目的:利用毕赤酵母高效表达新型冠状病毒刺突蛋白受体结合域(receptor binding domain，RBD)，并评估以该RBD蛋白作为抗原所制备的疫苗组合物的免疫原性。方法:选取RBD蛋白并合成对应基因片段，将其构建至pPICZαA质粒，质粒经线性化转化后整合到毕赤酵母基因组中进行重组表达。Western blot和基于BLI(Biolayer Interferometry)技术的定量分析方法对培养上清中RBD蛋白进行检测，筛选能够分泌表达RBD蛋白的单克隆菌株。通过优化发酵工艺，包括培养基的盐浓度调整和诱导条件优化(pH、温度和时间等参数)，实现RBD蛋白的高效表达，并在小鼠体内评估其免疫原性。结果:筛选获得重组RBD蛋白表达效果较好的RBD-X33单克隆菌株。通过优化后的发酵工艺，即采用HBSM培养基、诱导pH为6.5±0.3、诱导温度为22℃、诱导时间持续120 h，实现发酵收获上清中重组RBD的表达量达到240 mg/L。在小鼠免疫原性试验中，采用铝+CpG双佐剂系统吸附重组RBD蛋白的疫苗组合物能够激发小鼠产生2.7×10 6结合抗体滴度和726.8活病毒(野生型)中和抗体滴度。 结论:采用毕赤酵母表达系统能够高效表达重组RBD蛋白，且所表达的RBD蛋白能够有效激发动物产生免疫应答。本研究为基于RBD蛋白的重组新型冠状病毒疫苗的开发提供了参考。

目的:观察交配型转换/蔗糖不发酵(SWI/SNF)复合体调节亚基Brahma相关基因-1(Brg-1)对结直肠癌血管生成的影响。方法:对结肠癌细胞系LoVo细胞感染sh-Brg-1慢病毒(Lenti-sh-Brg-1组)和对照病毒(Lenti-con组)，通过蛋白质印迹法(Western blot)及实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)检测常氧及乏氧状态下乏氧诱导因子-1α(HIF-1α)、血管内皮生长因子-A(VEGF-A)的蛋白和mRNA水平的变化，运用体外微管形成实验观察低表达Brg-1对结直肠癌血管形成的影响，组间比较采用 t检验。 结果:Western blot结果证明，与Lenti-con组比较，Lenti-sh-Brg-1组细胞中Brg-1蛋白表达量明显降低。在常氧及乏氧状态下低表达Brg-1可以明显降低HIF-1α及VEGF-A在蛋白表达量。在常氧状态下，Lenti-sh-Brg-1组细胞Brg-1(con 1.00±0比sh-Brg-1 0.53±0.08， t＝5.292， P<0.01)，HIF-1α(con 1.00±0比sh-Brg-1 0.61±0.07， t＝5.380， P<0.01)，VEGF-A mRNA水平低于Lenti-con组(con 1.00±0比sh-Brg-1 0.38±0.10， t＝6.169， P<0.01)；在乏氧状态下，Lenti-sh-Brg-1组细胞Brg-1(con 1.00±0比sh-Brg-1 0.07±0.02， t＝44.680， P<0.01)，HIF-1α(con 1.00±0比sh-Brg-1 0.21±0.05， t＝14.280， P<0.01)，VEGF-A mRNA水平低于Lenti-con组(con 1.00±0比sh-Brg-1 0.15±0.06， t＝13.960， P<0.01)。最后证实在常氧和乏氧条件下，Brg-1低表达细胞条件培养基组的人脐静脉内皮细胞体外成管数目低于对照组(常氧，con 55.67±7.22比sh-Brg-1 22.33±5.36， t＝3.706， P<0.05；乏氧，con 66.33±7.62比sh-Brg-1 35.68±4.91， t＝3.382， P<0.05)。 结论:在LoVo细胞系中低表达Brg-1可以通过下调HIF-1α抑制血管形成。

目的 探究两歧双歧杆菌BD-1(Bifidobacterium bifidum BD-1,BD-1)以2-岩藻糖基乳糖(2'-fucosyl-lactose,2'-FL)作为唯一碳源时,与葡萄糖相比,其菌体和代谢产物诱导小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞分泌细胞因子的效应,以探索BD-1菌利用母乳低聚糖后免疫调节的菌株特性.方法 (1)菌体部分干预实验:将BD-1活菌接种于不同碳源的改良MRS肉汤培养基中,改良过的MRS肉汤培养基包括以2％2'-FL作为唯一碳源(2'-FL组)和以2％葡萄糖作为唯一碳源(Glu组)的培养基.将接种后的BD-1活菌在厌氧条件下培养24h后,分离各组菌体和培养基上清液.将菌体部分与RAW264.7细胞共同培养,并以肽聚糖(pep-tidoglycan,PGN)为菌体成分对照,同时设置不添加干预物的阴性对照(Ctrl组).(2)菌体代谢产物部分干预实验:将培养基上清液与RAW264.7细胞共同培养,以含有2％2'-FL或葡萄糖但未进行BD-1菌发酵处理的培养基作为实验对照,并设置不添加干预物的培养基与RAW264.7细胞的共培养上清液作为阴性对照(Ctrl组),以PGN与RAW264.7细胞的共培养上清液作为阳性对照(PGN组).培养24h后,提取RAW264.7细胞总RNA,逆转录后采用实时荧光定量PCR检测肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素(interleukin,IL)-6、IL-10、IL-12、IL-1β的基因表达量;收集各组受试物与RAW264.7细胞的共培养上清液,采用酶联免疫吸附试验检测共培养上清液中上述细胞因子的分泌量.结果 (1)菌体部分干预:与PGN组相比,菌体部分2'-FL组和Glu组的TNF-α、IL-6、IL-10分泌量及基因表达量显著上升(均P＜0.05).与Glu组相比,2'-FL组的IL-6、IL-10分泌量显著下降(均P＜0.05),IL-6、IL-10的基因表达具有下降趋势.(2)菌体代谢产物部分干预:BD-1-2'-FL上清组和BD-1-Glu上清组的TNF-α、IL-6及IL-10分泌水平以及基因表达水平较2'-FL组和Glu组(未进行BD-1菌发酵处理的组别)有显著提高(均P＜0.05),而且2'-FL组中IL-6、IL-10的分泌量较Glu组显著增加(均P＜0.05),IL-6表达水平显著升高(均P＜0.05),IL-10表达水平有升高的趋势.2'-FL组相较于Glu组能产生更多的有机酸和种类更为丰富的糖类物质.结论 利用母乳低聚糖或葡萄糖作为唯一碳源培养BD-1菌体和诱导巨噬细胞分泌细胞因子的特征存在差异.当BD-1以母乳低聚糖为唯一碳源时,与葡萄糖相比,菌体成分呈现出抗炎倾向,在巨噬细胞中表现为IL-6的分泌和基因表达能力下降;而其代谢产物则具有刺激免疫激活的趋势,在巨噬细胞中导致IL-6和IL-10的分泌及基因表达能力上升.

目的 比较α-1,6葡聚糖和低聚异麦芽糖对益生菌的体外增殖作用,评价2种低聚糖对人体肠道菌群的影响.方法 脆弱拟杆菌在分别含有2种低聚糖的不同培养基中发酵,活菌计数绘制生长曲线;采集12位健康志愿者的新鲜粪便,将肠道菌群悬液按10％的接种量分别接种于Control组(含氮基础培养基)、α-1,6葡聚糖组(含氮基础培养基加1％α-1,6葡聚糖)及低聚异麦芽糖组(含氮基础培养基加1％低聚异麦芽糖),37℃恒温静态厌氧发酵24 h.采用高通量测序技术分析粪便发酵液菌群结构;应用高效液相色谱法检测粪便发酵液中短链脂肪酸(SCFAs)水平.结果 α-1,6葡聚糖促进脆弱拟杆菌增殖的能力较低聚异麦芽糖强[(5.27±0.33)vs(4.80±0.66),×108 CFU/mL];粪便发酵实验显示α-1,6葡聚糖可降低粪便中厚壁菌门/拟杆菌门比值(t=2.821,P=0.0478),显著提升 SCFAs 水平(丙酸:t=3.750,P=0.0092;丁酸:t=5.747,P=0.0018).结论 α-1,6葡聚糖可以改善肠道菌群结构并促进SCFAs产生.

目的 研究淫羊藿总黄酮(total flavonoids of epimedium,TFE)对长双歧杆菌生长代谢的调控影响与长双歧杆菌发酵液的抗炎活性.方法 葡萄糖缺乏的MRS培养基中分别加入浓度为0.5％、1.0％、2.0％的淫羊藿总黄酮作为培养基,设置2.0％葡萄糖和2.0％低聚果糖培养基作为对照,测定发酵后长双歧杆菌的活菌数(CFU)、吸光度值等指标,以明确淫羊藿总黄酮对长双歧杆菌生长的影响,并使用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)测定发酵液的体外抗氧化活性.以LPS诱导的RAW264.7为炎症模型,评价培养前后发酵液对造模前后相关炎症因子水平以确定抗炎作用.结果 TFE能够显著促进长双歧杆菌的增殖,5mg/mL、0.5 mg/mL、0.05mg/mL TFE的促生长率分别为59％、23％、20％,24h生长曲线也表明TFE的促增殖作用.胃肠道耐受性能研究发现,在长双歧杆菌生长环境中添加2％TFE能够提高菌株在0.3％胆盐(t=6.008,P＜0.01)、人工胃液(t=4.371,P＜0.05)和pH值为3的酸性环境(t=9.645,P＜0.001)中的稳定性,并提高了菌株在含有氯四环素、克林霉素、卡那霉素、甲硝唑、万古霉素的培养基中的生长浓度和体外抗氧化能力(t=15.141,P＜0.001).此外,添加TFE的长双歧杆菌发酵液可降低LPS诱导下的巨噬细胞表达促炎因子 TNF-α(t=4.655,P＜0.01)、IL-1β(t=7.775,P＜0.01)和 IL-6(t=7.775,P＜0.01)的水平,进而改善LPS诱导的炎症反应.结论 淫羊藿总黄酮可促进长双歧杆菌的生长与菌株稳定性,并增强长双歧杆菌的抗炎活性,有成为新型中药来源益生元的潜力.

目的 筛选具有降解胆固醇功能和良好生物学特性的乳酸菌.方法 以胆固醇为唯一碳源的基础盐培养基从健康人体粪便中筛选具有降解胆固醇功能的乳酸菌,采用16S rRNA基因测序分析确定菌株种属,对其耐酸、耐胆盐、耐过氧化氢、发酵上清液抑菌活性、肠上皮细胞黏附及胆固醇清除能力等生物学特性进行系统评价,并选用综合性能良好植物乳植杆菌进行动物实验,探究其体内的降胆固醇功能.结果 经16S rRNA基因测序分析,获得5株具有降胆固醇功能的植物乳植杆菌,对其生物学特性进行评测,发现5株菌均具有良好的耐酸耐胆盐耐过氧化氢能力,在pH 3.0的酸性条件下处理6 h,活菌数与初始菌量保持在同一数量级;3.0g/L胆盐的条件下处理6h,其活菌数保持在106CFU/mL;1.0 mmol/L过氧化氢条件下处理6h,活菌数显著增加.MRS发酵上清液对5种常见的食源性致病菌都有不同程度的拮抗作用,其抑菌圈直径均大于8.5 mm;具有良好的肠上皮黏附特性,对Caco-2细胞的黏附率均大于25％;胆固醇清除能力差异较大,其中植物乳植杆菌GLPL03和GLPL04的清除能力较强,达到59％和53％.综合菌株性能,选用植物乳植杆菌GLPL03和GLPL04进行为期12周的动物实验,发现植物乳植杆菌GLPL03和GLPL04能够显著降低小鼠血清总胆固醇和总甘油三脂水平,缓解小鼠高胆固醇血症的发展.结论 健康人体来源的5株植物乳植杆菌具有良好的生物学特性,可作为益生菌进行深入研究.

该研究旨在通过耐盐能力、产吲哚乙酸(IAA)能力、溶磷能力、产铁载体能力等指标评价一株甘草内生尖孢镰刀菌的体内功能,通过根癌农杆菌介导的遗传转化技术建立该菌的稳定遗传转化体系,并通过标记基因绿色荧光蛋白(GFP)的克隆和β-葡萄糖苷酸酶(GUS)染色的效率检测转化子的稳定性与染色高效性,筛选出高效稳定的转化子用于回染甘草,评价其对甘草幼苗生长的影响.研究结果表明该菌耐盐性较好,在含 7%氯化钠的马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上仍能生长,但生长速度随着PDA培养基中氯化钠含量的增高而减缓;该菌具有产吲哚乙酸的功能,其发酵液中IAA的质量浓度约为 3.32 mg·mL-1.该研究成功构建了该菌的遗传转化体系,且其根癌农杆菌介导的遗传转化(ATMT)体系高效而稳定.筛选获得 1株兼具染色高效性和遗传稳定性的转化子,该转化子在甘草植株中的回染率为 76.92%,能够显著提高一月龄甘草幼苗的主根长,促进甘草幼苗根部的生长发育.该研究结果可以为生物菌肥的开发及优质甘草的生长调控奠定基础.

[目的]对链霉菌Streptomyce sp.FIM18-0592 进行菌种鉴定,并对其胞外格尔德霉素产量进行发酵工艺优化,旨在提高产量并降低发酵成本.[方法]通过形态特征、培养特征和生理生化特性,结合 16S rDNA序列分析构建系统发育树进行菌种鉴定;采用单因素试验优化培养条件及培养基配方,进一步使用最陡爬坡试验和响应面试验优化培养基配方的含量.[结果]通过对链霉菌FIM18-0592 的形态特征、培养特征及生理生化特征进行初步培养观察发现,其在ISP2 等培养基上生长较好,气生菌丝旺盛,产黑色素.结合 16S rDNA分子鉴定,确定该菌为格尔德霉素链霉菌(Streptomyces geldanamycininus).通过单因素试验对发酵条件以及培养基配方进行优化,得到最适宜菌株发酵的培养条件为转速 140 r/min、装液量 12%(体积分数)、接种量 7%(体积分数)、培养时间 144 h.最佳的碳源、氮源、无机盐分别为葡萄糖、黄豆饼粉和硫酸铵.采用最陡爬坡试验和响应面优化试验确定了其最优的发酵培养基为:葡萄糖 10.42%、黄豆饼粉 1.68%、硫酸铵 0.3%、乳酸 0.3%、甘油 4%、硫酸镁 0.1%、碳酸钙 0.4%,在此条件下,格尔德霉素的发酵效价达到 2 887 μg/mL,较原始发酵工艺效价提高了 66%.[结论]链霉菌FIM18-0592 为格尔德霉素链霉菌,通过对其发酵工艺进行优化显著提高格尔德霉素的产量,为格尔德霉素及其衍生物的开发和利用奠定基础.

[目的]为解决在D-乳酸工业发酵生产中使用农业粗加工或废弃物等廉价原料(含有少量L-乳酸)而导致终产物D-乳酸光纯降低的问题.[方法]构建了带有不同启动子的L-乳酸脱氢酶基因lldD的表达质粒:pUC19-PLD(PpflBp6)、pUC19-NLD(PnirB)及pUC19-PNLD(PpflBp6-PnirB),并将它们分别转化入大肠杆菌D-乳酸工程菌HBUT-D中,得到菌株HBUT-D3、HBUT-D5 和HBUT-D7.通过LldD的酶活检测以及对NBS培养基(添加 1 g/L L-乳酸)发酵结果的TOPSIS多元评估,优选出可快速去除L-乳酸且不影响D-乳酸发酵的菌株,并使用农业廉价原料进行发酵.[结果]HBUT-D7 的LldD比酶活为64 U/g,L-乳酸的消耗速率为 34 mg/(L·h),D-乳酸的生产强度为 4.09 g/(L·h),综合评估为最优菌株.以玉米浆为原料进行发酵时,HBUT-D及HBUT-D7 的L-乳酸消耗速率分别为 10.41 mg/(L·h)及 34.75 mg/(L·h);D-乳酸生产强度分别为 4.24 g/(L·h)及 3.87 g/(L·h);D-乳酸光学纯度分别为 99.07%及 99.92%.以糖蜜为原料进行发酵时,HBUT-D及HBUT-D7 的L-乳酸消耗速率为6.87 mg/(L·h)和 17.18 mg/(L·h);D-乳酸生产强度分别为 1.93 g/(L·h)及 1.88 g/(L·h);D-乳酸光学纯度分别为 99.22%及 99.99%.[结论]厌氧诱导启动子的表达质粒可提高菌株HBUT-D7 的L-乳酸脱氢酶酶活,使其在使用廉价原料发酵时能有效消除L-乳酸,提高发酵终产物D-乳酸的光学纯度.

为探究棕鞭金藻生产岩藻黄素的综合性能,以期建立高效合成岩藻黄素的发酵工艺,研究首先对金藻发酵培养基中的碳氮比、维生素添加量进行优化.结果表明,当碳氮比为24、维生素添加量为3.75 mg/L维生素B1和1.25 mg/L维生素B12时,有利于金藻细胞内的岩藻黄素高效合成.此外,通过调控金藻光/暗培养模式,对其在不同条件下的细胞生长、最大光合效率和岩藻黄素积累情况进行比较研究,结果显示从种子培养到上罐发酵全过程进行光诱导后,胞内岩藻黄素含量显著提升.通过系统优化,金藻发酵后的胞内岩藻黄素含量和产量分别达到1.79 mg/g和33.6 mg/L,比优化前的发酵水平提高33.6%和31.2%.研究利用发酵优化技术强化了棕鞭金藻的岩藻黄素积累,为后续进一步进行大规模过程放大奠定了前期基础,也为其他微藻生产岩藻黄素提供了借鉴和参考.