目的:通过对三个非复制型痘苗病毒修饰株的细胞生物学特性及小鼠体内毒力对比研究，为天花/猴痘疫苗替代产品的研制提供参考依据。方法:在BHK-21/CEF中对复制型痘苗病毒天坛株(Vaccinia virus Tiantan strain，VTT)和复制缺陷型痘苗天坛株(non-replicating Tiantan Vaccinia virus strain, NTV)及其修饰株NTV-C7L、NTV-△F1L-C7L、NTV-K1L进行扩增纯化及Western blot鉴定后，采用免疫噬斑实验对各病毒株在细胞中的毒力和扩散能力进行评价；通过复制动力学曲线比较各毒株之间的复制差异，采用小鼠滴鼻实验进行体重变化观察，比较病毒的毒力水平。结果:Western blot结果证明扩增纯化的痘苗病毒各毒株均正确。免疫噬斑及复制动力学曲线表明三株NTV基因修饰株在CEF中的复制能力与NTV相近；在Vero细胞间的扩散能力和复制能力均有所提高，但复制倍数都小于100倍；在MRC-5中复制水平与NTV相比得到明显增强，其中NTV-C7L的复制倍数达20 000倍以上；小鼠体内毒力结果显示三个NTV基因修饰株与NTV相比体重变化无统计学意义。结论:三个NTV基因修饰株在人源性细胞MRC-5中恢复了复制能力，但在小鼠中的毒力与NTV相近，具备了作为天花/猴痘疫苗换代产品候选株的初步条件。

目的:应用新一代长读长测序技术精准确定复制缺陷型痘苗病毒天坛株(non-replicating Tiantan strain of vaccinia virus，NTV)全基因组序列及其开放阅读框(ORFs)组成。方法:基于本实验室储备的NTV，在鸡胚成纤维细胞上进行扩增并纯化，提取NTV全长基因组核酸。PacBio HiFi测序从头组装获取NTV全长基因组序列。以同源注释的策略确定其ORF组成，并分析其与已知复制缺陷型痘苗病毒毒株ORF异同。结果:NTV全长共171 729 bp，GC含量为33%，其独特的倒置末端重复(ITR)区域包含发夹结构、两个串联重复区域及3个非重复区域。NTV共有166个ORFs，与第三代天花病毒疫苗改良安卡拉株(MVA-BN)和复制缺陷型哥本哈根株(NYVAC)株相比，主要差异位于ITR及其周围区域，3个毒株共同享有138个ORFs，NTV特有6个编码与病毒逃避宿主抗病毒反应相关的ORFs。结论:通过三代测序技术精准确定NTV全基因组序列及ORFs组成，并揭示其与其他复制缺陷型痘苗病毒毒株的异同，为新一代猴痘疫苗和痘苗病毒载体研发应用提供重要参考。

目的:对非复制型痘苗病毒NTV感染人源细胞后的细胞形态变化及相关分子机制进行研究，为NTV载体的进一步优化改造和应用提供科学依据。方法:用复制型痘苗病毒天坛株VTT和非复制型痘苗病毒NTV感染HeLa细胞，观察细胞的形态学变化。然后收获细胞，电泳检测rRNA断裂水平和Western blot检测凋亡相关分子信号，初步确定NTV诱导的早期细胞凋亡的通路与机制。结果:在细胞形态学方面观察到被NTV感染的细胞，与VTT相比，能够在较早时间出现细胞变圆、皱缩等病变现象。DAPI染色观察到被NTV感染的细胞核在早期会出现染色质高度凝聚、边缘化的现象并随着时间的增加而崩解。rRNA断裂水平检测结果说明被NTV感染16 h后的rRNA已发生断裂和降解。Western blot检测结果说明在NTV感染HeLa细胞中能够检测到比正常细胞中更强的PARP、caspase-3及caspasee-9的分子信号，但caspasee-8并没有明显增加，而VTT的结果则与NTV相反。结论:NTV在早期能够诱导细胞凋亡，为痘苗病毒载体改造提供理论依据。

目的 检测痘苗病毒早期、晚期蛋白表达水平,对复制缺陷型痘苗病毒天坛株(NTV)复制缺陷机制进行初步探究.方法 构建原核表达载体表达并纯化与痘苗病毒复制密切相关的早蛋白E3和晚期蛋白F17,免疫小鼠制备相应鼠多抗血清,用其对NTV病毒在非允许细胞中相应蛋白的表达水平进行检测.结果 在大肠埃希菌中分别表达、纯化了痘苗病毒E3和F17蛋白,并制备获得了相应的鼠多抗血清;Western blot鉴定在非允许细胞Hela中复制缺陷型痘苗病毒NTV的早期蛋白E3及晚期蛋白A27能正常表达,但晚期蛋白F17表达受到明显抑制.结论 F17蛋白表达受限可能是NTV复制缺陷的机制之一.

目的 研究复制型天坛株痘苗病毒(rTV)在免疫缺陷型Rag2基因敲除(Rag2-/-)大鼠体内的生物分布特点及其对组织病理变化的影响,为复制型痘苗病毒载体疫苗的应用和安全性评价提供参考.方法 rTV分别以尾静脉注射途径感染免疫缺陷型Rag2-/-大鼠和野生型SD大鼠,以背部皮下注射途径感染免疫缺陷型Rag2-/-大鼠.利用TaqMan探针法实时荧光定量PCR检测痘苗病毒在大鼠体内的生物分布和病毒载量,比较分析两种模式动物Rag2-/-大鼠和SD大鼠感染rTV后的生物分布特点及rTV以不同途径感染Rag2-/-大鼠后的生物分布特点,并对感染过rTV的所有组织样本进行HE染色,比较分析不同分组大鼠感染rTV后的组织病理变化.结果 与SD大鼠相比,rTV在免疫缺陷型Rag2-/-大鼠的生物分布范围更广;在免疫缺陷型Rag2-/-大鼠中,rTV尾静脉注射感染途径的效果要强于皮下注射的感染途径;rTV尾静脉注射途径感染Rag2-/-大鼠的心、睾丸和后爪的病毒载量显著高于尾静脉注射途径感染SD大鼠(P<0.001)和皮下注射途径感染Rag2-/-大鼠(P<0.001);与SD大鼠和皮下感染途径相比,通过尾静脉途径感染免疫缺陷型Rag2-/-大鼠的组织病理变化较明显,且均无由rTV引起的病理性损伤.结论 复制型天坛株痘苗病毒在免疫缺陷型Rag2-/-大鼠体内表现出较广的组织分布、较高的表达水平及非特异性的组织病理变化,为其作为免疫缺陷类型患者的载体疫苗的应用的安全性提供了新的依据.

痘苗病毒减毒株作为基因表达载体,广泛应用于多种疾病的预防和治疗.复制缺陷型痘苗病毒天坛株(Nonreplicating Tiantan vaccinia virus,NTV)作为一株高度减毒的痘苗病毒株,其生物学特性和复制缺陷机制还有待研究.探究NTV细胞生物学特性和复制缺陷机制.在不同种属和组织来源的细胞中测定NTV复制能力、细胞嗜性和毒力;Western Blot检测HeLa细胞中的NTV的A17/A27蛋白表达水平,Real-time PCR检测晚期蛋白A17/A27转录水平.NTV在BHK-21、CEF细胞中可有效复制和扩散,而在Vero细胞及人源细胞HeLa、2BS、Hep-2和143TK-中均不能有效复制;在HeLa细胞中,晚期蛋白A17和A27蛋白表达受阻,而转录水平基本不变.NTV是一株复制缺陷型痘苗病毒,在多种细胞中复制和扩散受限;NTV晚期蛋白A17和A27的表达受阻且与蛋白表达转录水平无关,初步判定蛋白表达受阻发生在蛋白翻译阶段.

以痘苗病毒为载体的溶瘤病毒作为癌症治疗的新方向效果显著.同时,痘苗病毒还可以作为疫苗载体抵抗HIV、H5N1等病毒感染.因技术限制,重组痘苗病毒主要通过同源重组的方法获得,但此方法获得重组病毒的效率较低.随着CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeat)-Cas9技术成功应用于多种动物、组织和细胞的基因编辑中,本研究拟利用CRISPR-Cas9技术建立高效重组痘苗载体系统.本研究首先构建了三个靶向痘苗病毒天坛株TK区的gRNA-Cas9的质粒以及重组质粒pJ2R-EGFP,通过瞬时转染gRNA-Cas9或建立gRNA-Cas9稳定细胞系后,导入重组质粒pJ2R-EGFP并感染VTT,获得表达EGFP的重组病毒.此高效重组痘苗病毒载体系统的重组效率比传统的同源重组方法大大提高.因此,本研究建立的高效痘苗病毒载体重组系统,为其在疫苗载体构建、肿瘤免疫治疗等方面提供参考价值.

用痘苗病毒为载体，构建表达EB病毒膜抗原的活疫苗株，TTV11k GP和TTV7.5k GP。除7.5k启动子外，在重组痘苗病毒中，外源基因两端的框架，启动子和用于同源转染的痘苗病毒均来自天坛株。两株重组痘苗病毒在感染细胞膜上表达EB病毒膜抗原，它与特异性单克隆抗体反应。在感染细胞中表达的膜抗原经SDS-PAGE分析，表达分子量为300～340kd和200kd～220kd糖蛋白以及140kd和100kd的糖蛋白前体。Southdrn杂交分析了重组病毒DNA中EB病毒特异的膜抗原基因以及对作为活疫苗的重组痘苗病毒株进行了一些微生物学活性、免疫原性、毒力等方面的研究。

本文报导建立一次铺琼脂复盖物对重组痘苗病毒进行蚀斑测定及纯化的方法。采用此法比较了乙肝-痘苗天坛株、乙肝-痘苗wR株重组病毒与其未重组病毒蚀斑的大小，发现乙肝-痘苗天坛株重组病毒形成的蚀斑比其未重组病毒的蚀斑明显地小，乙肝-痘苗wR株重组病毒的蚀斑亦如此。

构建了一个可以适于人用的表达狂犬病病毒糖蛋白的重组痘苗病毒疫苗株。构建的方法是：先构建一个表达 β-半乳糖苷酶基因（简称 lac基因）的不经传代细胞的重组痘苗病毒，以此为亲本株，再与载体PTk 11kRG（狂犬病病毒糖蛋白基因插在胸苷激酶Tk区，并置于痘苗病毒11k启动子下游，Tk侧冀序列和启动子均来自痘苗病毒天坛株），在鸡胚细胞中同源重组，以蓝色空斑中挑白斑的方法筛选阳性重组病毒，用免疫荧光方法和APAAP免疫酶法证明，该病毒能较好地表达狂犬病病毒糖蛋白。动物实验表明，该病毒能较好地诱导小鼠和狗的抗狂犬病毒的中和抗体，并对狂犬病病毒CVS株和SRV（街毒）的攻击有保护作用。