目的:通过两步脱溶剂-交联法制备携带流感病毒血凝素茎部α螺旋区(HAα)、6个串联重复的M2蛋白胞外域(6M2e)和鞭毛蛋白(Flg)的双层蛋白质纳米颗粒，探究其在小鼠体内的免疫效果。方法:采用脱溶剂-交联法将融合蛋白FljB-6M2e-△D2D3-HAα和HAα-6M2e制备成双层蛋白质纳米颗粒。通过透射电镜和纳米颗粒跟踪分析仪进行物理表征后评估其细胞毒性。免疫小鼠后采用ELISA方法进行特异性抗体效价测定，ELISPOT检测细胞免疫水平，CCK-8法检测脾细胞的增殖情况。结果:本研究成功制备了粒径为（130.03±2.96） nm的双层蛋白质纳米颗粒FljB-6M2e-△D2D3-HAα/ HAα-6M2e。免疫小鼠后产生的抗M2e-IgG抗体效价为1∶25 600，抗HAα-IgG抗体效价为1∶12 800，高于对照组小鼠，差异均具有统计学意义（ t=3.051和3.780， P=0.038和0.019）。与对照组相比，多肽刺激可以使小鼠脾细胞显著增殖[M2e刺激增殖率：（154.18±2.34）%，HAα刺激增殖率：（151.51±1.56）%]（ t=12.942和24.591， P均<0.001），并且诱导产生分泌更多IL-4和IFN-γ的淋巴细胞（M2e刺激： t=5.477和6.571， P=0.005和0.013；HAα刺激： t=9.239和7.671， P=0.001和0.013）。多种细胞因子的mRNA水平显著升高，IFN-γ和IL-4的转录水平均高于对照组（IFN-γ： t=13.253和20.847， P均<0.001；IL-4 ： t=6.032和4.824， P=0.004和0.009)。 结论:本研究所制备的双层蛋白质纳米颗粒可以刺激小鼠产生较高水平的体液和细胞免疫应答，为开发多表位流感通用疫苗提供了有效依据。

目的:制备前蛋白转换酶枯草溶菌素9(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9, PCSK9）纳米疫苗，并初步探讨树突状细胞（dendritic cells, DC 2.4）对纳米疫苗的体外吞噬效率。方法:选取PCSK9 207-223为抗原肽，牛血清白蛋白（bovine se-rum albumin, BSA）为载体蛋白，用"还原-热聚-氧化"法将BSA分子转变为BSA纳米颗粒（BSA nanoparticle, BN），PCSK9多肽链接在BN表面合成纳米疫苗（BSA-PCSK9 nanoparticle, BPN），PCSK9多肽与分子BSA直接链接合成分子疫苗（BSA-PCSK9, BP）。动态光散射测定BN、BPN粒径和电位大小，透射电子显微镜观察形貌；SDS-PAGE电泳分析抗原负载情况；检测BPN不同时间点的粒径变化反映其在生理环境下的稳定性；BPN与DC 2.4细胞共孵育24 h，增强型细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8, CCK8）检测DC2.4细胞活性，反映BPN生物相容性；流式细胞仪检测DC 2.4对纳米疫苗的吞噬情况。 结果:合成的BPN粒径为（68.2± 3.1）nm、电位为（?14.8±0.6）mV，透射电子显微镜观察显示BPN近球形；SDS-PAGE电泳结果显示BPN相对分子质量增加，证明短肽链接成功；模拟生理环境下，BPN粒径在144 h内保持稳定；增强型CCK8检测结果显示DC2.4细胞活性均大于100%；流式细胞仪检测结果显示，相比BP，DC 2.4对BPN的吞噬效率更高。结论:BPN体外稳定性及生物相容性好，易于被DC吞噬。

目的:制备心肌特异性多肽（PCM）修饰介孔硅纳米粒（MSN）包载精氨酸（LA）的纳米颗粒（PCM-MSN@LA），评价其对脓毒症心肌的特异性保护作用。方法:通过缩合反应制备PCM-MSN@LA，检测PCM-MSN@LA表征、LA修饰量和释放量，观察PCM-MSN@LA的细胞吞噬行为及其对组织的亲和力。①实验一：将SD乳鼠原代心肌细胞分为正常对照组（Con组）、脂多糖（LPS）组、精氨酸纳米粒组（MSN@LA/LPS组）、心肌靶向精氨酸纳米粒组（PCM-MSN@LA/LPS组）。LPS组用5 mg/L LPS刺激细胞16 h；MSN@LA/LPS组和PCM-MSN@LA/LPS组分别用含25 mg/L LA的MSN@LA及PCM-MSN@LA与LPS共同刺激细胞16 h。测定细胞活性和活性氧（ROS）产生水平；用原位末端缺刻标记法（TUNEL）检测细胞凋亡情况；用蛋白质免疫印迹试验（Western Blot）检测内皮型一氧化氮合酶（eNOS）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）蛋白表达。②实验二：按照随机数字表法将64只健康雄性C57BL/6小鼠分为假手术组（Sham组）、LPS组、MSN@LA/LPS组和PCM-MSN@LA/LPS组，每组16只。LPS组腹腔注射50 mg/kg LPS；MSN@LA/LPS组和PCM-MSN@LA/LPS组腹腔注射LPS后立即经尾静脉分别注射0.5 mg/kg的MSN@LA及PCM-MSN@LA。每组8只小鼠用于观察24 h存活情况；另外8只于术后12 h用超声心动图评价心功能，用实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）测定心肌组织白细胞介素（IL-1、IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的mRNA表达。结果:PCM-MSN@LA呈球形，粒径约180 nm，Zeta电位约-21 mV，且可负载LA，LA修饰量及释放率分别为12.3%、24.3%，细胞吞噬实验显示PCM-MSN@LA具有心肌细胞和心肌组织靶向性。实验一：LPS刺激后心肌细胞活性下降，ROS生成增多，凋亡增多，eNOS及iNOS蛋白表达增多。与LPS组比较，MSN@LA/LPS组和PCM-MSN@LA/LPS组细胞活性增高，ROS及凋亡减少，eNOS、iNOS表达增多；且PCM-MSN@LA/LPS组较MSN@LA/LPS组可进一步提高细胞活性，减少ROS产生和细胞凋亡，增加eNOS、iNOS蛋白表达〔细胞活性（ A值）：0.51±0.08比0.41±0.03，ROS水平（相对荧光强度）：28 450±1 941比35 628±2 551，凋亡细胞/总细胞数：0.27±0.03比0.35±0.04，eNOS/β-Tubulin：1.467±0.046比1.201±0.131，iNOS/β-Tubulin：1.700±0.033比1.577±0.068，均 P<0.05〕。实验二：MSN@LA/LPS组和PCM-MSN@LA/LPS组术后24 h存活动物数多于LPS组（只：2、4比1， P值分别为0.36、0.03）。与Sham组比较，LPS组小鼠心功能明显下降，心肌组织炎性因子mRNA表达增多。与LPS组比较，PCM-MSN@LA/LPS组左室射血分数（LVEF）、左室短轴缩短率（LVFS）明显升高，IL-1、IL-6、TNF-α的mRNA表达明显下降〔LVEF：0.456±0.019比0.337±0.017，LVFS：（21.97±1.78）%比（15.53±1.67）%，IL-1 mRNA（2 -ΔΔCT）：169.22±8.95比189.79±6.79，IL-6 mRNA（2 -ΔΔCT）：19.90±1.60比23.74±1.45，TNF-α mRNA（2 -ΔΔCT）：8.21±0.81比11.00±1.48，均 P<0.05〕；而MSN@LA/LPS组与LPS组各指标比较差异无统计学意义。 结论:PCM-MSN@LA具有心肌靶向性，可显著提高心肌细胞活性，下调炎性因子表达，减少ROS产生，减轻脓毒症心功能不全，从而实现脓毒症心肌损伤的靶向治疗。

目的 设计并制备mRNA-多肽-泊洛沙胺纳米颗粒(mRNA peptide polymer ternary complex,mRNA-PPTC),考察其理化特性、体外和体内呼吸道组织相关细胞递送效率、免疫后小鼠特异性抗体诱导能力.方法 通过体外转录分别制备编码萤火虫荧光素酶(firefly luciferase,F-luc)、增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)和新冠病毒受体结合域蛋白(receptor binding domain,RBD)的mRNA,利用动态光散射法检测mRNA-PPTC的粒径、多分散系数、Zeta电位.通过透射电镜观察纳米颗粒形态.将F-luc mRNA-PPTC及对照组制剂分别转染至人支气管上皮细胞(16 human bronchial epithelial cell,16HBE)、鼠源树突状细胞(dendritic cell 2.4,DC2.4)、鼠源巨噬细胞(mouse leukemia cells of monocyte macrophage,RAW264.7),检测荧光素酶报告基因转染效率和细胞活性;将EGFP mRNA-PPTC及对照组制剂转染至16HBE细胞,使用荧光显微镜观察EGFP表达情况.利用活体成像技术考察F-luc mRNA-PPTC在小鼠呼吸道的转染效率.选用编码RBD蛋白的mRNA作为疫苗抗原模型,通过酶联免疫吸附实验检测免疫后小鼠血清中抗原特异性免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)和支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中抗原特异性分泌型免疫球蛋白A(secretory immunoglobulin A,sIgA)水平.结果 成功制备粒径约100 nm近球形且均一稳定的弱阳离子mRNA-PPTC纳米颗粒;mRNA-PPTC能有效转染16HBE、DC2.4、RAW264.7细胞,与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01),并且细胞毒性较低;mRNA-PPTC通过滴鼻免疫后,在小鼠鼻部和肺组织中检测到F-luc报告基因的有效表达,与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01);在初免后第28天的小鼠血清和BALF样品中,能分别检测到高效价的RBD抗原特异性IgG和sIgA,与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01,P＜0.05).结论mRNA-PPTC纳米颗粒有良好的体外mRNA递送能力且细胞毒性较低;滴鼻给药后在小鼠上下呼吸道均能高效表达目的基因;小鼠滴鼻免疫后能产生高水平的抗原特异性血清IgG和支气管肺泡灌洗液sIgA.

目的 以羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖(HACC)和三聚磷酸钠(TPP)为载体,制备载有细粒棘球绦虫表位多肽FL46的纳米颗粒(NPs),筛选最优制备条件,对包封效果及形态表征进行评价.方法 采用离子交联法,将FL46溶液缓慢滴加到HACC溶液中,以800 r/min转速搅拌并逐滴加入TPP溶液,制备FL46-HACC-NPs混悬液.使用纳米粒度电位仪检测平均粒径、多分散系数(PDI)和表明电位(Zeta),透射电子显微镜下观察其微观形态,二辛可宁酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒计算包封率.以HACC浓度(0.25、0.50、0.75、1.00 mg/ml)、TPP浓度(0.25、0.50、0.75、1.00 mg/ml)、HACC 与 TPP 质量比(8∶1、9∶1、10∶1、11∶1)进行三因素四水平正交实验,单因素法考察对FL46-HACC-NPs表征的影响.结果 不同的HACC和TPP质量浓度及质量比下,FL46-HACC-NPs溶液可呈澄清、乳光、沉淀状态.经单因素实验,以粒径小、包封率高为筛选条件,筛选出的最优制备条件为HACC浓度0.25 mg/ml,TPP浓度0.50 mg/ml,HACC与TPP的质量比9:1.最优条件下可制备类球形或多边形FL46-HACC-NPs,粒径为(307.37±2.17)nm,PDI为(0.228±0.008),Zeta 电位为(29.77±0.46)mV,包封率为(75.95±1.60)％.透射电镜下显示,FL46-HACC-NPs形态结构大小均匀,呈类球形或多边形.结论 离子交联法可有效制备出优化的FL46-HACC-NPs,为细粒棘球绦虫多肽疫苗保护效果的研究提供基础.

目的·评估胆固醇酯转移蛋白(CETP)纳米疫苗是否能提高CETP半抗原免疫原性,并初步探讨其抗兔动脉粥样硬化的可行性.方法· 采用Fmoc法合成巯基修饰的CETP多肽;用交联剂Sulfo-SMCC将CETP多肽分别与载体蛋白——卵清蛋白(OVA)分子、OVA纳米颗粒链接;免疫新西兰大白兔,检测实验兔血清的抗体、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的浓度.设PBS对照组(n=3)、传统疫苗组(n=3)、纳米疫苗组(n=3),进行各组间比较.结果·动态光散射粒度仪结果显示纳米疫苗粒径约70 nm, zeta电位约-8.81 mV,透射电子显微镜观察结果显示纳米疫苗近似球形;紫外分光光度计检测结果显示终产物最大吸收峰发生偏移,SDS-PAGE结果显示终产物相对分子质量增加,皆证明抗原负载成功; ELISA结果显示自第3周开始纳米疫苗组的D(450 nm)明显高于传统疫苗组.结论·该纳米疫苗可以提高CETP半抗原的免疫原性,激发实验兔产生更高的抗体.

目的 探讨RGD-GGG-K18多肽与融合双表达质粒pIRES2-3×E7-HSP110-EGFP自组装纳米颗粒的抗肿瘤效果.方法 化学合成带有正电荷的RGD-GGG-K18多肽,以富含正电荷的RGD-GGG-K18多肽与质粒pIRES2-3×E7-HSP1 10-EGFP通过静电引力作用自我组装形成纳米颗粒.凝胶阻滞实验、透射电镜、DNaseⅠ保护实验和Western blot等方法对纳米颗粒进行鉴定.通过流式细胞术、体外特异性细胞毒释放实验分析疫苗诱导的免疫应答和其介导的CTL毒性效应.以TC-1细胞构建预防性及治疗性肿瘤模型,观察纳米颗粒疫苗在动物体内的抗肿瘤效应.结果 成功构建了RGD-GGG-K18/pIRES2-3×E7-HSP110-EGFP纳米颗粒疫苗,确定最佳多肽/DNA电荷比r=2.0;当r=2.0时所制备的颗粒,大小均一,类圆形,绝大部分直径分布于50 nm左右.该纳米颗粒可将hHSP110基因导入肿瘤细胞,并在体外和体内均很大程度上提高了抗原表位特异性的免疫原性,诱导T淋巴细胞增殖,显著增强抗原特异性CTL应答及其产生的细胞毒效应.该纳米颗粒疫苗显著抑制了小鼠的肿瘤生长,延长其存活时间.结论 RGD-GGG-K18/pIRES2-3×E7-HSP 110-EGFP纳米颗粒疫能有效抑制宫颈癌的发生和发展.

目的 探讨双靶向多肽CSNRDARRC-PCL-PGA/TPGS同时负载紫杉醇的纳米颗粒(多肽紫杉醇 NP)对膀胱癌 RT112细胞的生长抑制及促凋亡作用. 方法 通过 CSNRDARRC-PCL-PGA与聚乙二醇1000维生素 E 琥珀酸酯(TPGS)形成共混胶束再负载紫杉醇(多肽紫杉醇NP),其后通过 MTT检测细胞存活、DAPI 及 Annex V/PI 染色分析细胞凋亡、JC-1腺粒体膜电位分析检测多肽紫杉醇 NP对膀胱癌 RT112细胞的影响. 结果 多肽紫杉醇 NP 能够抑制 RT112细胞生长,并且有时间依赖性;细胞周期分析显示 RT112细胞停滞在 G2期,DAPI及 Annex V/PI染色均可见细胞凋亡;JC-1染色发现多肽紫杉醇 NP 是通过腺粒体膜电位下降引起细胞凋亡.所有结果均显示多肽紫杉醇NP优于紫杉醇NP. 结论 CSNRDARRC多肽修饰的TPGS-b-(PCL-ran-PGA)负载紫杉醇纳米颗粒(多肽紫杉醇 NP)抑制膀胱癌 RT112细胞增生及促进凋亡,为临床治疗膀胱癌提供了一个新手段.

目的 探讨经RGD肽段修饰的大直径TiO2纳米管的纯钛表面对MG63成骨细胞黏附增殖能力的影响,为种植体表面改良提供实验依据.方法 纯钛样本分为4组:①SLA组,通过大颗粒喷砂酸蚀(sand-blasted,large grit,acid-etched,SLA)法在商业纯钛表面制作微米级粗糙的形貌;②SLA+80组,通过SLA法以及阳极氧化法在商业纯钛表面制作微纳混合的形貌;③DOPA组,在经SLA法及阳极氧化法电化学修饰后的钛片表面通过多巴胺(dopamine,DOPA)修饰;④RGD组,使用分子自组装技术在经过电化学修饰和多巴胺修饰后的钛片表面接枝RGD多肽的生物活性涂层.借助场发射扫描电镜(field emission scanning electron microscope,FE -SEM)以及X射线光电子能谱仪(X-ray photoelectron spectroscopy,XPS)对各组的表面形貌以及表面元素进行观察分析;将MG63成骨细胞接种到各组钛片表面,对各组表面的生物活性进行检测评价:荧光显微镜下观察细胞早期黏附能力、MTS法检测细胞增殖能力、qRT-PCR法检测细胞成骨相关基因碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、骨钙素(osteocalcin,OCN) mRNA表达水平.结果 FE-SEM及XPS观察显示在钛片表面经过SLA法成功制得微粗糙的表面形貌,通过阳极氧化法可在SLA的表面附加大直径纳米管,通过引入DOPA修饰成功将RGD肽段接枝到纳米管表面.体外细胞实验显示,RGD组与另外3组相比,更利于细胞黏附、增殖(P＜0.05),RGD组ALP、OCN mRNA表达水平显著强于SLA组、DOPA组(P＜0.05).结论 通过RGD肽段修饰的表面为大直径TiO2纳米管的微纳混合的形貌,其生物学性能有了显著提升,可用于种植体表面的改良,提高早期骨结合效果.

硼中子俘获治疗(boron neutron capture therapy,BNCT)是一种基于稳定同位素硼-10被中子照射产生高能α粒子时发生的核俘获和裂变反应的二元放射疗法.本综述关注了这个二元系统的一个重要组分,即具有肿瘤靶向性的硼携带剂.目前临床上正在使用的两种低分子量含硼药物是硼苯丙氨酸(boronophenylalanine,BPA)和硼卡钠(sodium borocaptate,BSH).尽管还远未达到理想水平,但它们的治疗效果已经在高级别神经胶质瘤、头颈部复发性肿瘤以及小部分皮肤和皮肤外黑色素瘤患者中得到了证实.由于它们存在局限性,在过去的40年中,研究者们一直在为临床应用努力研发具有更高生物分布和摄取性的新型硼携带剂.这些物质包括含硼的卟啉、氨基酸、多胺、核苷、多肽、单克隆抗体、脂质体和各种类型的纳米颗粒,以及硼簇合物和共聚物.然而到目前为止,还没有一种化合物获得过有说服力的数据,能使之进入临床生物分布研究.因此,目前进一步提高BNCT临床疗效的最佳途径是优化BPA和BSH单独使用或联合使用的给药模式和递送方式,并希望未来的研究能发现更新更好的硼携带剂供临床使用.