目的:本研究利用单细胞RNA测序分析技术(scRNA-seq)初步探索乳腺癌4T1细胞表达淋巴细胞抗原6复合物E(Ly6E)调控肿瘤免疫微环境(TIME)的潜在机制.方法:利用CRISPR-Cas9技术构建Ly6e基因敲除小鼠乳腺癌4T1细胞(Ly6E-KO),观察其和野生型细胞(Ly6E-WT)体外增殖和体内生长能力的差异.流式细胞术分选两类肿瘤组织中的CD45阳性细胞,再进行scRNA-seq分析.对于测序结果,首先利用Seurat软件包筛选差异表达基因谱,根据标记基因进行注释;再利用Cellchat和Monocle2软件分析细胞互作关系和特定免疫细胞的演化轨迹.结果:与Ly6E-WT相比,Ly6E-KO体外增殖能力无显著差异,但体内生长能力显著降低(P<0.001).ScRNA-seq分析显示,Ly6E-KO移植瘤浸润DC比例显著高于Ly6E-WT,且DC处于更加活跃的增殖和分裂状态;三种DC亚群(pDC、cDC1和cDC3)与T细胞均存在显著的互作关系.同时发现,Ly6E-KO肿瘤中浸润T淋巴细胞增殖、活化及效应相关的基因表达水平均升高,提示Ly6E-KO具有更强抗肿瘤能力.最后,本研究对人类乳腺癌队列的scRNA-seq数据进行了分析,进一步证实了上述发现.结论:肿瘤细胞Ly6e基因敲除后可通过增加TIME中DC活化及浸润,继而增强机体抗肿瘤免疫应答.

目的:探讨靶向羧酸酯酶1f（Ces1f）基因敲减对脂多糖/D-半乳糖胺(LPS/D-GalN)诱导的急性肝衰竭小鼠枯否细胞（KC）极化活性的影响。方法:将携带靶向Ces1f干扰序列的小RNA（siRNA）与多肽转运载体（Endoporter）结合形成的复合物siRNA-EndoPorter包裹在β-1, 3-D葡聚糖壳中形成复合体颗粒(GeRPs)。将30只雄性C57BL/6小鼠随机分为正常对照组、模型组（LPS/D-GalN）、预处理组(GeRPs)、预处理模型组（GeRPs+LPS/D-GalN）、空载体组（EndoPorter）。采用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹（western blot）技术检测各组小鼠肝组织Ces1f mRNA及蛋白表达水平；采用实时荧光定量PCR技术检测各组小鼠KC M1极化表型分化簇86（CD86）mRNA以及KC M2极化表型分化簇163（CD163）mRNA表达水平；采用免疫荧光双染技术检测KC中Ces1f蛋白以及M1/M2极化表型CD86/CD163蛋白表达情况；采用苏木精-伊红染色观察肝组织病理损伤情况。多组间均数比较采用单因素方差分析，或方差不齐时采用独立样本非参数秩和检验。结果:正常对照组与模型组、预处理组和预处理模型组肝组织Ces1f mRNA/蛋白相对表达水平分别为：1.00±0.00、0.80±0.03/0.80±0.14、0.56±0.08/0.52±0.13、0.26±0.05/0.29±0.13，各组间差异均有统计学意义（ F值分别为9.171/3.957、20.740/9.315、34.530/13.830， P值均< 0.01）。正常对照组与模型组、预处理组和预处理模型组KC Ces1f阳性细胞百分比分别为91.42%±3.79%、73.85%±7.03%、48.70%±5.30%、25.68%±4.55%，各组间差异均有统计学意义（ F值分别为6.333、15.400、23.700， P值均< 0.01）。正常对照组与模型组、预处理模型组CD86 mRNA相对表达水平分别为1.00±0.00、2.01±0.04、4.17±0.14，各组间差异均有统计学意义（ F值分别为33.800、106.500， P值均< 0.01）。正常对照组与模型组、预处理模型组CD163 mRNA相对表达水平分别为1.00±0.00、0.85±0.01、0.65±0.01，各组间差异均有统计学意义（ F值分别为23.360、55.350， P值均< 0.01）。正常对照组与模型组、预处理模型组（F4/80 +CD86 +）百分比和（F4/80 +CD163 +）百分比分别为10.67%±0.91%和12.60%±1.67%、20.02%±1.29%和8.04%±0.76%、43.67%±2.71%和5.43%±0.47%，各组间差异均有统计学意义（ F值分别为11.130/8.379、39.250/13.190， P值均< 0.01）。正常对照组与模型组、预处理模型组肝损伤评分分别为0.22±0.08、1.32±0.36、2.17±0.26，各组间差异均有统计学意义（ F值分别为12.520、22.190， P值均< 0.01）。 结论:Ces1f可能是一个肝脏炎症抑制分子，其抑制效应的产生可能来自于该分子对KC极化表型稳态的维持。

目的:探索长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）LINC01133对人牙周膜干细胞（human periodontal ligament stem cells，hPDLSC）成牙骨质分化潜能的影响及其作用机制。方法:收集2021年9月至2022年1月第四军医大学口腔医学院口腔颌面外科17~30岁10例就诊患者因正畸需要或因阻生拔除的牙齿共12颗，从离体牙上提取hPDLSC，分别转染靶向LINC01133小干扰RNA（small interfering RNA-LINC01133，si-LINC01133）或阴性对照小干扰RNA（small interfering RNA-negative control，si-NC），以转染si-LINC01133为实验组，转染si-NC为阴性对照组。利用实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）检测si-LINC01133的沉默效率；通过蛋白质印迹法检测hPDLSC成牙骨质分化相关蛋白包括骨涎蛋白（bone sialoprotein，BSP）、牙骨质附着蛋白（cementum attachment protein，CAP）、牙骨质蛋白1（cementum protein-1，CEMP-1）的表达；利用流式细胞术和线粒体超氧化物指示剂MitoSOX检测细胞线粒体活性氧产量；通过JC-1荧光染色法检测线粒体膜电位水平；利用蛋白质印迹法检测线粒体呼吸链复合体蛋白包括NADH脱氢酶［泛醌］1β亚单位8（NADH dehydrogenase［ubiquinone］1 beta subcomplex subunit 8，NDUFB8）、琥珀酸脱氢酶亚单位A（succinate dehydrogenase complex flavoprotein subunit A，SDHA）、泛醌-细胞色素c还原酶核心蛋白1（ubiquinol-cytochrome c reductase core protein 1，UQCR1）、细胞色素c氧化酶亚单位4亚型1（cytochrome c oxidase subunit 4 isoform 1，COXⅣ）、ATP合成酶F1亚单位α（ATP synthase F1 subunit alpha，ATP5A）的表达水平。结果:hPDLSC的LINC01133表达水平被si-LINC01133有效沉默（阴性对照组：1.000±0.000，实验组：0.385±0.128）（ t=10.72， P<0.01），沉默效率超过60%。LINC01133沉默后，hPDLSC BSP表达水平显著下降（阴性对照组：1.000±0.000，实验组：0.664±0.179）（ t=4.62， P<0.01）；CAP表达水平显著下降（阴性对照组：1.000±0.000，实验组：0.736±0.229）（ t=2.83， P<0.05）。LINC01133沉默后，hPDLSC线粒体活性氧产量显著上升（阴性对照组：1.000±0.000，实验组：1.458±0.185） （t=4.96， P<0.05）；线粒体膜电位水平显著下降（阴性对照组：1.000±0.000，实验组：0.209±0.029）（ t=53.99， P<0.01）；NDUFB8表达水平显著上升（阴性对照组：1.000±0.000，实验组：1.683±0.397）（ t=3.45， P<0.05）；SDHA表达水平显著下降（阴性对照组：1.000±0.000，实验组：0.428±0.228）（ t=5.02， P<0.05）。实验组UQCR1、COXⅣ和ATP5A的表达水平与阴性对照组相比差异均无统计学意义（ P>0.05）。 结论:LINC01133可能通过调控hPDLSC线粒体功能，进而影响hPDLSC成牙骨质分化潜能。

目的:探讨无创性延迟肢体缺血预适应(NDLIP)是否通过抑制线粒体通透性转换孔(MPTP)的异常开放来发挥对脑缺血/再灌注(I/R)损伤的神经保护作用。方法:健康雄性Wistar大鼠按随机数字表法随机分为Sham组、I/R组、NDLIP组、NDLIP+Atr组和I/R+Atr组，每组12只。再灌注24 h后进行神经行为评分，2，3，5-三苯四唑氯化物(TTC)染色法测定脑梗死区域的面积。提取缺血半球皮层线粒体检测线粒体膜电位和呼吸链复合体Ⅰ、Ⅱ及Ⅳ的活性。蛋白质印迹法(Western blot)法检测大脑皮层中B细胞淋巴瘤/白血病-2相关X蛋白(bax)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(bcl-2)和半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶-3(Caspase-3)蛋白表达水平。组间比较采用单因素方差分析及事后多重比较LSD法。结果:NDLIP组神经行为评分低于I/R组[(1.17±0.41)分比(2.33±0.52)分，LSD- t＝－3.250， P<0.01]，脑梗死面积小于I/R组[(11.00±0.89)%比(17.67±1.03)%，LSD- t＝－9.110， P<0.01]，线粒体膜电位高于I/R组[(118.14±11.11)荧光强度比(67.84±5.51)荧光强度，LSD- t＝11.903， P<0.01]，线粒体复合体Ⅰ、Ⅱ及Ⅳ活性均高于I/R组[(6.05±0.07) μmol/min比(4.67±0.06) μmol/min，LSD- t＝9.106， P<0.01；(2.50±0.08) μmol/min比(1.99±0.05) μmol/min，LSD- t＝7.878， P<0.01；(11.10±0.12) μmol/min比(7.06±0.06) μmol/min，LSD- t＝19.881， P<0.01]，bax/bcl-2及Caspase-3蛋白表达均低于I/R组(2.45±0.68比10.50±0.80，LSD- t＝－13.864， P<0.01；0.42±0.07比0.68±0.08，LSD- t＝－4.600， P<0.01)。然而，NDLIP+Atr组神经行为评分高于NDLIP组[(2.00±1.10)分比(1.17±0.41)分，LSD- t＝2.321， P<0.05]，脑梗死面积大于NDLIP组[(17.67±1.21)%比(11.00±0.89)%，LSD- t＝9.110， P<0.01]，线粒体膜电位低于NDLIP组[(81.73±7.57)荧光强度比(118.14±11.11)荧光强度，LSD- t＝－8.616， P<0.05]，线粒体复合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ活性均低于NDLIP组[(4.52±0.54) μmol/min比(6.05±0.07) μmol/min，LSD- t＝－10.087， P<0.01；(2.01±0.15) μmol/min比(2.50±0.08) μmol/min，LSD- t＝－7.616， P<0.01；(6.88±0.72) μmol/min比(11.10±0.12) μmol/min，LSD- t＝－20.783， P<0.01]，bax/bcl-2及Caspase-3蛋白表达均高于NDLIP组(10.54±1.33比2.45±0.68，LSD- t＝13.935， P<0.01；0.67±0.14比0.42±0.07，LSD- t＝4.309， P<0.01)。 结论:NDLIP对大鼠脑I/R损伤的保护作用可能与抑制MPTP的异常开放有关。

目的:探讨谷氨酰胺对经烧伤大鼠血清（以下简称烧伤血清）干预的大鼠心肌细胞的作用及其细胞信号机制。方法:采用实验研究方法。取10只7~8个月龄雌雄各半Wistar大鼠制备正常大鼠血清（以下简称正常血清），另取20只7~8个月龄雌雄各半Wistar大鼠造成30%体表总面积Ⅲ度烧伤后制备烧伤血清，从180只1~3 d龄雌雄不拘Wistar大鼠心尖组织中分离培养原代心肌细胞用于后续实验。按随机数字表法（分组方法下同）将细胞分为正常血清组、烧伤血清组，加入相应血清培养。分别于培养1、3、6、9、12 h，采用锥虫蓝实验检测细胞存活率。将细胞分为单纯烧伤血清组、烧伤血清+4 mmol/L谷氨酰胺组、烧伤血清+8 mmol/L谷氨酰胺组、烧伤血清+12 mmol/L谷氨酰胺组、烧伤血清+16 mmol/L谷氨酰胺组、烧伤血清+20 mmol/L谷氨酰胺组，采用单纯烧伤血清或烧伤血清+相应终物质的量浓度谷氨酰胺处理，培养前实验筛选出的干预时间，同前检测细胞存活率。将细胞分为正常血清组、单纯烧伤血清组、烧伤血清+12 mmol/L谷氨酰胺组、烧伤血清+16 mmol/L谷氨酰胺组、烧伤血清+20 mmol/L谷氨酰胺组，同前处理后采用蛋白质印迹法检测培养30 min哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1（mTORC1）、p70核糖体蛋白S6激酶（p70 S6K）和真核翻译起始因子4E结合蛋白1（4E-BP1）磷酸化水平。将细胞分为正常血清组、单纯烧伤血清组、烧伤血清+12 mmol/L谷氨酰胺组、烧伤血清+12 mmol/L谷氨酰胺+25 ng/mL雷帕霉素组，行相应处理后，分别于培养1、3、6 h，采用免疫荧光法检测热休克蛋白70（HSP70）和金属硫蛋白（MT）表达并观测微管形态。各组各时间点各指标样本数均为10。对数据行析因设计方差分析、单因素方差分析、LSD- t检验、LSD检验及Bonferroni校正。 结果:培养1、3、6、9、12 h，烧伤血清组细胞存活率均明显低于正常血清组（ t=4.950、16.752、35.484、34.428、27.781， P<0.01）。与组内培养1 h比，烧伤血清组培养3、6、9、12 h细胞存活率明显降低（ P<0.05）；与组内培养3 h比较，烧伤血清组培养6、9、12 h细胞存活率明显降低（ P<0.05）；与组内培养6、9 h比较，烧伤血清组培养12 h细胞存活率明显降低（ P<0.05）；烧伤血清组培养6、9 h细胞存活率比较，差异无统计学意义（ P>0.05）。因此选择培养6 h作为后续烧伤血清干预时间。培养6 h，与单纯烧伤血清组比较，烧伤血清+4 mmol/L谷氨酰胺组、烧伤血清+8 mmol/L谷氨酰胺组、烧伤血清+12 mmol/L谷氨酰胺组、烧伤血清+16 mmol/L谷氨酰胺组、烧伤血清+20 mmol/L谷氨酰胺组细胞存活率均明显升高（ P<0.01）。烧伤血清+12 mmol/L谷氨酰胺组与烧伤血清+16 mmol/L谷氨酰胺组细胞存活率相近（ P>0.05），烧伤血清+16 mmol/L谷氨酰胺组与烧伤血清+20 mmol/L谷氨酰胺组细胞存活率相近（ P>0.05）。因此选择12、16、20 mmol/L作为后续谷氨酰胺的干预浓度。培养30 min，正常血清组、单纯烧伤血清组、烧伤血清+12 mmol/L谷氨酰胺组、烧伤血清+16 mmol/L谷氨酰胺组、烧伤血清+20 mmol/L谷氨酰胺组细胞mTORC1、p70 S6K、4E-BP1磷酸化水平分别为1.001±0.042、0.510±0.024、0.876±0.022、0.836±0.074、0.856±0.041，1.00±0.11、0.38±0.09、0.95±0.13、0.96±0.13、0.89±0.24，1.00±0.07、0.29±0.08、0.87±0.27、0.68±0.08、0.60±0.21。与正常血清组比较，其余4个烧伤血清组细胞mTORC1、p70 S6K、4E-BP1磷酸化水平均明显降低（ P<0.01） 。与单纯烧伤血清组比较，其余3个烧伤血清组细胞mTORC1、p70 S6K、4E-BP1磷酸化水平均明显升高（ P<0.01）。烧伤血清+12 mmol/L谷氨酰胺组细胞4E-BP1磷酸化水平明显高于烧伤血清+16 mmol/L谷氨酰胺组和烧伤血清+20 mmol/L谷氨酰胺组（ P<0.05）。单纯烧伤血清组细胞培养1 h MT表达明显低于正常血清组（ P<0.05），其余时间点MT表达明显高于正常血清组（ P<0.01）；培养1、3、6 h，单纯烧伤血清组细胞HSP70表达明显高于正常血清组（ P<0.05），烧伤血清+12 mmol/L谷氨酰胺组细胞HSP70和MT表达均明显高于单纯烧伤血清组（ P<0.05），烧伤血清+12 mmol/L谷氨酰胺+25 ng/mL雷帕霉素组细胞HSP70和MT表达均明显低于烧伤血清+12 mmol/L谷氨酰胺组（ P<0.01）。正常血清组细胞培养1、3、6 h微管结构完整，呈网格排列，染色均匀。单纯烧伤血清组细胞培养1 h部分微管出现断裂，部分网格排列不齐；培养3 h靠近细胞核微管结构清晰，细胞核远端微管模糊不清；培养6 h微管结构模糊不清。烧伤血清+12 mmol/L谷氨酰胺组细胞培养各时间点微管破坏程度较单纯烧伤血清组轻。烧伤血清+12 mmol/L谷氨酰胺+25 ng/mL雷帕霉素组细胞培养各时间点微管形态与单纯烧伤血清组相近。 结论:烧伤血清可导致大鼠心肌细胞受损，细胞存活率明显下降。谷氨酰胺通过调控mTOR/p70 S6K/4E-BP1信号通路，促进心肌细胞HSP70和MT表达，稳定微管结构，从而发挥其细胞保护作用。

目的:探讨携带泛素化修饰丁型肝炎抗原(hepatitis D antigen, HDAg)的树突状细胞来源的胞外体(dendritic cell derived exosomes，Dexs)在诱导特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)反应中的作用及其分子机制。方法:提取并诱导C57BL/6小鼠髓源性树突状细胞(dendritic cell，DC)后与Ub-S-HDAg-Dexs共孵育48 h，流式细胞仪检测表面分子[CD86、CD80、主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)Ⅱ]的表达水平。提取C57BL/6小鼠脾源性T淋巴细胞与经胞外体刺激的DC共孵育后共培养72 h，分为Ub-S-HDAg-Dexs组(加入50 μg/mL Ub-S-HDAg-Dexs)、Blank-Dexs组(加入50 μg/mL无质粒转染的DC来源胞外体)、Con-Dexs组(加入50 μg/mL经空白慢病毒转染的DC来源胞外体)、PBS组[加入50 μL/mL磷酸盐缓冲液(phosphate-buffered saline，PBS)]、Ub-S-HDAg-Dexs+AG490组(加入50 μg/mL Ub-S-HDAg-Dexs，经胞外体刺激的DC与T淋巴细胞混合时同时加入50 μmol/L AG490)，流式细胞术检测CD8与γ干扰素双阳性T细胞，非放射性乳酸脱氢酶检测试剂盒检测CTL细胞的杀伤活性。采用实时定量聚合酶链反应和蛋白质印迹法分别检测T淋巴细胞中Jak激酶(Janus kinase, JAK)2、GATA结合蛋白3(GATA-binding protein 3，GATA3)、T-bet、信号转导及转录激活因子(signal transduction and activator of transcription，STAT)1、STAT4的mRNA和蛋白质表达水平。统计学分析采用独立样本 t检验。 结果:经Ub-S-HDAg-Dexs刺激，DC表面分子CD80、CD86、MHCⅡ阳性率为83.850%±0.219%、68.910%±0.134%、84.320%±0.445%。在Ub-S-HDAg-Dexs组，γ干扰素和CD8双阳性率为6.420%±0.028%, 高于PBS组、Blank-Dexs组、Con-Dexs组、Ub-S-HDAg-Dexs+AG490组( t＝90.78、30.32、63.06、85.42，均 P<0.001)；细胞杀伤率为82.4%±3.9%，高于PBS组、Blank-Dexs组、Con-Dexs组、Ub-S-HDAg-Dexs+AG490组( t＝17.28、9.74、3.95、15.89，均 P<0.050)。Ub-S-HDAg-Dexs组JAK2、T-bet、STAT1、STAT4 mRNA相对表达量分别与Con-Dexs组( t＝10.74、32.34、13.00、16.28，均 P<0.001)、Blank-Dexs组( t＝15.05、21.51、6.46、13.12，均 P<0.050)、PBS组( t＝21.83、41.42、7.30、17.50，均 P<0.050)、Ub-S-HDAg-Dexs+AG490组( t＝35.75、20.69、17.02、17.07，均 P<0.001)相比，差异均有统计学意义。Ub-S-HDAg-Dexs组T-bet、STAT1、STAT4蛋白质表达水平高于PBS组，差异均有统计学意义( t＝346.70、57.54、55.81，均 P<0.001)。Ub-S-HDAg-Dexs组加入AG490后，T-bet、STAT1、STAT4的蛋白质表达水平均较Ub-S-HDAg-Dexs组下降，差异均有统计学意义( t＝355.40、52.79、126.10，均 P<0.001)。 结论:胞外体转运泛素化修饰的HDAg能有效促进DC成熟，诱导T淋巴细胞分化，产生特异性CTL反应，为丁型肝炎免疫治疗提供新的思路。

目的:探讨甘氨酸对经烧伤大鼠血清（以下简称烧伤血清）干预的大鼠心肌细胞的作用及其机制。方法:采用实验研究方法。取30只7~8周龄雌雄各半Wistar大鼠，其中10只用于制备正常大鼠血清（以下简称正常血清），将另20只造成30%体表总面积Ⅲ度烧伤后制备烧伤血清；从180只1~3 d龄雌雄不拘Wistar大鼠心尖组织中分离培养原代心肌细胞用于后续实验。按随机数字表法（分组方法下同）将细胞分为用相应血清处理的正常血清组、烧伤血清组，于处理1、3、6、9、12 h进行锥虫蓝染色检测细胞存活率；将细胞分为用烧伤血清处理6 h后常规培养30 min的单纯烧伤血清组和用烧伤血清处理6 h后加相应终物质的量浓度甘氨酸培养30 min的0.4 mmol/L甘氨酸组、0.8 mmol/L甘氨酸组、1.2 mmol/L甘氨酸组、1.6 mmol/L甘氨酸组、2.0 mmol/L甘氨酸组，即干预6.5 h，同前检测细胞存活率。将细胞分为正常血清组、单纯烧伤血清组、0.8 mmol/L甘氨酸组、1.2 mmol/L甘氨酸组、1.6 mmol/L甘氨酸组，分别同前干预6.5 h，采用高效液相色谱法检测腺苷一磷酸（AMP）和ATP含量并计算AMP/ATP比值，采用蛋白质印迹法检测磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1（p-mTORC1）、磷酸化p70核糖体蛋白S6激酶（p-p70 S6K）、磷酸化真核翻译起始因子4E结合蛋白1（p-4E-BP1）、磷酸化AMP活化蛋白激酶（p-AMPK）蛋白表达。将细胞分为同前干预的正常血清组、单纯烧伤血清组、0.8 mmol/L甘氨酸组和用烧伤血清处理后加2种试剂培养的0.8 mmol/L甘氨酸+25 ng/mL雷帕霉素组，于处理1、3、6 h行相应培养30 min，即干预1.5、3.5、6.5 h，采用免疫荧光法检测热休克蛋白70（HSP70）、金属硫蛋白（MT）和微管蛋白表达并观察干预6.5 h微管形态。各时间点样本数均为10。对数据行析因设计方差分析、单因素方差分析、LSD- t检验、LSD检验及Bonferroni校正。 结果:处理1、3、6、9、12 h，烧伤血清组细胞存活率均明显低于正常血清组（ t值分别为4.96、16.83、35.51、34.33、27.88， P<0.05）。在烧伤血清组中，处理3、6、9、12 h细胞存活率均较处理1 h明显降低（ P<0.05），处理6、9、12 h细胞存活率均较处理3 h明显降低（ P<0.05），处理6 h细胞存活率与处理9 h相近（ P>0.05）但明显高于处理12 h（ P<0.05）；选择处理6 h作为后续烧伤血清干预时间。干预6.5 h，与单纯烧伤血清组比较，各甘氨酸组细胞存活率均明显升高（ P<0.05）。0.8 mmol/L甘氨酸组细胞存活率最高，选择0.8、1.2、1.6 mmol/L作为后续甘氨酸的干预浓度。干预6.5 h，单纯烧伤血清组细胞AMP/ATP比值较正常血清组、1.2 mmol/L甘氨酸组、1.6 mmol/L甘氨酸组明显升高（ P值均<0.05），1.6 mmol/L甘氨酸组细胞AMP/ATP比值较0.8 mmol/L甘氨酸组明显降低（ P<0.05）。干预6.5 h，正常血清组、单纯烧伤血清组、0.8 mmol/L 甘氨酸组、1.2 mmol/L 甘氨酸组、1.6 mmol/L甘氨酸组细胞p-mTORC1、p-p70 S6K、p-4E-BP1蛋白表达水平分别为1.001±0.037、0.368±0.020、1.153±0.019、1.128±0.062、1.028±0.037，0.96±0.07、0.63±0.12、1.17±0.13、1.13±0.16、1.11±0.11，0.98±0.06、0.45±0.08、1.13±0.05、0.77±0.12、0.51±0.13。与单纯烧伤血清组比较，正常血清组与各甘氨酸组细胞p-mTORC1、p-p70 S6K和p-4E-BP1蛋白表达均明显升高（ P<0.05），p-AMPK蛋白表达均明显降低（ P<0.05）；与0.8 mmol/L甘氨酸组比较，1.2 mmol/L甘氨酸组细胞p-4E-BP1蛋白表达以及1.6 mmol/L甘氨酸组细胞p-mTORC1与p-4E-BP1蛋白表达均明显降低（ P<0.05）；与1.2 mmol/L甘氨酸组比较，1.6 mmol/L甘氨酸组细胞p-mTORC1、p-4E-BP1蛋白表达均明显降低（ P<0.05），p-AMPK蛋白表达明显升高（ P<0.05）。与正常血清组比较，单纯烧伤血清组细胞干预1.5、3.5、6.5 h微管蛋白表达均明显降低（ P<0.05），干预1.5、3.5 h HSP70表达和干预3.5、6.5 h MT表达均明显升高（ P<0.05）；单纯烧伤血清组与0.8 mmol/L甘氨酸+25 ng/mL雷帕霉素组细胞干预1.5、3.5、6.5 h HSP70、MT表达以及干预1.5、3.5 h微管蛋白表达均明显低于0.8 mmol/L甘氨酸组（ P<0.05）。干预6.5 h，与正常血清组比较，单纯烧伤血清组细胞微管结构紊乱；0.8 mmol/L甘氨酸组细胞边界较单纯烧伤血清组清晰，微管结构近核部位排列整齐；与0.8 mmol/L甘氨酸组比较，0.8 mmol/L甘氨酸+25 ng/mL雷帕霉素组细胞边界不清，微管结构紊乱。 结论:烧伤血清可导致大鼠心肌细胞受损，甘氨酸可通过AMP活化蛋白激酶显著上调哺乳动物雷帕霉素靶蛋白/p70核糖体蛋白S6激酶/真核翻译起始因子4E结合蛋白1信号通路，促进心肌细胞保护性蛋白HSP70、MT和微管蛋白合成，稳定微管结构，实现心肌细胞保护作用。

目的:比较5种充填用流动性复合树脂的耐磨性能，为临床选择适用于 力承担区直接充填治疗的流动性复合树脂提供参考。 方法:以可压实复合树脂（Majesty）为对照组，选用5种充填用流动性复合树脂（A组：Filtex 350 XT Flow；B组：Beautifil Flowable Plus；C组：Clearfil Majesty LV2；D组：Unifil LoFlo Plus；E组：Sonic Fill组）为研究对象，每组材料制备6个半球形试件。在微摩擦磨损实验机下，树脂试件垂直加载20 N，与牛牙釉质往复对磨1万次后测量球头磨斑直径并在扫描电镜下观察磨斑微观形貌。采用单因素方差分析比较各组磨斑直径差异。结果:对照组、A、B组磨斑直径［分别为（1 033±43）、（1 068±48）、（1 237±86） μm］差异无统计学意义（ P>0.05），C、D、E组磨斑直径［分别为（1 550±150）、（1 384±222）、（1 525±81） μm ］均显著大于对照组和A组（ P<0.05）。扫描电镜显示，对照组、A、B组填料粒度范围较大，磨耗面可见填料的碎裂和局部缺损；C、D、E组填料颗粒较小，并可见多处整块填料脱落的痕迹。 结论:填料粒度范围大的流动性复合树脂的耐磨性能与可压实复合树脂相当，有望用于 力承担区直接充填治疗。

目的:采用分子对接法筛选酪氨酸蛋白激酶受体B2（EphB2）小分子抑制剂，研究其对皮肤鳞状细胞癌（CSCC）的影响及可能机制。方法:利用Schrodinger对接工具预测EphB2蛋白的三维结构及其配体结合位点，通过分子对接进行高通量虚拟筛选EphB2抑制剂，通过体内外实验验证筛出的EphB2抑制剂山奈苷与芦荟大黄素（AE）抗CSCC的作用及机制。体外实验中，将人CSCC细胞系A431、SCL-1及人永生化表皮细胞HaCaT分别分为空白对照组、二甲基亚砜组、AE组与山奈苷组，通过MTT实验（AE浓度：20、40、80、160 μmol/L；山奈苷浓度：12.5、25、50、100 μmol/L）、划痕实验及Transwell小室实验（AE浓度：80 μmol/L，山奈苷浓度：50 μmol/L）分析EphB2抑制剂对CSCC细胞增殖、迁移、侵袭的影响。体内实验中，SPF级BALB/c雌性裸鼠皮下注射0.2 ml A431细胞悬液，待成功长出瘤体以后，随机分为4组（ n = 6），空白对照组、二甲基亚砜组、AE组（腹腔注射AE 20 mg·kg -1·d -1 AE）与山奈苷组（腹腔注射山奈苷25 mg·kg -1·d -1）；每周测量裸鼠的肿瘤大小和体重；连续给药28 d后，剥取裸鼠移植瘤进行HE染色，qRT-PCR与Western blot分析AE和山奈苷对裸鼠移植瘤中上皮钙黏着蛋白、波形蛋白、磷酸化葡萄糖合成激酶3β（p-GSK-3β）、β联蛋白及GSK-3β表达的影响。组间比较采用单因素方差分析及 t检验。 结果:筛选出对EphB2具有较高抑制活性的两个小分子化合物AA-504/20999031（山奈苷）和AA-466/21162055（AE）。MTT实验结果表明，与HaCaT细胞相比，AE对SCL-1和A431细胞具有强烈的细胞毒性，且随AE浓度升高毒性变强（ F = 17.95， P<0.001），作用48 h时，IC50分别为124.59 μmol/L和80.85 μmol/L；山奈苷对SCL-1和A431细胞具有强烈的细胞毒性，且随山奈苷浓度升高毒性变强（ F = 11.34， P<0.001），作用48 h时，IC50分别为119.64 μmol/L和64.96 μmol/L。划痕实验显示，与二甲基亚砜组细胞迁移距离（88.1±1.4） μm相比，AE组和山奈苷组A431细胞迁移距离[（36.7±1.0） μm和（44.7 ± 3.5） μm]显著缩短（ F = 52.34， P < 0.001），而HaCaT细胞迁移距离差异无统计学意义（ F = 1.73， P = 0.238）。Transwell小室实验表明，与二甲基亚砜组A431细胞跨膜细胞数量（195.3 ± 5.7）相比，AE组和山奈苷组A431细胞显著抑制（145.0 ± 2.5和94.7 ± 4.1， F = 72.85， P < 0.001），而对HaCaT细胞则无明显抑制作用（ F = 3.91， P = 0.055）。动物实验表明，与二甲基亚砜组裸鼠移植瘤体积（841.88 ± 84.63） mm 3相比，AE组和山奈苷组显著下降[（407.42 ± 70.37） mm 3与（368.77 ± 62.7） mm 3， F = 73.78， P < 0.001]。HE染色证实，AE和山奈苷干预可改善其病理变化。qRT-PCR与Western印迹结果显示，AE和山奈苷明显上调瘤体组织中上皮钙黏着蛋白与p-GSK-3β mRNA和蛋白表达水平（均 P < 0.001），下调波形蛋白、β联蛋白及GSK-3β mRNA和蛋白表达水平（均 P < 0.001）。 结论:分子对接筛选的小分子抑制剂与EphB2可形成稳定复合物，并通过影响Wnt/β联蛋白通路诱导的上皮间质转化现象来抑制CSCC进程。

目的:探究BHLHE40能否通过靶向高迁移率族蛋白A2（HMGA2）激活氧化磷酸化（OXPHOS）通路进而影响甲状腺癌细胞对顺铂的敏感性。方法:通过在线数据库TCGA-甲状腺癌和hTFtarget分析HMGA2及上游转录因子BHLHE40在甲状腺癌组织中的mRNA表达情况。采用脂质体转染法将si-HMGA2、oe-HMGA2、oe-BHLHE40以及阴性对照si-NC、oe-NC转染至甲状腺癌细胞K1和SW579中，通过实时荧光定量PCR检测BHLHE40和HMGA2在甲状腺癌细胞SW579、FTC-133、K1和正常甲状腺细胞Nthy ori3-1中的mRNA表达水平，采用MTT法检测细胞活力，CCK-8法计算顺铂半抑制浓度（IC 50）值，流式细胞术检测细胞凋亡水平，蛋白质印迹法检测OXPHOS复合体的表达，Seahorse XFe 96分析细胞的耗氧率。双荧光素酶报告实验和染色质免疫沉淀实验分析BHLHE40与HMGA2的结合关系。 结果:TCGA数据库结果表明，HMGA2和BHLHE40 mRNA在甲状腺癌组织中的表达（10.57±2.58、13.89±1.13）均较甲状腺正常组织高（4.82±1.69、12.28±1.01），差异均具有统计学意义（ t=16.69， P<0.001； t=10.43， P<0.001）。实时荧光定量PCR结果发现，正常甲状腺细胞Nthy ori3-1、甲状腺癌细胞SW579、FTC-133和K1中HMGA2 mRNA相对表达量分别为1.00±0.13、2.94±0.23、4.71±0.41和6.29±0.49，BHLHE40 mRNA相对表达量分别为1.00±0.12、2.60±0.23、3.39±0.35和6.18±0.51，差异均具有统计学意义（ F=130.50， P<0.001； F=125.20， P<0.001）。进一步两两比较发现，与正常甲状腺细胞相比，甲状腺癌细胞中HMGA2和BHLHE40 mRNA的表达水平均显著升高（均 P<0.001）。MTT法检测显示，与si-NC组相比，si-HMGA2处理显著降低了K1细胞的细胞活力（均 P<0.05），oe-HMGA2处理相对于oe-NC组显著增加了SW579细胞的细胞活力（均 P<0.05）；与oe-NC+DMSO组相比，oe-HMGA2+DMSO组SW579细胞的细胞活力增强，而OXPHOS通路抑制剂Gboxin能够逆转过表达HMGA2对细胞活力的影响（均 P<0.05）。流式细胞术和CCK-8实验结果显示，与si-NC组（凋亡水平：6.19%±0.28%；顺铂IC 50值：17.47 μmol/L）相比，敲低HMGA2能增加K1细胞的凋亡水平（11.96%±0.32%； t=19.17， P<0.001）和顺铂敏感性（IC 50值：1.49 μmol/L）；与oe-NC组（凋亡水平：9.98%±0.32%；顺铂IC 50值：8.17 μmol/L）相比，过表达HMGA2显著降低了SW579细胞凋亡水平（4.32%±0.25%； t=19.65， P<0.001）和顺铂敏感性（IC 50值：34.95 μmol/L）。双荧光素酶报告实验结果发现，与si-NC组相比，在人肾上皮细胞293T细胞中敲低BHLHE40的表达显著降低野生型HMGA2的荧光素酶活性（0.31±0.02比1.00±0.11； t=10.69， P=0.004），但对于突变型HMGA2的荧光素酶活性没有显著性影响（1.06±0.11比1.00±0.07； t=0.80， P=0.470）。染色质免疫沉淀实验结果显示，与IgG组（1.00±0.10）相比，anti-BHLHE40组K1细胞的HMGA2 mRNA表达水平显著增加（6.57±0.62； t=15.36， P<0.001）。与oe-NC+DMSO组相比，oe-HMGA2+DMSO组SW579细胞凋亡水平（ P<0.05）和顺铂敏感性均降低，OXPHOS复合体Ⅰ~Ⅴ表达显著增强，细胞耗氧率升高（均 P<0.05），oe-HMGA2+Gboxin处理可逆转过表达HMGA2的影响（均 P<0.05）。回复实验表明，与oe-NC+si-NC组相比，过表达BHLHE40后SW579细胞的细胞活力和OXPHOS复合体Ⅰ~Ⅴ的表达增强，细胞耗氧率和顺铂IC 50值显著增加，细胞凋亡水平下降（均 P<0.05）；而同时敲低HMGA2可逆转过表达BHLHE40的影响（均 P<0.05）。 结论:BHLHE40可通过靶向调控HMGA2的表达激活氧化磷酸化通路，进而影响甲状腺癌细胞对顺铂的敏感性。