目的:建立工作场所空气中N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺、N-亚硝基甲基乙胺、N-亚硝基二丁胺、N-亚硝基正丙胺、N-亚硝基吗啉、N-亚硝基二苯胺和N-亚硝基吡咯烷8种N-亚硝胺化合物的气相色谱-串联质谱（GC-MS/MS）检测方法。方法:于2023年1至8月，以ThermoSorb/N柱采集工作场所中空气中8种N-亚硝胺，用4 ml甲醇-二氯甲烷（体积比1∶1）溶液解吸，VF-624 ms毛细管色谱柱分离，多反应监测模式检测，外标法定量，并对方法的检出限和精密度等指标进行分析。结果:8种N-亚硝胺测定方法的线性范围为1.0~20.0 μg/L，相关系数0.999 3~0.999 9，方法检出限0.051~0.132 μg/L，最低定量浓度0.030~0.078 μg/m 3（以空气体积22.5 L，解吸液体积4.0 ml计），批内精密度2.05%~6.89%，批间精密度2.41%~8.26%，解吸效率67.20%~102.60%；样品在4 ℃条件下至少可保存7 d。 结论:GC-MS/MS测定工作场所空气中8种N-亚硝胺方法的灵敏度高、精密度好，可准确测定工作场所空气中8种N-亚硝胺含量。

目的 评价布美他尼杂质N-亚硝基布美他尼的体内致突变风险和肝细胞DNA损伤风险.方法 SD大鼠随机分为6组,分别为:溶媒对照组(溶媒为0.5%羧甲基纤维素钠),N-亚硝胺布美他尼100、300、1 000 mg·kg-1 剂量组,阳性对照组1[N-乙基-N-亚硝基脲(ENU),40 mg·kg-1]、阳性对照组 2[甲磺酸乙酯(EMS),200 mg·kg-1].2 个阳性对照组均为每组 6 只动物,其余每组 12 只动物.大鼠连续14 d经口灌胃给予受试物N-亚硝胺布美他尼.首次给药后约14 d和约 28 d后采集外周血用于Pig-a基因突变率检测,末次给药后约 3 h取肝细胞开展彗星试验.结果 试验期间给予N-亚硝基布美他尼未导致异常临床症状和动物体重及摄食量改变.100、300、1 000 mg·kg-1 剂量组动物肝细胞平均tail%DNA值(平均数/中位数)分别为2.90±0.38/2.34±0.46、3.58±0.27/2.87±0.51、3.45±0.59/2.21±1.44,与溶媒对照组相应数值相比未见差异,且无明显剂量效应相关性.首次给药后14 d,100、300、1 000 mg·kg-1 剂量组动物平均RBCCD59-和RETCD59-百万分之发生率(RBCCD59-百万分之发生率/RETCD59-百万分之发生率)分别为2.9±1.6/1.2±0.8、2.8±2.4/1.3±1.5、2.4±1.0/1.3±1.5;首次给药后28 d,100、300、1 000 mg·kg-1 剂量组动物RBCCD59-百万分之发生率/RETCD59-百万分之发生率分别为5.1±1.5/2.2±0.6、4.3±1.5/3.5±3.6、4.8±2.4/2.5±2.7.上述数值与相同时间点溶媒对照组相比均未见差异,且经统计学分析未见剂量效应相关性.结论 连续经口给予N-亚硝基布美他尼 14 d,SD大鼠的最大耐受量高于1 000 mg·kg-1,未检出外周血基因突变风险和肝细胞DNA损伤风险.研究数据可为药品中遗传毒性杂质的合理监管和含N-亚硝基杂质药物的安全使用提供数据支持.

亚硝胺类化合物由于其结构上存在N-N=O键,容易发生异构化现象.本研究在采用HPLC法对4-(甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)进行分析时,观察到双色谱峰现象.并采用PFP色谱柱对NNK及其异构体进行有效分离,采用LC/MS二级质谱扫描确认了色谱图中2个色谱峰的分子、离子以及碎片离子均相同.同时采用NMR法对一级和二级核磁信号进行结构归属,进一步确证NNK中的杂质峰均属于同分异构体.此外,通过变温试验,采用NMR法测定了NNK的异构化比例范围;通过HPLC的变温试验,确证了 NMR的结果.本研究通过多角度试验方法验证NNK存在互变异构体的现象,有利于NNK含量的准确分析,同时为该类异构化遗传毒性杂质的检测提供了理论依据.

目的:检测天冬酰胺合成酶(ASNS)在胆管癌(CCA)中的表达情况,探讨ASNS在CCA转移中的作用及其机制.方法:通过公共数据库分析各肿瘤组织中ASNS的mRNA表达;收集CCA患者病理组织(n=27),构建硫代乙酰胺诱导的大鼠自发CCA模型和左中位胆管结扎联合二乙基亚硝胺诱导的小鼠自发CCA模型,通过免疫组化、Western blot和免疫荧光法检测ASNS蛋白表达.采用CCK8、划痕和Transwell实验检测ASNS对人CCA细胞HuCCT1和HCCC-9810增殖、迁移和侵袭的影响.构建ASNS稳定敲减的CCA细胞株HuCCT1shNC、HuCCT1shASNS、HCCC-9810shNC和HCCC-9810shASNS,通过肝原位种植和尾静脉注射研究ASNS对CCA细胞肝内生长和肺转移的影响.利用公共数据库富集与ASNS相关的信号通路,并用免疫荧光和Western blot验证相关分子机制.结果:无论在人或动物CCA组织中,ASNS表达水平均高于癌旁组织(P<0.01).ASNS以酶活性非依赖性方式促进CCA细胞HuCCT1和HCCC-9810的增殖、迁移与侵袭.生物信息学分析显示,β-catenin在ASNS高表达的CCA组织中富集,ASNS通过促进β-catenin核转位,启动CCA细胞上皮-间充质转化(EMT).β-catenin抑制剂XAV-939可显著抑制CCA细胞的侵袭与迁移.结论:ASNS在CCA中高表达,通过促进β-catenin核转位,介导EMT,驱动CCA转移.

目的 优化即食水产制品中N-亚硝胺类化合物的前处理方法.方法 采集市售即食水产制品样品,均质后经水蒸气蒸馏,取蒸馏液加入乙醇(分散剂)、三氯甲烷(萃取剂)和3.0 g氯化钠进行分散液液微萃取(DLLME),萃取时间为10 min.离心后取下层有机相,采用气相色谱-三重四极杆质谱法(GC-MS/MS)多反应监测模式测定6种N-亚硝胺类化合物,以内标法定量.结果 6种N-亚硝胺类化合物在10.0～500 μg/L线性范围较好,相关系数均＞0.999;方法 检出限为0.05～0.6μg/kg,定量限为0.15～1.6 μg/kg;平均加标回收率为71.8％～108.9％,相对标准偏差(RSD)为1.4％～8.6％.检测市售即食水产制品样品20份,N-二甲基亚硝胺检出率最高,为90％;N-亚硝胺吡咯烷、N-二乙基亚硝胺和N-二丁基亚硝胺检出率分别为15％、10％和10％.结论 采用水蒸气蒸馏联合DLLME优化即食水产制品中N-亚硝胺类化合物的前处理方法,可满足检测要求.

目的 建立高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)同时测定注射用盐酸头孢甲肟中 7 种N-亚硝胺类基因毒性杂质(N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺、N-亚硝基二乙醇胺、N-亚硝基-N-甲基苯胺、N-亚硝基-N-乙基苯胺、N-亚硝基二异丙胺、N-亚硝基二正丁胺).方法 色谱柱为ACE EXCEL 3 C18-AR(3 μm,100 mm×4.6 mm),流动相为 0.1%甲酸甲醇溶液(A)-0.1%甲酸(B),梯度洗脱,流速 0.6 mL·min-1,采用 APCI 离子源,以正离子、多重反应监测(MRM)模式进行检测.结果 7种N-亚硝胺类基因毒性杂质在 1～20 ng·mL-1 与峰面积线性关系良好.回收率在78.9%～89.6%,RSD均小于6.1%.检测限低于1.5 ng?g-1.样品中各杂质均未检出.结论 该方法灵敏度高、专属性强,可用于注射用盐酸头孢甲肟中7种N-亚硝胺类基因毒性杂质的质量控制.

目的 建立同时测定氯沙坦钾原料药及其制剂中6种N-亚硝胺类基因毒性杂质含量的方法.方法 采用气相色谱-串联质谱(GC-MS/MS)法测定氯沙坦钾原料药、氯沙坦钾片、氯沙坦钾胶囊、氯沙坦钾氢氯噻嗪片中N-亚硝基二甲胺(NDMA)、N-亚硝基二乙胺(NDEA)、N-亚硝基-N-乙基异丙胺(NEiPA)、N-亚硝基二异丙胺(NDiPA)、N-亚硝基二苯胺(NDPA)、N-亚硝基二丁胺(NDBA)6种N-亚硝胺类基因毒性杂质含量.色谱柱为SHIMADZU SH-L-17Sil MS毛细管柱;采用程序升温;进样口温度为250℃;进样量为1 μL;载气为氦气,流速为1 mL/min.离子源为电子轰击源,离子源温度为250℃;溶剂延迟时间为3.1 min;采集模式为多反应监测模式.结果 NDMA、NDEA、NEiPA、NDiPA、NDPA、NDBA与其相邻色谱峰之间的分离效果均良好,分离度均大于3.8;其线性范围分别为4.9～486.0、4.9～488.5、4.5～451.5、6.8～683.5、5.2～525.0、5.2～520.0 ng/mL(r≥0.999 8),定量限分别为4.86、4.88、4.52、6.84、5.25、5.20 ng/mL,检测限分别为0.97、0.98、0.90、1.37、1.05、1.04 ng/mL,重复性试验的RSD为2.2%～5.6%(n=6),精密度试验的RSD为0.5%～1.4%(n=6),稳定性试验的RSD为1.5%～3.4%(n=5),低、中、高质量浓度回收率溶液的平均加样回收率为83.4%～103.0%(RSD为1.2%～6.3%,n=3).在氯沙坦钾原料药及其制剂中均未检出6种N-亚硝胺类基因毒性杂质.结论 该法分离效果好、准确性高、灵敏、简便,可用于氯沙坦钾原料药及其制剂中6种N-亚硝胺类基因毒性杂质的检测.

目的 观察吡咯烷二硫代氨基甲酸酯(pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)对二甲基亚硝胺(dimethylnitrosamine,DMN)诱导肝纤维化大鼠肝组织核转录因子-κB (nuclear factor-κB,NF-κB)、转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)及Ⅲ型胶原(collagen typeⅢ,Col-Ⅲ)表达的影响,探讨PDTC抗肝纤维化的可能机制.方法 22只SD大鼠随机分为对照组6只,模型组8只和治疗组8只.模型组和治疗组腹腔注射质量分数0.5％ DMN溶液2 mL/kg,每2d注射1次,连续4周,诱导大鼠肝纤维化模型;对照组腹腔注射等量生理盐水.治疗组造模期间给予PDTC溶液150 mg/(kg·d)灌胃,对照组、模型组给予等量蒸馏水灌胃.实验结束后处死大鼠,取肝左叶组织光镜下观察肝组织病理改变,采用电泳迁移率试验检测肝组织NF-κBp65活性,实时荧光定量PCR法检测肝组织NF-κBp65、TGF-β1和Col-ⅢmRNA表达,免疫组织化学法检测肝组织NF-κBp65着色细胞数目和Col-Ⅲ着色面积.结果 对照组肝小叶结构正常,细胞排列规律,未见肝细胞变性、坏死;模型组肝细胞融合性坏死,胶原纤维明显增生,假小叶形成;治疗组肝细胞肿胀、变性及炎症细胞浸润程度均较模型组轻;模型组、治疗组肝组织NF-κBp65活性[(76.6±6.5)％、(51.2±4.6)％],NF-κBp65 mRNA(0.019 3±0.005 0、0.009 5±0.002 1)、TGF-β1 mRNA(0.017 5±0.001 2、0.009 7±0.001 1)及Col-ⅢmRNA表达(0.077 5±0.030 5、0.030 1±0.003 3)均高于对照组((28.5±3.3)％、0.003 0±0.001 4、0.004 7±0.000 9、0.015 2±0.005 5)(P＜0.05),NF-κBp65着色细胞数目[(68.60±4.65)、(49.65±3.60)个]均较对照组[(14.68±2.98)个]多(P＜0.05),Col-Ⅲ着色面积[(10.39±1.53)、(7.36±1.17)μm2]均较对照组[(2.46±0.31)μm2]大(P＜0.05);模型组肝组织NF-κBp65活性,NF-κBp65 mRNA、TGF-β1mRNA及Col-ⅢmRNA表达均较治疗组高,NF-κBp65着色细胞数目较治疗组多,Col-Ⅲ着色面积较治疗组大(P＜0.05);Pearson相关分析结果显示,肝组织NF-κBp65活性与NF-κBp65 mRNA、TGF-β1 mRNA、Col-ⅢmRNA表达,NF-κBp65着色细胞数目,Col-Ⅲ着色面积均呈正相关(r=0.884,P＜0.001;r=0.976,P＜0.001;r=0.769,P＜0.001;r=0.934,P＜0.001;r=0.942,P＜0.001),TGF-β1 mRNA与Col-ⅢmRNA表达及Col-Ⅲ着色面积均呈正相关(r=0.831,P＜0.001;r=0.918,P＜0.001).结论 PDTC可能通过抑制NF-κB活性,下调TGF-β1表达,抑制以ColⅢ为主要成分的细胞外基质过度沉积,来发挥抗肝纤维化作用.

目的 建立胆总管结扎(BDL)、硫代乙酰胺(TAA)及二乙基亚硝胺(DEN)联合四氯化碳(CCl4)3种不同机制的小鼠肝纤维化模型.方法 C57/BL6雄性小鼠40只随机分为2组:BDL组、TAA组各20只,另1只雄鼠与3只雌鼠繁殖的小鼠作为DEN+CCl4组.肝组织作HE染色及天狼猩红染色观察形态学改变及胶原沉积情况.结果 BDL模型组第4周时假小叶形成,死亡率为66.7％;TAA模型组随着造模时间的增加,小鼠第3周开始出现纤维组织增生,在第4周假小叶基本形成,第8周时假小叶最为典型,死亡率为20.0％;DEN+ CCl4组第10周时假小叶基本形成,第12周时最为典型,无小鼠死亡.结论 可成功建立BDL、TAA和DEN+ CCl4三种不同机制的小鼠肝纤维化模型.