-yp307)表达显著升高(P<0.001);40 nmol/L OA处理组细胞THRα、THRβ 蛋白及基因表达均明显升高(P<0.001),30 nmol/L OA处理组仅THRα蛋白,THRβ 蛋白及基因表达明显升高(P<0.001),而THRα基因表达无显著异常(P=0.098).结论 PC12 细胞AD模型中PC12 神经细胞表达THR 蛋白(α、β)及THRβ基因异常升高可能是细胞的一种修复反应,AD的发生诱发了PC12 细胞THR蛋白及基因的高表达.

目的:探讨富硒蛹虫草子实体多肽(SECM)对人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y和脑缺血/再灌注(I/R)损伤大鼠的保护作用机制.方法:以SECM含药血清为样品,通过噻唑蓝(MTT)法检测含药血清对SH-SY5Y细胞在半数抑制浓度(IC50)冈田酸和过氧化氢作用下对细胞增殖的影响,以观察SECM对SH-SY5Y细胞的保护修复作用;使用改进的推注线技术制备大鼠I/R损伤模型,24 h后进行神经功能评分,检测各组大鼠脑组织丙二醛(MDA)含量,超氧化物歧化酶(SOD)活性,谷胱甘肽-过氧化物酶(GSH-Px)活性,核转录因子(NF)-κB、血管内皮生长因子(VEGF)、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)和纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)表达水平.结果:过氧化氢和冈田酸对SH-SY5Y细胞的IC50 分别为 420、35 nmol·L-1,而SECM在IC50 过氧化氢和冈田酸作用下对SH-SY5Y细胞具有很好的保护和修复作用;与假手术组比较,模型组大鼠神经功能损伤严重,脑组织中MDA含量和NF-κB、VEGF、PAI-1、ICAM-1 表达水平均升高,GSH-Px及SOD活性均下降.与模型组比较,SECM高、中剂量组大鼠神经功能评分有所改善;SECM高、中、低剂量组大鼠脑组织中GSH-Px和SOD活性均上升,MDA含量和NF-κB、VEGF、PAI-1、ICAM-1 表达水平均降低.结论:SECM对预先暴露于损伤因子过氧化氢及冈田酸的SH-SY5Y细胞均具有很好的保护和修复作用,同时对I/R损伤大鼠具有脑保护作用.

目的 通过网络药理学筛选相关靶点,探讨钩藤碱(RHY)改善阿尔茨海默病(AD)斑马鱼学习能力的机制.方法 在相关数据库中寻找RHY和AD的靶点,使用Venny2.1.0得到两者的交集靶点,DAVID数据库对10个枢纽基因进行GO和KEGG富集分析,AutoDock Tools软件和PyMol软件进行分子对接.通过分析AlCl3诱导的AD斑马鱼的行为轨迹并检测脑组织相关蛋白进行验证.通过检测冈田酸(OA)诱导的SH-SY5Y细胞内相关蛋白深入探讨机制.结果 得到RHY和AD的交集靶点238个,RHY与MAPK1具有良好的结合,作用AD的潜在通路有MAPK信号通路等.结果显示RHY可以下调AD斑马鱼脑内p-p38水平,提高OA诱导SH-SY5Y细胞的存活率,增加N-Cadherin表达,下调Aβ、JLP、p-JNK、p-p38、p-tau的表达.结论 RHY可能通过N-Cadherin/JNK/p38MAPK通路进而改善AD斑马鱼的学习能力.

目的 探讨蛋白磷酸酶2A抑制剂-2(protein phosphatase 2A inhibitor-2,I2PP2A)调控PP2A/Akt信号通路对人神经母细胞瘤细胞增殖和凋亡的影响.方法 体外培养人神经母细胞瘤 SH-SY5Y细胞转染 I2PP2A-shRNA 干扰质粒及对照质粒后分为 siI2PP2A组及 siC组.CCK-8、细胞克隆形成实验、细胞周期实验用于检测细胞增殖活性;流式细胞术检测细胞凋亡;Western blot法检测细胞内相关蛋白相对表达量;磷酸酶检测系统试剂盒测定PP2A活性;给予PP2A抑制剂冈田酸(okadaic acid,OA)处理细胞并检测增殖活性及 PP2A/Akt信号通路变化.结果 与 siC 组比较,siI2PP2A 组 48h 及 72h 的吸光度(A)值下降(P＜0.01),细胞克隆形成数目显著降低(P＜0.01);siC 组 G0/G1 期、S 期、G2/M 期、细胞凋亡比例分别为 43.29%±3.68%、31.76%±2.42%、24.96%±2.34%、1.89%±1.09%,siI2PP2A 组为 57.00%±3.90%、25.88%±2.06%、17.13%±2.07%、15.18%±5.60%,与 siC组比较,siI2PP2A组 G0/G1 期细胞比例和凋亡细胞比例升高,S期和 G2/M 期细胞比例下降(P＜0.05).同时,siI2PP2A组较 siC 组 PP2A 活性显著增加(P＜0.05),CyclinD1、Bcl-2、p-Akt 蛋白相对表达量降低(P＜0.05),Bax、cleaved-PARP蛋白相对表达水平升高(P＜0.01).进一步给予 PP2A 抑制剂 OA 后,可部分恢复 siI2PP2A 组 CyclinD1、Bcl-2、p-Akt、Bax、cleaved-PARP蛋白水平(P＜0.05)并逆转下调 I2PP2A导致的增殖抑制(P＜0.05).结论 下调 I2PP2A 介导的神经母细胞瘤细胞增殖抑制和凋亡增加可能与 PP2A/Akt信号通路密切相关.

目的 探讨蛋白磷酸酶 4(PP4)和蛋白磷酸酶 2A(PP2A)在棕榈酸(PA)诱导的内皮功能障碍中的作用及机制.方法 采用PA处理人脐静脉内皮细胞(HUVECs)体外建立脂毒性细胞模型,用PP2A亚家族抑制剂福司曲星(FST)或冈田酸(OA)预处理和特异性小干扰RNA(siRNA)技术沉默PP2Ac和PP4c基因,用慢病毒感染过表达PP4R2 基因转染HUVECs;蛋白免疫印迹分析(Western blot)检测eNOS总蛋白、eNOS Ser633 和eNOS Ser1177 磷酸化水平及PP4 各亚基、PP2Ac亚基蛋白表达水平,DAF-FM DA荧光探针检测细胞内一氧化氮(NO)含量,划痕实验以及小管形成实验检测内皮细胞迁移能力(迁移率)和小管形成能力(管长度),免疫共沉淀(Co-IP)法观察HUVECs内eNOS、PP4c、PP4 调节亚基PP4R2 及PP4R3α之间的相互作用.结果 与Control组相比,PA组eNOS Ser633 和eNOS Ser1177 磷酸化水平呈时间和浓度依赖性增加(P＜0.05),但eNOS总蛋白表达水平变化不明显(P＞0.05);与PA组相比,FST+PA组、OA+PA组eNOS Ser633 和Ser1177 的磷酸化水平增加(P＜0.05),细胞内NO含量增加(P＜0.05);与si-Control+PA组相比,si-PP2Ac+PA组eNOS Ser1177 的磷酸化水平增加(P＜0.05),si-PP4c+PA组eNOS Ser633 磷酸化水平增加(P＜0.05);与Control相比,PA组抑制PP4R2 蛋白表达(P＜0.05);与Vector+PA组相比,OE-PP4R2+PA组eNOS Ser633 磷酸化水平增加(P＜0.05),但eNOS Ser1177 磷酸化水平无明显变化(P＞0.05),同时细胞内NO产量增加,内皮细胞的迁移能力以及小管形成能力增强(P＜0.05);Co-IP 检测显示,eNOS 蛋白与 PP4c 蛋白、PP4R2 蛋白、PP4R3α蛋白存在共定位关系.结论 PA激活PP2A和PP4 分别诱导eNOS在Ser1177 和Ser633 去磷酸化,降低eNOS活性,导致内皮功能障碍,且PP4 可能以三聚体形式(PP4R2-PP4c-PP4R3α)存在,提示在血浆游离脂肪酸增多时,调节PP4R2 或PP4R3α活性可减轻细胞脂毒性,保护血管内皮细胞,改善内皮功能障碍.

目的 利用蛋白磷酸酶抑制剂冈田酸模拟AD病细胞损伤模型,探讨三七总皂苷的抗AD作用及其可能的作用机制.方法 三七总皂苷提取物与PC12细胞预孵育24h,利用终浓度为25 nmol/L OA处理PC12细胞,采用JC-1荧光检测法测定线粒体膜电位、Eura-2/AM荧光标记法测定胞内Ca2+浓度、Caspase-3酶活检测试剂盒检测,Caspase-3的活性,同时用Western blot检测Bcl-2、Bax、Caspase-3的表达情况.结果 三七总苷能提高AD细胞模型的线粒体膜电位,降低胞内Ca2+浓度;减少Bax和Caspase-3的表达,提高Bcl-2的表达.结论 三七总皂苷对OA引起的神经细胞凋亡具有一定的保护作用.

目的:探讨黄芩茎叶黄酮(SSF)对冈田酸(OA)引起的大鼠脑内双螺旋细丝(PHF)异常生成的抑制作用及其对蛋白磷酸酶(PP)的调节机制.方法:雄性SD大鼠,采用侧脑室注射OA(200 ng/kg)建立记忆障碍模型,Morris水迷宫进行记忆障碍模型筛选,取造模成功大鼠每日分别灌胃25、50和100 mg/kg SSF,连续36 d.Western blot法测定大鼠皮层与海马组织中PHF、PP1、PP2A-Cα、PP2A-Cβ、PP2CA和PP2CB的蛋白表达,以银杏叶黄酮作为阳性对照药.结果:与假手术组大鼠相比,模型组大鼠皮层与海马中PHF的蛋白表达明显增加(P<0.01),皮层与海马组织中PP2A-Cα和PP2A-Cβ及海马组织中PP2CB蛋白表达明显降低(P<0.05),皮层中PP2CA和PP2CB的蛋白表达明显增加(P<0.01),皮层中PP1的蛋白表达明显降低(P<0.01).与模型大鼠比较,灌胃25、50和100 mg/kg SSF 36 d不同程度地逆转了OA所致大鼠皮层与海马组织中PHF、PP2A-Cα和PP2A-Cβ及皮层中PP1的蛋白表达异常,对PP2CA和PP2CB蛋白表达无显著性影响,银杏叶黄酮也表现出与SSF相似的结果.结论:SSF能够明显抑制OA引起的大鼠脑内PHF异常生成,该作用可能与SSF调节大脑皮层和海马组织中PP1、PP2A-Cα和PP2A-Cβ的蛋白表达有关,而与调节PP2CA和PP2CB的关系较小.