研究旨在建立一套准确、经济的团头鲂(Megalobrama amblycephala)家系鉴定体系,以期为团头鲂的遗传参数评估及基因组和分子标记育种奠定基础.精选8个高多态性的微卫星标记对二段法筛选后的228尾耐低氧快生长团头鲂"浦江2号"子代进行亲子鉴定分析,利用CERVUS软件分析实验结果.等位基因频率分析结果显示8个微卫星标记的平均等位基因数(Na)为8个,平均观测杂合度(Ho)为0.813,平均期望杂合度(He)为0.775,平均多态信息含量(PIC)为0.743.亲子鉴定结果显示双亲性别已知时8个微卫星标记的累积排除概率为0.9999,说明筛选出的8个微卫星标记适用于团头鲂家系的亲子鉴定分析.当使用筛选的8个微卫星标记进行亲子鉴定时,228尾团头鲂子代中有221尾子代能找到其父母本,实际鉴定率为96.93％,这与实际记录的系谱信息一致.研究成功地为筛选后的耐低氧团头鲂个体找到父母本并划分家系,为进一步开展遗传参数的评估工作奠定了基础.

为研究跨膜转录因子核因子E2相关因子1(Nuclear factor-erythroid 2 related factor 1,nrf1)在动物机体抗氧化应激过程中的作用,通过同源克隆获得草鱼nrf1基因序列,其开放阅读框为1560 bp,编码519个氨基酸;系统进化树分析表明草鱼nrf1与团头鲂(Megalobrama amblvcephala)进化关系较近.对nrf1进行组织表达分析,结果显示nrf1在肝脏中表达水平最高,其次是心脏和肠道(P＜0.05).昼夜节律分析显示,在9:00时nrf1表达水平最高且显著高于3:00、12:00、18:00、21:00和24:00(P＜0.05).经急性氨氮胁迫处理24h和48h时,发现草鱼nrf1基因在低氨氮(5 mg/L)组和高氨氮(20 mg/L)组中表达量相对于对照组均显著升高(P＜0.05);且低氨氮组nrf1表达量在24h时显著低于高氨氮组(P＜0.05),而在48h时显著高于高氨氮组(P＜0.05).此外,研究使用3种不同蛋白源(鱼粉、菜粕和豆粕)饲料对草鱼进行生长实验,发现在养殖后14d、28d和35d,菜粕和豆粕组nrf1表达水平显著高于鱼粉组(P＜0.05),其中28d时豆粕组nrf1表达量显著高于菜粕组(P＜0.05).综上所述,草鱼nrf1基因表达具有组织特异性,且受到水体氨氮浓度和饲料蛋白源的调控,研究为揭示鱼类nrf1基因的分子特征及其抗氧化应激反应中的功能奠定了理论基础.

为调查山谷型水库的鱼类群落营养结构及其食物资源利用情况,基于碳(δ13C)、氮(δ15N)稳定同位素技术研究了湖北省洈水水库2020年夏季与秋季鱼类群落结构特征,并运用贝叶斯混合模型评价4种潜在碳源(颗粒有机物、陆生植物、周丛藻类和有机碎屑)对不同食性鱼类的贡献.结果表明:洈水水库鱼类群落的营养结构存在季节差异,鱼类群落的营养层次(NR)、基础食物来源(CR)、生态位总空间(TA)、群落的整体密度(NND)、聚集均匀程度(SDNND)和核心生态位空间(SEAc)等参数为夏季高于秋季,表明夏季食物源多样性高、营养冗余程度低、食物网结构更加复杂而稳定.洈水水库夏季和秋季鱼类均依赖外源性碳源,但两个季节的利用方式存在显著差异(P＜0.05).整体上,陆生植物在两个季节对洈水水库鱼类的碳源贡献最大,但夏季周丛藻类为次重要碳源,秋季有机碎屑为次重要碳源,颗粒有机物(POM)在两个季节均不重要.夏季和秋季对外源碳的依赖程度最高的鱼类均为黄尾鲴(碎屑食性鱼类),对外源碳的依赖程度最低的鱼类为鳙(滤食性鱼类)和团头鲂(植食性鱼类).在夏季和秋季共有的9种鱼类中,肉食性鱼类(鳜、蒙古鲌)、杂食性鱼类(鲤、鲫)与碎屑食性鱼类(黄尾鲴)营养级变化显著.夏季鱼类营养级范围为2.5-3.5,平均3.01,而秋季鱼类营养级范围为2.9-3.8,平均3.32.基于稳定同位素技术分析不同食性鱼类的营养级发现,秋季鱼类的营养级普遍高于夏季(P＜0.05).研究揭示洈水水库鱼类夏季和秋季的碳源利用存在显著差别,鱼类的营养级秋季普遍高于夏季,这主要是由于洈水水库秋季的低水位不利于陆生植物进入水生食物网,鱼类食物资源竞争加剧、捕食作用加强所致.基于贝叶斯混合模型分析鱼类食物资源的利用情况表明:植食性鱼类和杂食性鱼类的鱼苗投放时间应选在早春(2-3月),碎屑食性鱼类鱼苗的投放时间在秋、冬季更加合适,这将为研究山谷型水库鱼类群落的营养结构及渔业结构调整方案提供科学依据.

试验采用RACE技术克隆了团头鲂( Megalobrama amblycephala)G蛋白偶联受体43(GPR43)基因的cDNA序列,并探究了不同组织中的GPR43 mRNA表达量及黄连素对其表达量的影响.结果显示,克隆得到的团头鲂GPR43基因的cDNA序列全长为2026 bp, 含有1个长度为 981 bp的开放阅读框, 编码了326个氨基酸.RT-PCR检测发现GPR43在团头鲂的肠道、肌肉、鳃和肝胰腺中具有较高的表达.为期8周的养殖试验选取均重为(80.00±0.90) g的团头鲂320尾, 随机分于16个网箱中, 饲喂4种不同的试验日粮, 分别为正常日粮(脂肪含量为5%)、正常日粮+50 mg/kg黄连素、高脂日粮(脂肪含量为10%)、高脂日粮+50 mg/kg黄连素.结果显示:在肠道组织中,与正常日粮组相比,高脂组的GPR43表达量降低,添加黄连素能够显著升高其表达水平(P＜0.05).与正常日粮组相比, 高脂组的胆固醇(CHO)含量以及细胞分裂素蛋白激酶(p38)的表达量均呈现了显著上升(P＜0.05)的趋势, 添加黄连素后其含量及表达量显著下降(P＜0.05).肝胰腺组织和肌肉组织中的多不饱和脂肪酸(PUFA)含量变化也有着相似的趋势, 而肉碱棕榈酰基转移酶Ⅰ(CPT Ⅰ)、过氧化物酶体增值因子α&β (PPARα&β)、AMP依赖性蛋白激酶(AMPK)的表达量以及2个组织中的饱和脂肪酸(SFA)和单不饱和脂肪酸(MUFA)含量呈现出了相反的趋势.此外, 在正常日粮中添加黄连素并不能对上述各指标产生明显的调控效应,有时反而会导致轻微的负调控效应.综上结果表明,黄连素能够显著上调GPR43在高脂抑制下的表达量, 同时能够缓解高脂诱导的团头鲂肝胰腺脂肪沉积, 改善其脂肪代谢性能.黄连素对于脂肪代谢的调控作用可能通过GPR43受体来实现.

为了指导三角鲂(Megalobrama terminalis)、团头鲂(Megalobrama amblycephala) 与翘嘴鲌(Erythroculter ilishaeformis)的杂交育种工作, 利用筛选出的16对微卫星引物, 比较分析了团头鲂、三角鲂、翘嘴鲌、团头鲂 ♀×翘嘴鲌♂、三角鲂♀×翘嘴鲌♂后代群体的遗传结构; 结果显示, 平均等位基因数(Na)分别为3.56、3.63、 3.44、4.00和4.31, 平均观测杂合度(Ho)分别为0.3510、0.3757、0.3175、0.3818和0.4079, 平均期望杂合度 (He)分别为0.6182、0.6290、0.5921、0.6490和0.6825, 平均多态信息含量(PIC)分别为0.5354、0.5367、 0.5258、0.5785和0.6067.杂交群体的平均多态信息含量均大于他们的亲本团头鲂、三角鲂和翘嘴鲌, 表明杂交亲群体的遗传多样性较高.聚类分析显示团头鲂与三角鲂首先聚类, 团头鲂♀×翘嘴鲌♂与三角鲂♀×翘嘴鲌♂首先聚类, 然后这2大类聚为一支, 最后与翘嘴鲌聚类.其中团头鲂与翘嘴鲌遗传距离最远, 为0.5204,团头鲂和三角鲂遗传距离最近, 为0.0853, 结合遗传相似度分析表明2种杂交子代均具有母本效应.基因型分析表明, 2种杂交后代的等位基因均来自于父母本.引物TTF3、TTF4、TTF10以及Mam25在5个群体中均可产生特异性条带, 可区分5个群体.研究结果对三角鲂×翘嘴鲌和团头鲂×翘嘴鲌的良种选育、种质资源保存以及种群鉴定具有重要意义.

为了标记团头鲂(Megalobrama amblycephala)的原始生殖细胞(Primordial Germ Cells,PGCs),首次克隆并鉴定了团头鲂nanos3基因(mananos3).mananos3全长1027 bp,包括48 bp 5′UTR(5′untranslated Region),490 bp 3′UTR和489 bp开放阅读框(Open Reading Frame,ORF).该基因编码162个氨基酸.通过序列比对发现Mananos3蛋白和其他物种Nanos蛋白一样,存在一个保守的RNA结合功能域,该功能域包含一个锌指基序(Motif).系统发育树结果显示,Mananos3与鲤(Cyprinus carpio)的Nanos3最为相近.半定量和定量PCR结果表明,mananos3具有较高的母源表达,并在胚胎发育早期高量表达,而在1000细胞期之后表达量逐渐降低.在成体组织中,mananos3仅在卵巢中检测到表达.mananos3和斑马鱼(Danio rerio)nanos3(zfnanos3)的3′UTR均可以介导绿色荧光蛋白特异标记团头鲂和斑马鱼胚胎发育早期的PGCs,但是mananos3的3′UTR能够更特异地标记团头鲂的PGCs.通过比对mananos3和zfnanos3的3′UTR发现,mananos3的3′UTR中有一个非经典的miR430识别位点(GCACTA).通过对该位点的突变研究证实其有利于nanos3在非PGCs组织中的降解.综上所述,团头鲂mananos3的3′UTR序列中的非经典miR430识别位点(GCACTA)可能与介导报告基因在PGCs中特异表达相关.

采用常规瑞氏染色和细胞化学染色方法对团头鲂(Megalobrama amblycephala)外周血细胞的显微结构及细胞化学特征进行了观察.在团头鲂外周血细胞中可区分出六类细胞:红细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和血栓细胞.其中淋巴细胞是除红细胞外含量最多的细胞,其次分别为血栓细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞.成熟红细胞多为卵圆形,表面光滑,胞核呈椭圆形或圆形,染色质较为致密;淋巴细胞多呈圆形,胞质较少,胞核常偏位;单核细胞多为圆形,胞核呈圆形或椭圆形,胞质内可见空泡状结构;嗜中性粒细胞近似圆形,胞核常偏于细胞一侧,呈分叶状、肾形或椭圆形,核质界限清晰;嗜酸性粒细胞一般为圆形,胞核为肾形或椭圆形,胞质中充满紫红色颗粒;血栓细胞形态多样,主要有椭圆形、纺锤形、长杆状和泪滴形,核质比较大.淋巴细胞呈α-醋酸萘酚酯酶(ANAE)阳性,呈过碘酸-雪夫(PAS)、氯乙酸AS-D萘酚酯酶(AS-DCE)弱阳性,呈苏丹黑B(SBB)、酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)及过氧化物酶(POX)阴性;单核细胞呈POX、ACP强阳性,PAS、SBB、AS-DCE和ANAE为阳性,呈AKP阴性;嗜中性粒细胞除PAS和ANAE为弱阳性外,其他染色结果和单核细胞相同;嗜酸性粒细胞呈POX、ANAE强阳性,SBB、ACP阳性,PAS及AS-DCE则为弱阳性,呈AKP阴性;血栓细胞呈PAS、AS-DCE及ANAE弱阳性,呈SBB、ACP、AKP及POX阴性.团头鲂外周血细胞的显微结构及细胞化学特征与其他鱼类具有相似之处,但亦有其明显的物种特异性.该研究结果可作为监测团头鲂健康状态的依据,为其养殖及病理诊断提供基础资料.

为了探讨游泳加速模式对不同生态习性鱼类游泳性能及运动代谢的影响,评估团头鲂(Megalobrama amblycephala)和南方鲇(Silurus meridionalis)的临界游泳速度(Ucrit)、爆发游泳速度(Uburst)和最大代谢率(MMR)的适宜测定方法,在4种加速模式条件下,检测了实验鱼的最大游泳速度(Vmax),以及鱼体在运动过程中及其力竭后代谢恢复期的耗氧率(MO2).结果显示:在速度增量(ΔV)为20 cm/s,加速持续时间(Δt)为2min的加速模式条件下,团头鲂和南方鲇的Vmax及游泳过程的无氧代谢占比均分别显著高于其他3种加速模式(P<0.05),呈爆发运动(Uburst)状态.在ΔV为10 cm/s,Δt分别为20、40和60min的加速模式下,两种鱼的无氧代谢占比均在12％以下且相互间无显著差异(P>0.05);其中团头鲂在这3种加速模式下的Vmax之间无显著性差异(P>0.05);而南方鲇在ΔV为10 cm/s、Δt为20min条件下的Vmax显著高于另2种加速模式的测定值(P<0.05).两种鱼的MO2在各加速模式下均随着游泳速度的升高而增加;但在爆发游泳过程中,两种鱼的MO2随游泳速度的增加呈现不同的变化趋势,团头鲂的MO2随速度的变化曲线在接近100 cm/s的时候出现拐点,此后MO2随速度的增幅变小;而南方鲇的该曲线在速度为20 cm/s时就出现拐点,MO2的变化进入"平台期".在所有加速模式下,两种鱼在运动过程中的最大耗氧率(AMO2)均显著高于力竭后代谢恢复期的最大值(DMO2,P<0.05).用Ucrit法测得团头鲂的AMO2高于Uburst法的测得值,而南方鲇则相反.由研究结果得出,测定团头鲂的Ucrit采用ΔV为10 cm/s、Δt在20—60min的加速模式是适宜的,测定南方鲇Ucrit的适宜加速模式是ΔV为10 cm/s、Δt为20min.两种鱼均应采用在运动阶段测得的最大MO2作为MMR;测定团头鲂的MMR适用于Ucrit法,测定南方鲇的MMR适用于Uburst法.团头鲂持续游泳的能力较强,爆发游泳的加速能力相对较弱;而南方鲇则表现出相反的趋势,该差异反映了物种适应其生态习性的权衡效应.

为研究团头鲂(Megalobrama amblycephala)5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,5mC)羟基化酶TET1(Ten eleven translocation 1)基因的功能及其表达特性,采用整胚原位杂交、qRT-PCR技术进行了胚胎、组织表达分析及其在急性低氧胁迫下的基因响应研究.序列分析结果表明,团头鲂TET1基因全长为5526 bp,编码1841个氨基酸.qRT-PCR结果表明,团头鲂TET1广泛表达于各个组织中,并在脑组织中高度表达.在胚胎发育过程中,TET1基因从受精卵开始就有表达,并在受精后20—44h(20—44 hpf)都维持在一个较高水平.原位杂交结果表明,TET1基因在12 hpf信号相对微弱,在24和36 hpf信号逐渐增强,并且都集中在头部表达.通过qRT-PCR检测急性缺氧处理TET1的表达量,结果表明,TET1基因在鳃和脾等组织中表达显著升高(P<0.01),在脑、皮肤、眼和肾脏中表达显著降低(P<0.01).在胚胎中,TET1基因相对表达量明显高于对照组,尤其在24 hpf低氧处理组的表达量显著地高于对照组(P<0.001).结果表明TET1基因在低氧应答反应中发挥着重要的作用.该研究结果为TET1基因在低氧响应及功能的保守与分化方面提供了新的视角.

骨形成蛋白(Bone morphogenetic protein,BMP)属于转化生长因子β(Transforming growth factor-beta,TGF-β)超家族.在骨形成蛋白家族中,BMP2属于分泌性多功能蛋白,具有较强的诱导骨细胞形成的能力.为了探究BMP2与肌间刺骨化的相关性,研究通过转录组测序和RT-PCR获得了唇?(Hemibarbus labeo)bmp2a基因cDNA序列.氨基酸序列比对结果显示,唇?BMP2A和其他鱼类BMP2保守性较高,都具有一个高度保守的TGFβ结构域,在该结构域中存在一个N-糖基化位点.此外,包括唇?BMP2A在内,鱼类BMP2都具有7个保守的半胱氨酸残基.系统进化树分析表明,唇?BMP2A与团头鲂(Megalobrama amblycephala)BMP2A最为接近.通过荧光定量PCR检测发现唇?bmp2a基因在所有被检测的组织中均有表达,bmp2a基因在鳃中的表达量最高,肝脏和肌肉中相对较高,在心脏中表达量最低.免疫组化结果显示BMP2A分布于肌肉肌隔中.此外,bmp2a基因的表达与肌间刺骨化时机相吻合.综上,唇?BMP2A与肌间刺骨化存在较高的相关性.研究结果将为进一步调查鱼类BMP2功能以及鱼类肌间刺形成分子机制提供理论依据.