目的:利用毕赤酵母高效表达新型冠状病毒刺突蛋白受体结合域(receptor binding domain，RBD)，并评估以该RBD蛋白作为抗原所制备的疫苗组合物的免疫原性。方法:选取RBD蛋白并合成对应基因片段，将其构建至pPICZαA质粒，质粒经线性化转化后整合到毕赤酵母基因组中进行重组表达。Western blot和基于BLI(Biolayer Interferometry)技术的定量分析方法对培养上清中RBD蛋白进行检测，筛选能够分泌表达RBD蛋白的单克隆菌株。通过优化发酵工艺，包括培养基的盐浓度调整和诱导条件优化(pH、温度和时间等参数)，实现RBD蛋白的高效表达，并在小鼠体内评估其免疫原性。结果:筛选获得重组RBD蛋白表达效果较好的RBD-X33单克隆菌株。通过优化后的发酵工艺，即采用HBSM培养基、诱导pH为6.5±0.3、诱导温度为22℃、诱导时间持续120 h，实现发酵收获上清中重组RBD的表达量达到240 mg/L。在小鼠免疫原性试验中，采用铝+CpG双佐剂系统吸附重组RBD蛋白的疫苗组合物能够激发小鼠产生2.7×10 6结合抗体滴度和726.8活病毒(野生型)中和抗体滴度。 结论:采用毕赤酵母表达系统能够高效表达重组RBD蛋白，且所表达的RBD蛋白能够有效激发动物产生免疫应答。本研究为基于RBD蛋白的重组新型冠状病毒疫苗的开发提供了参考。

帕利珠单抗(Synagis)是用于预防呼吸道合胞病毒的经典药物,但由于价格昂贵,限制了其应用范围.该研究采用中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)表达帕利珠单抗类似药,并以响应面设计法对培养关键参数进行优化,筛选培养基组合以提高产量.研究结果显示,优化工艺参数为以AM01-AF02为基础-补料培养基,每1 mL含5.0×106个细胞的密度接种,37℃培养7d后,降温至33.0 ℃,培养至d16.该工艺条件下,可将帕利珠单抗类似药的产量在摇瓶和3 L生物反应器中分别提升69.3％和30.0％.随后,对生物反应器上发酵生产的抗体进行了纯化工艺研究,为帕利珠单抗类似药的后续工艺开发提供了参考.

[背景]莱氏绿僵菌(Metarhizium rileyi)对新入侵我国的草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)具有较强的致病力和田间流行性,因此具备深入开发的价值.[目的]优化莱氏绿僵菌SZCY固态发酵培养条件,测定所产分生孢子对草地贪夜蛾幼虫的毒力,为提高该菌株分生孢子规模化生产奠定基础.[方法]采用单因素试验确定了相对适宜的固态培养基,利用Box-Behnken响应面法优化该菌株的固态培养基和发酵参数,同时评价不同条件下该菌所产分生孢子对草地贪夜蛾幼虫的毒力.[结果]去颖稻谷(rice)为莱氏绿僵菌SZCY菌株固相产孢最佳载体.培养温度、光周期及酵母浸粉含量是影响莱氏绿僵菌SZCY固态发酵产孢量的主要因素.莱氏绿僵菌 SZCY固态发酵最佳工艺参数为温度 22.83℃、光周期 18.68 h L:5.32 h D、酵母浸粉 4.98 g/100 g,在此条件下,莱氏绿僵菌在去颖稻谷固态培养基上的产孢量为 5.65×1010 孢子/g,用其制备浓度为 107 孢子/mL 的孢子悬浮液,对草地贪夜蛾 3 龄幼虫的LT50 为 3.88 d.[结论]害虫生防真菌莱氏绿僵菌SZCY菌株以去颖稻谷为固态培养基的发酵培养条件,该条件下产孢量大且对草地贪夜蛾幼虫毒力强,具有广阔的开发应用前景.

目的 提高星形孢菌素的产量.方法 本研究以星形孢菌素产生菌(Streptomyces sp.ST-07)为出发菌株,采用电转化方法和应用PCR扩增星形孢菌素生物合成的调控基因staR,成功构建含不同启动子(kasO*p和ermE*p)的加强表达staR基因的重组工程菌,分别命名为ST-D-5和ST-H-23.结果 通过对电转化条件的甘氨酸浓度、电场强度、菌丝体浓度、质粒浓度、孵育时间和孵育温度等关键参数优化,使电转化的效率从4×106提高至9.6×108(CFU/μgDNA);工程菌摇瓶发酵结果表明,与星孢菌素原始菌株ST-07相比,采用kasO*p启动子构建的工程菌ST-D-5星形孢菌素的产量提高了17％,最高单位可达923 mg/L.结论 本文系统摸索了星形孢菌素产生菌的电转化条件,显著提高了电转化效率,不但为该菌株的高产遗传改造奠定了基础,而且对其他放线菌的遗传操作体系建立提供了有益借鉴.

采用常压室温等离子体技术(Atmospheric Room Temperature Plasma,ARTP)对雪白白僵菌FIM-1809 菌株进行诱变,得到一株遗传稳定性较高的突变高产菌FIM-1809-7,其产环孢菌素A能力较初始菌株提高约39%.通过单因素和正交设计试验优化,确定最佳发酵培养基组分及培养条件为:玉米浆粉6%、可溶性淀粉12%、葡萄糖1.2%、蛋白胨2%,pH 5.6,菌种菌龄为 72 h,接种量10%,装液量70 mL/500 mL,发酵时间8d,最终突变菌株产环孢菌素A效价较出发菌种增加了约53%.结果表明,采用ARTP技术结合发酵条件优化能够有效提高雪白白僵菌产环孢菌素A的能力,为该菌株的工业化应用奠定了良好的基础.

目的 探讨微波辅助离子液体提取发酵石榴籽总黄酮的工艺条件,并测定其体外抑制亚硝化反应作用.方法 以总黄酮得率为评价指标,通过Plackett-Burman (PB)设计筛选提取工艺中影响总黄酮得率的显著性因素,中心组合设计优化主要影响因素的最佳参数水平.再通过比色法测定总黄酮对亚硝酸盐的清除能力及对亚硝胺合成的抑制能力.结果 最佳条件为离子液体浓度0.81 mol/L,提取时间9.5 min,微波功率560 W,总黄酮平均得率为1.65％.总黄酮对亚硝酸盐的最大清除率为84.4％,对亚硝胺合成的最大阻断率为76.8％.结论 发酵石榴籽总黄酮提取得率较高,时间较短,对亚硝酸盐的清除能力和对亚硝胺合成的阻断作用较强,并且呈现剂量效应关系.

[背景]Hygrocins是一种萘安莎抗生素,具有良好的新药开发潜能.但在常见培养基及发酵条件下菌体内Hygrocin A含量一般很低,甚至难以直接进行准确检测.[目的]提高吸水链霉菌ATCC 29253发酵物中HygrocinA的产量.[方法]采用单因素与正交试验设计优化相结合的方法系统考察碳源、氮源、磷酸盐、MgC12浓度、NaC1浓度、种子菌龄等因素对吸水链霉菌ATCC 29253产Hygrocin A能力的影响.[结果]最佳发酵条件为(g/L):葡萄糖4.0,黄豆饼粉8.0,麦芽提取物10.0,K2HPO4 1.5,KH2PO4 1.5,NaCl l.5,MgCl2 1.0;种子最佳活化时间为48 h;培养参数:摇床转速200 r/min,初始pH为6.8-7.0,瓶装量50 mL/250 mL,接种量5％,30℃培养10d.在优化条件下,Hygrocin A产量与其原始培养基M10相比提高了500％,Rapamycin产量同时下降了95％.[结论]通过培养基优化,可显著提高吸水链霉菌ATCC 29253中Hygrocin A产量,为HygrocinA合成应用研究奠定基础,同时可使Rapamycin严量明显下降.这说明可通过选择培养条件有目的地调节两种抗生素的代谢通量,进而开展多种抗生素同时表达的代谢调控研究.

本实验选用符合《饲料添加剂品种目录》的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)EM1、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)JM、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BW2作为发酵菌株对花生粕进行固体发酵,以多肽和总酸含量为指标,通过单因素实验及正交试验对植物乳杆菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌接种量,发酵温度,发酵时间和料液比进行优化.确定工艺参数为:植物乳杆菌接种量5％,酿酒酵母接种量9％,枯草芽孢杆菌接种量9％,料液比1∶1.2,发酵温度37 ℃,发酵时间48 h.在此条件下发酵花生粕,多肽和总酸含量分别为18.89％±0.35％和9.12％ ±0.23％,较优化前分别提高33.78％和24.45％,提高幅度较大,可见优化后工艺稳定且重复性较好.

纽莫康定B0是棘白菌素类化合物,其半合成衍生物卡泊芬净已被美国食品药品监督管理局(FDA)批准用于治疗无效或无法耐受其他抗真菌药的患者的侵袭性曲霉病.然而,通过发酵产生的纽莫康定B0的效价较低,限制了卡泊芬净的工业生产.本研究将优化好的的培养基进行了改良,添加了4种前体物质.研究结果表明,大豆油、亮氨酸、异丁醇和甲硫氨酸显著影响发酵单位;进一步的正交试验结果表明,大豆油(A)对纽莫康定B0效价的影响极显著(P＜0.05),亮氨酸(B)、异丁醇(C)和甲硫氨酸(D)影响次之,最优发酵条件为A2B2C3D2即大豆油6.0g/L,亮氨酸1.0g/L,异丁醇4.0ml/L,甲硫氨酸0.3g/L时,纽莫康定B0发酵单位达到1295mg/L左右.此外,还应用正交试验验证各因素的显着性.当将kLa作为指导参数,使用A315型叶轮的100L发酵罐进行放大和工业规模生产时,与原始效价相比,纽莫康定B0产量增加了361％,并达到了2250mg/mL的水平.

为了实现生料发酵更好的应用,考察料水比、发酵温度、氮源及接种量等因素对木薯生料发酵生产燃料乙醇的影响,并通过正交试验分析主要因素之间的相互作用.结果表明:木薯生料发酵产燃料乙醇的最佳条件为料水比1∶2.0,活性干酵母接种量0.15％(质量分数),发酵温度32℃,发酵周期120 h,尿素添加量0.20％(质量分数).在最佳条件下,发酵得到的燃料乙醇的酒精度可达到15.12％(体积分数).本实验为高效利用木薯生料发酵生产燃料乙醇的工业化生产提供了重要参数.