目的:制备新型冠状病毒野生株(WT)、Beta变异株、Delta变异株、Omicron变异株(BA.2、BA.5、BQ.1和XBB.1分支)等7株单克隆病毒株，用于申请国家标准株。方法:利用蚀斑纯化技术感染Vero细胞后筛选单克隆毒株，通过观察细胞病变特性与病毒形态学特征、病毒滴度与全基因组序列测定、支原体检测等方法，以评价单克隆毒株的基础生物学特征。结果:WT株、Beta变异株、Delta变异株、Omicron变异株(BA.2、BA.5、BQ.1和XBB.1)7株病毒感染细胞后，细胞病变表现为细胞圆缩脱落；蚀斑纯化后的病毒支原体检测均为阴性，2代至5代的病毒滴度在10 5～10 8 TCID 50/ml之间；电镜下病毒颗粒呈圆形或者椭圆形，直径在60～140 nm之间；全基因组测序与系统进化分析明确了7种毒株的变异株类别，证实了单克隆毒株连续传代5代基因组特征稳定。 结论:制备7种代表性新型冠状病毒变异株的克隆株，具有典型冠状病毒细胞病变效应、形态结构清晰、病毒活性良好、遗传稳定等特性，可作为候选毒株用于申请国家标准株。

目的:利用CRISPR/Cas9 (clustered, regularly interspaced, short palindromic repeat/CRISPR-associated nuclease 9)技术构建携带增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)基因的单纯疱疹病毒2型(herpes simplex virus 2，HSV-2)。方法:利用CRISPR/Cas9技术对外源基因EGFP插入HSV-2基因组的策略进行探索，设计如下4种插入策略：(1)经典的同源重组修复模式，即环状双侧同源臂供体介导的基因敲入；(2)线性化单侧同源臂供体介导的基因敲入；(3)同源性非依赖介导的基因敲入；(4)利用稳表达Cas9和sgRNA的细胞株，进行环状双侧同源臂供体介导的基因敲入。结果:使用策略2、3和4均成功构建了携带EGFP的HSV-2，其中策略2的基因敲入效率最高，然后依次为策略3、策略4，策略1未观察到重组病毒的产生。蚀斑纯化后的重组病毒在7代内能稳定表达绿色荧光蛋白，并且和亲本株在Vero细胞上具有相似的生长特性。结论:线性化单侧同源臂供体介导的基因敲入效率更高，敲除载体的稳转细胞株能够有效地提高同源重组修复机制介导的基因敲入效率。

目的:建立快速荧光灶试验(fluorescence focus assay，FFA)滴定乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)的方法，验证该法替代病毒蚀斑法测定乙型脑炎减毒活疫苗(简称乙脑减毒活疫苗)滴度的可行性并将该法作初步应用。方法:利用原核表达方式构建JEV非结构蛋白1(non-structural protein 1，NS1)重组体系，以纯化所得的JEV-NS1蛋白免疫家兔制备抗NS1蛋白多克隆抗体，建立快速FFA测定JEV滴度的方法。通过与病毒蚀斑法作比对分析，对其专属性、准确度、精密度、线性、范围和耐用性进行验证。用经验证后的FFA检测28批乙脑减毒活疫苗，分析其应用于生产的可行性。结果:所制备的多克隆抗体与JEV可产生特异性荧光灶反应，与其他病毒(森林脑炎病毒、黄热病毒、人柯萨奇病毒A2型和A4型)无交叉反应；FFA方法学验证结果均符合乙脑减毒活疫苗的质控要求；与蚀斑法比较，FFA检测结果更趋一致。结论:本研究建立的FFA通过方法学验证，可应用于乙脑减毒活疫苗成品的滴度测定。

[目的]禽痘病毒(FPV)是痘病毒科禽痘病毒属的成员.FPV因其基因组庞大,含有大量复制非必需区,目前作为活病毒载体在禽类和哺乳动物中广泛使用.重组位点的选择是禽痘病毒载体构建的先决条件,外源基因的插入不影响病毒复制是筛选插入位点的前提.因此,鉴定可供外源基因插入的复制非必需位点将为重组病毒的构建提供更多选择.本研究拟鉴定FPVNX10株胸苷激酶(TK)基因在病毒复制中的必要性.[方法]以TK基因作为靶基因,增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为筛选标记构建转移载体,FPV NX10株为亲本病毒,通过同源重组筛选重组病毒rFPV-△TK-EGFP.通过在CEF细胞培养物中添加5-溴脱氧尿苷(BUdR)验证TK基因在FPV复制中的作用.[结果]构建了转移栽体pUC 19-TK AB-EGFP.在转染后重组病毒克隆纯化过程中,蚀斑克隆中绿色荧光病变所占的比例逐渐增加,但在荧光蚀斑的边缘能观察到不带荧光病变的存在.对第9-15轮随机选取的蚀斑克隆的Western blot分析表明,重组病毒中插入的EGFP基因均能够正确表达,但PCR结果显示在重组病毒中始终存在野生型病毒.在细胞培养液中添加BUdR后,重组病毒不能继续生长.[结论]FPV NX10毒株TK基因在该病毒的复制中不是完全非必需的.

盖他病毒(Getah virus,GETV)是一种广泛分布于欧亚大陆及澳大利亚北部太平洋沿岸的人兽共患虫媒病毒,我国目前各地仅从蚊子中分离到该病毒.本研究在对一猪场疑似猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)流产胎儿进行多重RT-PCR检测时,由检测猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)的一对引物扩增出一非特异性条带,测序及在NCBI数据库中BLAST结果显示,该序列与GETV序列高度相似.经病毒分离、传代、蚀斑纯化,获得一株能够在Marc-145细胞上稳定生长的分离物.电镜观察显示,该病毒有囊膜及纤突,直径约70 nm,接近于球形,具有披膜病毒科甲病毒属成员的典型形态特征,将该分离物命名为HNJZ-S1株盖塔病毒(Getah virus).全基因序列分析结果显示,分离物HNJZ-S1基因组全长11 689 bp,与GenBank中现有14株GETV序列相似性为97.4％～99.3％,其与韩国猪源毒株AY702913(登录号AY702913)序列相似性最高(99.3％).遗传进化分析显示,HNJZ-S1与日本蚊源毒株12IH26、马源毒株14-I-605-C1、14-I-605-C2及中国蚊源毒株HB0234亲缘关系最近,处于同一进化分支.其E2基因推导的氨基酸序列分析结果显示,HNJZ-S1与韩国猪源毒株AY702913和QIAG9302以及日本马源毒株14-I-605-C1、14-I-605-C2和中国蚊源毒株HB0234等处于同一进化分支.本研究首次从我国发病猪群中检测并分离到GETV,也是迄今为止中国唯一一株来自脊椎动物的盖他病毒,对猪源GETV的感染谱和致病性、感染和传播机制、环境微生物学及公共卫生等相关研究具有重要意义,并为之提供了宝贵的研究素材.

目的 对检测到的疑似盖塔病毒进行分离鉴定和全基因序列遗传进化分析.方法 从四川某猪场1例混合感染猪繁殖与呼吸综合征的仔猪血液中,进行RT-RCR检测,检测到GETV阳性.对样品进行无菌处理后,接种至BHK21细胞,连续传代培养,通过细胞病变、蚀斑纯化、RT-RCR扩增和全基因序列测定鉴定细胞培养物.结果 我们成功分离到四川首株猪盖塔病毒,并将其命名为SC201807;对该病毒全基因扩增测序并进行序列分析,发现SC201807与GenBank中上传的35株GETV序列相似性为99.0％～96.1％,E2序列高度保守仅在E310(天冬氨酸→谷氨酸)发生突变.全基因组核苷酸以及E2氨基酸序列遗传进化分析显示SC201807株与中国猪源HNJZ-S2及日本蚊源15-I-752、15-I-1105、14-I-605-C2、14-I-605-C1、12IH26亲缘关系最近,处于同一进化分支.结论 SC201807株扩充了猪源GETV的感染谱,对其致病性、感染和传播机制、环境微生物学及公共卫生等相关研究提供素材.

把编码猴轮状病毒（Rhesus rotavirus，RRV） Vp4抗原的第4基因片段插入到痘苗病毒表达载体pJSA1175的P7.5启动子下游，构建成在痘苗病毒P7.5启动子调控下表达猴轮状病毒Vp4抗原基因的重组质粒pJSA1175-Vp4。应用磷酸钙沉淀技术将pJSA1175-Vp4 DNA转入TK-143细胞，在BUDR和X-gal存在下筛选蓝色蚀斑。经3代以上纯化和病毒增殖，获重组病毒R-VJSA1175-Vp4。蚀斑滴定其滴度达到1.5×l0 11PFU/L。经核酸杂交试验证明所获得的重组痘苗病毒带有猴轮状病毒Vp4抗原基因。用重组病毒感染TK-143细胞（或Vero细胞），在感染后48h，用酶免疫法（EIA）检测受染细胞上清液和细胞裂解液中表达的猴轮状病毒Vp4抗原基因均呈阳性反应。本试验为本研究室轮状病毒基因工程疫苗的一部分，为深入了解轮状病毒基因结构及其功能在方法学上奠定了必要的基础。

本文报导建立一次铺琼脂复盖物对重组痘苗病毒进行蚀斑测定及纯化的方法。采用此法比较了乙肝-痘苗天坛株、乙肝-痘苗wR株重组病毒与其未重组病毒蚀斑的大小，发现乙肝-痘苗天坛株重组病毒形成的蚀斑比其未重组病毒的蚀斑明显地小，乙肝-痘苗wR株重组病毒的蚀斑亦如此。

以5-3减毒株通过乳小白鼠皮下传代和蚀斑纯化二次获得一株毒力与5-3株基本上一致而免疫性较5-3株显著提高的另一减毒株14-2株。其主要生物学特性如下：

我们以前曾报道，表达单纯疱疹病毒Ⅱ型糖蛋白D（HSV-2gD）的重组痘苗病毒（实验疫苗株）能保护被免疫小鼠抵抗致死量HSV-2病毒的攻击。在此工作基础上，严格按人用疫苗研究要求的实验条件，成功地建立了表达HSV-2gD的重组痘苗病毒活疫苗株。首先将经聚合酶链反应（PCR）修饰的HSV-2gD基因插入痘苗表达质粒pJSB1175，置于痘苗病毒P7.5K早／晚期启动子控制下。将此重组质粒用Lipofectin方法转染已受野型TK +痘苗病毒天坛761株感染的人胚肺二倍体细胞。经同位素探针（ 32P-HSV-2gD）原位杂交法和3轮蚀斑纯化，筛选出基因组内整合有HSV-2gD基因的重组痘苗病毒。斑点和Southern杂交证实，HSV-2gD基因已插入痘苗病毒基因组内预期的TK区段，间接免疫荧光检测显示，重组病毒感染细胞后能有效地表达HSV-2gD蛋白。