紫苏(Perilla frutescens)含有丰富的生物活性物质和营养成分,是严格的短日照植物.目前,对紫苏的研究主要集中在产量和脂肪酸积累等农艺性状,而对紫苏开花进程及花器官形成的研究较少,其分子调控机制尚不明确.FLOWERING LOUC T(FT)是目前公认的感知光周期的关键基因,在花转变中发挥重要作用.PfFT3是FT-like亚家族基因,其在植物开花调控的功能尚待揭示.本研究首先通过亚细胞定位证明PfFT3定位于细胞核和细胞质.之后构建植物表达载体pCAM-BIAI1303-PfFT3,并通过农杆菌介导的花序浸染法转化野生型Col-0和突变体fd-2、fd-3和ft-10拟南芥,以此分别获得稳定遗传的纯合的过表达和回补转基因株系.结果分析表明,PfFT3的过表达能够显著促进拟南芥开花并且能够挽救突变体fd-2、fd-3和ft-10的晚花表型,进一步研究表明,外源PfFT3基因的表达促进下游内源开花基因AtSOC1、AtAP1、AtFUL和AtLFY的表达.综上所述,本研究阐明了 PfFT3在促进开花过程的积极作用,为深入研究PfPEBP基因的功能及紫苏短日照早花优良种质培育奠定基础.

猪苓菌核栽培中种苓质量不稳定是影响猪苓菌核品质和产量的关键问题,该文拟对根癌农杆菌介导的猪苓遗传转化体系进行研究,为通过分子育种从而获得优质种苓提供技术保障.采用根癌农杆菌介导法探究抗生素浓度、菌株类型、菌液浓度、受体材料、侵染时间、共培养时间和筛选条件对猪苓遗传转化效率的影响,利用潮霉素抗性标记基因、特异引物PCR以及荧光检测方法筛选并检测转化子.结果表明,根癌农杆菌GV3101菌株可对猪苓菌丝进行遗传转化,菌液浓度A600nm=0.6,受体材料猪苓菌丝,侵染30 min,共培养3 d为最佳侵染条件;9 μg·mL-1潮霉素初筛和13 μg·mL-1潮霉素复筛两步筛选法为最优筛选条件.经潮霉素抗性筛选、特异引物PCR检测和荧光检测分析,结果表明外源基因eGFP已转入猪苓菌丝内整合到基因组中并成功表达,在最优条件下,转化率可达到2.3％,遗传转化周期从大于90 d缩短到小于60 d.该研究建立并优化了根癌农杆菌介导的猪苓菌丝遗传转化体系,为解析猪苓生长发育的分子机制及分子育种奠定基础.

目的:对丝氨酸水解酶家族1（FSH1）蛋白在犬小孢子菌中进行亚细胞定位分析。方法:以前期构建的犬小孢子菌FSH1质粒及载体pCAMBIA-LRP-增强型绿色荧光蛋白（EGFP）为模板，PCR扩增FSH1基因及EGFP基因；同时利用SnaBI/KpnI对pCAMBIA-LRP-EGFP质粒双酶切获得载体DNA，将扩增的EGFP基因克隆至酶切好的载体DNA中获得EGFP表达载体；将扩增的FSH1基因及EGFP基因克隆至酶切好的载体DNA中获得融合载体Ptrcp-FSH1-EGFP-Ttrcp。通过根癌农杆菌介导的遗传转化方法，用重组质粒转化犬小孢子菌，使融合基因FSH1-EGFP在真菌通用启动子（Ptrpc）和终止子（Ttrpc）调控下在犬小孢子菌中整合型表达，利用激光共聚焦显微镜观察融合蛋白的细胞定位。结果:成功构建根癌农杆菌转化系统及犬小孢子菌EGFP表达载体；融合基因FSH1-EGFP在犬小孢子菌中获得整合型表达。激光共聚焦显微镜显示FSH1-EGFP融合蛋白的荧光信号呈颗粒状或团块状集中于犬小孢子菌的细胞质及细胞核中。结论:FSH1-EGFP融合蛋白成功定位于犬小孢子菌的细胞质及细胞核中，为进一步明确犬小孢子菌FSH1基因的功能及致病机制奠定了基础。

蒙古冰草(Agropyron mongolicum)亦称沙芦草,为禾本科(Poaceae)小麦族(Triticeae)冰草属(Agropyron)多年生疏丛型牧草,具有饲用价值高、抗寒耐旱以及耐盐、耐瘠薄、耐风沙等特性,是改良天然草场的适宜草种与挖掘优良耐逆基因资源的重要材料.然而,目前尚未建立蒙古冰草高效遗传转化体系,制约了该物种的基因资源鉴定与遗传改良应用.以蒙农1号蒙古冰草种子为来源的高再生效率的胚性愈伤系#89为外植体,建立了根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105介导的蒙古冰草稳定遗传转化体系,转化效率达30％.此外,针对多次继代后蒙古冰草愈伤系再生能力退化的难题,通过在再生培养基中添加1 mg·L-1 ABA或提高蔗糖浓度至45g·L-1,成功将再生能力衰退的蒙古冰草愈伤系再生效率由5％分别提高至35％与42％.研究结果为后续蒙古冰草基因编辑体系建立、基因功能鉴定和新品种培育奠定了重要技术基础.

为探究CRISPR/Cas9 基因编辑技术构建烟草突变体库的可行性,该研究以烤烟品种'红花大金元'为实验材料筛选了 100 个可能参与烟草香气代谢的基因,设计相应的 100 个 sgRNA 并构建了由 100 个CRISPR/Cas9 编辑载体组成的质粒库,获得转基因材料后分析了载体的共转化率、靶向编辑率和脱靶编辑情况.结果表明:(1)通过农杆菌介导 100 个sgRNA的共转化后,在 172 个阳性转化株中检测到了其中的77 个sgRNA,共转化率为 77%.(2)在 77 个携带sgRNA的转基因后代中,69 个sgRNA对目标基因进行了靶向编辑,编辑率为 89.6%.(3)脱靶位点测序检测发现,只有 1 个sgRNA在非目标靶位点产生了脱靶编辑,表明CRISPR/Cas9 基因编辑技术在烟草中的脱靶概率非常低.综上所述,利用CRISPR/Cas9 载体库共转化对烟草基因进行高通量靶向编辑以构建突变体库的方法切实可行,并且该方法有共转化率高、编辑率高和脱靶编辑概率低等特点.

该研究旨在通过耐盐能力、产吲哚乙酸(IAA)能力、溶磷能力、产铁载体能力等指标评价一株甘草内生尖孢镰刀菌的体内功能,通过根癌农杆菌介导的遗传转化技术建立该菌的稳定遗传转化体系,并通过标记基因绿色荧光蛋白(GFP)的克隆和β-葡萄糖苷酸酶(GUS)染色的效率检测转化子的稳定性与染色高效性,筛选出高效稳定的转化子用于回染甘草,评价其对甘草幼苗生长的影响.研究结果表明该菌耐盐性较好,在含 7%氯化钠的马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上仍能生长,但生长速度随着PDA培养基中氯化钠含量的增高而减缓;该菌具有产吲哚乙酸的功能,其发酵液中IAA的质量浓度约为 3.32 mg·mL-1.该研究成功构建了该菌的遗传转化体系,且其根癌农杆菌介导的遗传转化(ATMT)体系高效而稳定.筛选获得 1株兼具染色高效性和遗传稳定性的转化子,该转化子在甘草植株中的回染率为 76.92%,能够显著提高一月龄甘草幼苗的主根长,促进甘草幼苗根部的生长发育.该研究结果可以为生物菌肥的开发及优质甘草的生长调控奠定基础.

[目的]通过米曲霉中异源表达虫草素合成关键基因,构建米曲霉工程菌株合成虫草素.[方法]以米曲霉尿苷/尿嘧啶和组氨酸双营养缺陷型菌株AoΔpyrGΔHisB为背景菌株,利用农杆菌介导的转化方法对虫草素合成关键基因CmCns1-CmCns3 进行过表达;通过荧光显微镜观察CmCns1 和CmCns2 在米曲霉中的亚细胞定位;利用高效液相色谱法(HPLC)测定转基因米曲霉虫草素含量,同时对米曲霉发酵液添加合成虫草素的前体甘氨酸和腺嘌呤,探究其在米曲霉中对合成虫草素的影响.[结果]蛹虫草CmCns1 和CmCns2 在米曲霉中定位于脂滴;并且米曲霉中单独过表达CmCns1、共表达CmCns1 和CmCns2 以及共表达CmCns1-CmCns3 均能合成虫草素,发酵 48 h虫草素胞外产量最高达到 37.74 μg/mL;向米曲霉发酵液添加甘氨酸和腺嘌呤,不能有效提升虫草素的含量.[结论]成功在米曲霉异源表达合成虫草素.

基于CRISPR-dCas9的基因转录激活表达能够避免基因异位表达带来的表型干扰,同时使基因有效地特异性表达.该研究利用新型CRISPR-Act3.0表达系统,在毛果杨(Populus trichocarpa)中对维管形成层特异表达转录因子ANT(AINTEGUMENTA)进行基因转录激活,创制遗传材料,并对基因的功能进行分析.首先对毛果杨PtrANTs转录因子进行同源分析,选取其中的PtrANT-4进行后续研究,对该基因进行克隆并利用荧光定量PCR分析其在各组织中的表达情况;其次在PtrANT-4启动子上设计3条gRNAs,构建CRISPR-dCas9转录激活表达载体,利用原生质体瞬时转化法检测该载体的表达;最后将该表达载体利用农杆菌介导法转化毛果杨,获得PtrANT-4转录激活遗传材料.结果表明:毛果杨中有4个PtrANTs转录因子,选取的PtrANT-4基因CDS序列全长为2 058 bp,编码685个氨基酸,在毛果杨侧生分生组织维管形成层特异表达.基于CRISPR-Act3.0表达系统成功构建的转录激活载体,在毛果杨木质部原生质体中转化后具有激活PtrANT-4表达的作用.获得的遗传转化植株中PtrANT-4基因仅在茎维管形成层中的表达量显著提高,说明PtrANT-4在茎维管形成层发育过程中可能起重要作用.该研究为PtrANT的功能研究奠定了一定研究基础,同时为维管形成层干细胞发育的机制研究提供了重要的遗传材料.

'窄冠白杨1号'(Populus leucopyramidalis 1)是一种冠形窄、耐盐碱的优良白杨派无性系.由于缺乏其遗传转化体系,因此无法通过基因工程手段对其进行遗传改良.该研究以'窄冠白杨1号'为材料,建立了农杆菌介导的遗传转化体系,并获得了较高的遗传转化效率.首先将组培苗继代培养不同时间段(35、45、55、65 d),分别取其3种组织(叶片、叶柄、茎段)以对比分化能力的强弱,确定了继代45 d后的叶片具有最强的分化能力,其增殖倍数为8.77.随后,使用继代45 d后的叶片作为遗传转化的材料,研究不同侵染条件对转化率的影响,设立了菌液浓度、侵染时间和共培养时间各3个梯度的正交试验,对这3个因素进行最佳水平筛选,通过PCR检测和GUS染色鉴定转基因株系.结果表明'窄冠白杨1号'遗传转化体系的最佳组合为:菌液浓度OD600=0.4,侵染时间15 min,共培养时间2 d,在该组合下转化率最高可达54.23%.最后,利用该遗传转化体系获得了转Bt-Cry3Aa抗虫基因'窄冠白杨1号'株系,证明该体系可以做为'窄冠白杨1号'遗传改良的有效方法.

[目的]酒石酸不仅影响葡萄果实的味道,还决定葡萄酒的色泽、口感、微生物稳定性和陈酿潜力.探讨调控酒石酸生物合成的转录因子及其机制,通过生物技术调控葡萄内源酒石酸的积累或定向培育高酒石酸积累型优良酿酒葡萄品种具有重要价值.[方法]研究以酿酒葡萄'琼瑶浆'、'马瑟兰'为试验材料,用PCR方法从中克隆到与酒石酸含量相关的VvbHLH79转录因子,对其进行生物信息学和亚细胞定位分析;用HPLC和qRT-PCR技术测定葡萄果实在不同发育时期的酒石酸含量和VvbHLH79的表达量;并构建植物表达载体,用农杆菌介导的果梗侵染法瞬时转化葡萄幼果果实之后检测VvbHLH79的表达量和酒石酸含量.[结果](1)通过RNA-seq测序筛选获得1个葡萄VvbHLH79基因,该基因CDS序列全长831 bp,编码277个氨基酸,分子质量为66.22 kD,理论等电点为5.15,属于无信号肽和跨膜结构的不稳定亲水性蛋白;氨基酸序列第147-232位含有bHLH-SF保守结构域,属于bHLH转录因子家族;亚细胞定位在细胞核.(2)葡萄VvbHLH79编码蛋白与河岸葡萄中的bHLH89编码蛋白(登录号:XP_034699340.1)序列一致性最高,达到99.64％.(3)VvbHLH79相对表达量随着'琼瑶浆'果实发育降低,从坐果期到成熟期降低了67.25％;酒石酸积累主要在葡萄果实转色之前,转色之后酒石酸含量就快速下降.(4)VvbHLH79在低酒石酸葡萄果实中瞬时过表达后使酒石酸含量显著升高,而将VvbHLH79在高酒石酸葡萄果实中沉默后酒石酸含量显著下降,证实VvbHLH79基因正向调控酒石酸含量.[结论]VvbHLH79转录因子可能在葡萄酒石酸生物合成通路中发挥作用.