构建YFV17D非感染性复制子及假病毒包装系统,旨在进一步解析黄热病毒的复制、组装分子机制.该研究利用反向遗传学技术,将基于SP6 启动子的单拷贝YFV17D报告复制子改造成由CMV启动子驱动的低拷贝YFV17D报告复制子,同时将表达YFV17D结构蛋白的包装质粒与复制子质粒共同转染BHK-21 细胞而建立YFV17D的反式假病毒包装系统.通过检测NanoLuc萤光素酶活性(Nluc)、oxGFP和mCherry荧光蛋白表达、间接免疫荧光实验监测病毒双链RNA来确定复制子在BHK-21细胞中复制情况和包装效果.结果表明,与复制缺陷型复制子相比,野生型复制子转染至BHK-21 细胞中,随着转染时间的增加,Nluc活性、oxGFP和mCherry荧光蛋白表达也随之增加,同时dsRNA也随时间延长而增多.将复制子质粒和包装质粒共同转染至BHK-21 细胞后,收集上清再次感染BHK-21 细胞,随后通过检测Nluc活性和oxGFP与mCherry蛋白的表达而确定假病毒包装成功.综上,成功构建了携带不同报告基因的YFV17D复制子,用于监控病毒基因组RNA的复制;成功搭建由包装质粒提供的结构蛋白,将不具备感染性的YFV17D亚基因复制子打包成具有单轮感染能力的YFV17D假病毒系统.

在氧化葡萄糖酸杆菌中建立一种调控基因表达的工具.通过顺式/反式作用的非编码小RNA与核糖体结合位点(RBS)的相互作用,在翻译水平上对氧化葡萄糖酸杆菌中目标基因的表达进行调控.以绿色荧光蛋白作为报告基因,在所构建的顺式调控系统中,插入RBS上游的顺式阻遏序列,能够在转录后与RBS形成茎环结构,从而抑制报告基因的表达.这一茎环结构能够被与顺式阻遏序列具有更高亲和力的抗阻遏序列打开,从而重启报告基因的翻译;在所构建的反式调控系统中,由独立启动子控制转录的非编码小RNA与RBS互补形成双链,通过阻碍核糖体与mRNA的结合抑制报告基因的表达.在此基础上,设计并导入了一系列反式作用的小RNA,实现了对氧化葡萄糖酸杆菌中内源基因pstⅠ表达的抑制.本研究提供了一种在氧化葡萄糖酸杆菌中不同于传统基因敲除的调控基因表达的方法.

十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv.campestris,Xcc)能够侵染几乎所有的十字花科植物引起黑腐病,而纤维素酶作为重要致病因子之一,在病原菌早期侵染中发挥重要作用.通过全基因组检索发现,已测序菌株Xcc 8004中有9个基因(XC_0026,XC_0027,XC_0028,XC_0625,XC_0639,XC_0783,XC_0784,XC-1727和XC_2483)注释为纤维素酶基因.本研究构建了9个纤维素酶基因的单基因缺失突变体和多基因缺失突变体.定性检测突变体纤维素酶活,发现D0639的CMC纤维素酶活力显著降低,其他8个单缺失突变体的CMC纤维素酶活力变化不明显,当9个基因同时缺失即D9,CMC纤维素酶活性完全丧失.在D9的背景进行单基因反式互补,通过定量和定性检测纤维素酶活力,XC 0639能基本上恢复野生型水平,XC_0026、XC_ 0783和XC 1727只能补回10％的酶活力,而其余几个基因完全不能补回酶活力.本研究首次发现了XC_0639是十字花科黑腐病菌的纤维素酶的主效基因.

为了观察互补于乙型肝炎病毒（HBV）X基因的三段硫代反义核酸（ASON）体外抗病毒作用，采用ELISA和PAP-ELISA法检测ASON作用前后2，2，15细胞上清中乙型肝炎病毒表面抗原、e抗原及X抗原（HBsAg、HBeAg、HBxAg）含量变化及细胞原位杂交检测细胞内HBVDNA含量变化。结果表明，三段ASON均可抑制HBsAg、HBeAg和HBxAg的表达，其抑制率分别为80.65％、62.76％和78.07％;细胞内HBVDNA也明显减少。据此认为，HBxAg表达量下降可能系ASON序列特异性封闭作用所致，而HBsAg和HBeAg表达量以及HBVDNA含量降低，可能是通过HBxAg对HBVDNA启动子的反式激活功能降低而实现的。

tao基因编码反式茴脑氧化酶,参与反式茴脑的降解过程.通过自杀质粒pK18mob及广宿主表达质粒pBBR1 MCS-5分别构建突变菌AT39/btao、重组菌AT39/tao-pBBR1 MCS5及互补菌HAT39/btao.对构建的菌株进行TAO酶比活力测定,结果发现重组菌AT39/tao-pBBR1 MCS5的酶比活力显著增加,比野生菌AT39提升了35.23％.茴香酸转化量检测结果显示,重组菌AT39/tao-pBBR1MCS5代谢生成的茴香酸产量为3.55 g/L,同比野生菌AT39增加了约4倍.结果为下一步利用和改造tao基因构建工程菌生产茴香酸奠定了基础.

1993年微小RNA(microRNA)被首次发现,并引起了极大的关注[1].microRNA是具有17~25个核苷酸的短小非编码 RNA,通常在转录后水平调节基因的表达.目前miRBase中包含了2 661个人类microRNA,它们均由有核细胞的基因组编码.转录生成的初级microRNA由RNA酶 ⅢDrosha剪切成具有60~70个核苷酸的microRNA前体,然后被运输至胞质,在反式激活区(TAR)RNA结合蛋白的辅助下,由 RNA 酶Ⅲ Dicer 剪切成成熟的 microRNA.成熟的microRNA与Ago蛋白结合后并入RNA诱导沉默复合体,识别靶基因3'-非翻译区的互补序列调节基因表达[2].microRNA参与正常细胞的多种生物学过程,包括细胞增殖分化、死亡、信号转导、应激和代谢[3].正因为microRNA发挥着如此多样和重要的调节功能,所以也被证实与许多疾病的发生发展有重要的联系,包括心血管、神经、代谢疾病和肿瘤[4-5].microRNA能促进肿瘤生长、侵袭、血管生成和免疫逃避[6].分析肿瘤的microRNA表达谱可以定义肿瘤的亚型、评价患者预后和监测治疗反应.

为构建一种重组乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)复制子模型,使其能够在病毒感染的细胞中表达可视化报告基因蛋白,本研究删除HBV基因组核心蛋白(HBV core,HBc)编码区部分序列,构建HBV1.1-ΔHBc113复制子载体.利用内含肽(intein)介导蛋白拼接的特性,选取加强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)和超级折叠绿色荧光蛋白(super folder green fluorescent protein,sfGFP)作为外显肽,建立EGFPN1-8/EGFPC9-11和sfGFPN1-10/sfGFPC11蛋白分裂系统.基于 ΔHBc113载体,分别构建EGFPC9-11和sfGFPC11重组HBV复制子;应用DNA印迹法(Southern blotting)验证两种rHBV载体的细胞内复制能力.结果显示,构建的HBV1.1-ΔHBc113复制子载体能够在HBc反式互补条件下在转染细胞中形成病毒复制.构建的EGFPC9-11和sfGFPC11重组HBV复制子能够支持HBc互补条件下的细胞内病毒复制,并产生子代病毒颗粒;HBV重组复制子表达的EGFPC9-11或sfGFPC11蛋白在共表达氮端蛋白EGFPN/sfGFPN细胞中,通过intein介导的蛋白质高效拼接,能够形成完整的、有功能的GFP.结果表明,构建的荧光蛋白重组HBV复制子系统能够为HBV高通量药物筛选和HBV易感性研究提供实验工具,具有重要的病毒学意义和应用前景.