CRISPR/Cas是原核生物在进化过程中获得的一种免疫防御系统,用于抵抗外来遗传物质的入侵,近年来被开发成为高效的基因编辑、基因调控以及分子诊断工具.其可编程靶向机制揭开了利用该系统进行基因组操作的序幕,并允许在活性范围内实现动态调节和控制基因表达.作为现有基因修饰手段中灵活性最强和成本最低的技术之一,已被广泛应用于临床疾病治疗、工农业生产、可持续染料开发和化学品加工等领域.随着对CRISPR/Cas系统的不断深入挖掘和探索,大量研究报道了 gRNA工程改造及优化方法,包括改变间隔序列长度、调节恒定区和可变区的结构、向末端或中间延伸添加额外功能序列及化学合成修饰等,以期降低脱靶突变率,提高作用效率,充分激发CRISPR基因操纵工具在生物医学方面的潜力.基于此,本综述将介绍CRISPR/Cas9和CRISPR/Cas12系统中gRNA工程化设计方法及应用研究的最新进展,分析探讨了当前工程化gRNA技术面临的机遇和挑战,旨在为获得性能更加优异的gRNA提供思路和方向,从而提高利用CRISPR/Cas系统探测人类细胞基因组的能力,进一步为可编程生物学带来更多可能性.

目的通过与并行采集(parallel imaging,PI)对比,探讨人工智能辅助压缩感知(artificial intelligence-assisted compressed sensing,ACS)技术对肩关节MRI扫描时间和图像质量的影响,并优化扫描方案.材料与方法前瞻性纳入2023年11月至2024年2月在我院行肩关节MRI检查的70例患者,扫描序列采用快速自旋回波序列包括斜冠状位T1加权成像(oblique coronal T1-weighted,OCor T1WI)、斜冠状位T2加权频率选择脂肪抑制成像(oblique coronal T2-weighted with fat saturation,OCor T2WI-fs)、斜矢状位质子密度(proton density,PD)加权频率选择脂肪抑制成像(oblique sagittal PD-weighted with fat saturation,OSag PDWI-fs)、横断面PD加权频率选择脂肪抑制成像(transverse PD-weighted with fat saturation,Tra PDWI-fs),分别采用ACS和PI两种加速采集技术.比较两种技术的扫描时间.测量冈上肌肌腹和肱骨头的信号强度及背景标准差,并计算信噪比(signal-to-noise ratio,SNR).采用李克特量表对图像质量进行评分.结果相较于PI,采用ACS缩短了33.5％的扫描时间.采用ACS采集的图像伪影更少,骨骼肌肉的噪声更小,在图像质量主观评分上均高于采用PI的图像,差异均有统计学意义(P均<0.05).OCor T1WI、OCor T2WI-fs和Tra PDWI-fs序列中采用ACS的图像在冈上肌和肱骨头的SNR均高于采用PI的图像,差异均有统计学意义(P均<0.001).OSag PDWI-fs序列中图像冈上肌的SNR采用ACS与PI差异无统计学意义(P>0.05),图像肱骨头的SNR采用ACS采集的图像高于PI的图像,差异有统计学意义(P均<0.001).结论与传统的PI相比,采用ACS在肩关节MRI中可实现更高效且稳定的快速成像方案,提高图像质量,缩短扫描时间,提高患者耐受程度,具有较好的临床应用价值.

结核分枝杆菌（MTB）感染导致的结核病仍然是全球公共卫生的巨大挑战。耐多药结核病（MDR-TB）和广泛耐药结核病（XDR-TB）菌株使得结核病治疗更加困难。不断研发新遗传工具，探索MTB生理，有望发现新的药物靶点。其中，最近用于MTB研究的成簇规律间隔短回文重复序列干扰（CRISPRi）与高通量测序相结合，为揭示MTB生理和遗传提供了基础。本文综述了CRISPRi在MTB生物学研究中的应用及技术发展。

目的:探索Unity MR加速器放疗系统在临床应用中各阶段的时间特征，为临床优化流程时间提供参考。方法:回顾性研究使用Unity MR加速器治疗的患者55例，根据治疗计划方式分为位置自适应(ATP)和形状自适应(ATS)两组，统计对比两种治疗流程中各阶段所需时间、各部位的扫描序列名称和序列所需时长、计划射野数、子野数及跳数。此外，按治疗部位不同统计摆位时间。两种流程各分步时间及各部位摆位时间的结果采用中位数M (Q 1, Q 3)方式描述，各计划的子野数、射野数及跳数采用Mean±SD方式描述。 结果:行ATP治疗流程42例，共计305治疗分次：摆位、MR扫描、配准、自适应计划、出束、总时间分别为3(2, 5)、5(4, 7)、3(3, 4)、8(4, 12)、8(6，11)、30(25, 36) min；行ATS治疗流程13例，共计65治疗分次：摆位、MR扫描、配准、靶区及OAR勾画、自适应计划、出束、总时间分别为2(2, 3)、7(5, 8)、4(3, 5)、12(9，16)、11(10，14)、10(9，11)、55(49，61) min。按治疗部位统计摆位时间：头颈、胸、腹部分别为4(2, 4)、2(2, 4)、3(2, 5) min；行ATP各计划的子野数、射野数及跳数分别为：头颈部8.1±1.7、49.9±31.2、846.75±363.44 MU，胸部8.0±2.0、60.7±13.3、790.21±279.00 MU，腹部9.7±2.0、81.2±22.3、2007.32±1053.81 MU；行ATS计划的子野数、射野数及跳数分别为：头颈部(仅1例)13、39、993.07 MU，腹部9.5±1.5、65.5±6.3、2763.26±835.41 MU。结论:MR引导放疗具有较大临床应用潜力，目前整体治疗时间较长，但仍有改进的空间。

目的:构建共表达P1和3CD的重组杆状病毒，利用昆虫细胞重组表达2型脊髓灰质炎病毒(poliovirus type 2，PV2)的病毒样颗粒(virus-like particle, VLP)，制备PV2-VLP进行初步免疫原性研究。方法:基于粉纹夜蛾细胞(High 5)密码子偏好性，将PV2的P1基因和3CD基因进行序列优化，并对P1基因进行稳定性突变，构建突变型rBac-PV2-P1s-3CD和野生型rBac-PV2-P1-3CD杆状病毒。Western blot分别检测目的蛋白表达量，离子交换层析纯化PV2-VLP，透射电镜观察VLP高级结构确定组装效率。免疫大鼠评估免疫原性。结果:成功构建了可稳定表达P1s蛋白和3CD蛋白的重组杆状病毒。Western blot结果表明热稳定性突变后VLP产量相比野生型有所提高。电镜观察发现直径约30 nm的三维结构，表明VLP成功组装。动物实验结果表明，重组制备的PV2-VLP具有免疫原性，且能有效刺激产生中和抗体。结论:用昆虫细胞-杆状病毒表达系统可成功制备有效的VLP类疫苗，为PV-VLP疫苗的研制提供参考。

目的:建立一种快速、灵敏、可视化的H7亚型禽流感病毒等温核酸扩增检测方法。方法:针对H7N9禽流感病毒的HA片段保守区序列设计引物、探针，优化反应温度，建立H7亚型禽流感病毒的重组酶聚合酶扩增结合侧流层析试纸条检测技术，评价其特异性和敏感性，并与Real time PCR方法进行比较。结果:该方法检测H7亚型禽流感病毒的最低检出限为20拷贝/μL，与其他流感/禽流感病毒无交叉反应，反应可在20~50℃温度范围内进行，临床样本检测结果与Real time PCR法一致性为100.0％。结论:该检测方法具有快速、特异及灵敏的特点，为在基层和现场快速检测H7亚型禽流感病毒提供了新的方法。

目的:研发一款一体化呼吸道合胞病毒(RSV)分型即时检验(point-of-care testing，POCT)检测试剂并评估其性能。方法:以RSV A和B亚型及ON1和BA9基因型的基因组保守序列设计特异性的引物和探针，优化PCR反应体系和条件，整合试剂玻璃化技术和多重检测平台，开发RSV分型POCT检测试剂，并对该产品的敏感度、特异度、重复性和临床性能进行评估。结果:一体化RSV分型POCT检测试剂敏感度可达500拷贝/ml，特异度好，与临床上表现相似的病原体无交叉反应，试剂批间和批内重复性Ct值的变异系数均<5%，具有较好的重复性，检测试剂应用于53例临床样本测试，检测结果与对比试剂具有较高的一致性和符合率，阳性符合率高达98.11%。结论:本研究开发的一体化RSV分型POCT检测试剂集成了"核酸提取-纯化-检测"，实现了"样本进，结果出"，操作简单，检测结果准确、可靠、稳定，可用于RSV A和B亚型的分型即时检验，为RSV的防控和诊疗提供助力。

目的:探讨UBQLN2基因罕见变异与肌萎缩侧索硬化（ALS）发病的相关性。方法:通过二代测序技术对2018年1月至2020年7月就诊于北京大学第三医院神经内科的ALS患者进行基因检测，筛选出UBQLN2基因可能的致病性罕见变异，分别与国际千人基因组计划（1000 Genome Project）2 504个样本及国内全外显子测序健康对照数据库1 812个样本比对分析，进行序列核关联性检验（SKAT）及优化的SKAT（SKAT-O），并分析其致病性罕见变异携带者的临床表型特点。结果:共纳入166例中国ALS患者，家族性病例33例，散发性病例133例，男女比例为1.68∶1，发病年龄（43.8±12.2）岁，球部起病占12.7%，肢体起病占85.5%，5例为ALS合并额颞叶痴呆（FTD）（3.0%）。共筛选出3个UBQLN2基因可能的致病性罕见变异，c.128A>G（p.Lys43Arg）、c.142G>T（p.Val48Leu）及c.1451T>G（p.Val484Gly），均为错义突变，既往未见致病性报道。以1000 Genome Project作为对照，SKAT P=2.49×10 -6，SKAT-O P=9.22×10 -7；以国内全外显子测序健康对照数据库作为对照，SKAT P=1.42×10 -3，SKAT-O P=1.10×10 -3；携带UBQLN2基因罕见变异患者球部起病比例较其他患者高（2/3比19/163， P=0.042）。 结论:UBQLN2基因罕见变异与ALS发病存在相关性，该基因突变可能与球部起病相关。

目的:分析中国流行的柯萨奇病毒A6型（coxsackievirus A6，CVA6）D3基因亚型中的D3a和D3b分支序列结构蛋白B细胞抗原表位氨基酸差异性来优化设计CVA6病毒样颗粒（virus-like particle，VLP）疫苗。方法:对GenBank下载的含有P1区核苷酸CVA6序列，使用MEGA.11.0软件基于VP1序列采用最大似然法构建进化树划分基因型及亚型。采用在线工具WebLogo并结合CVA6 B细胞抗原表位研究的相关文献，对D3a和D3b分支序列VP1-VP3区B细胞抗原表位氨基酸差异性分析，为筛选疫苗候选株进行CVA6 VLP的制备。结果:D3a与D3b分支序列在VP1 N末端P27位点分别是天冬酰胺（96.2%）和丝氨酸（92.9%）；在VP3 N末端P60位点为甘氨酸（98.8%）和丝氨酸（60.0%）。基于上述差异性选择具有D3a（VP3-N-P60）和D3b（VP1-N-P27）两分支序列共有的B细胞抗原表位D3a-JX2018（GenBank accession number：MN845862）作为疫苗候选株，并成功制备了CVA6 VLP。结论:本研究为疫苗候选株的选择提供了新的思路，为日后CVA6 VLPs疫苗和免疫诊断试剂的研发提供了基础。

目的:分析DRG点数法付费方式对恶性肿瘤手术患者次均住院费用及平均住院天数的影响，为优化医保支付制度提供参考。方法:从宁波市医疗机构综合监管平台，选取2019年7月至2022年6月宁波市4家三级综合医院肺部、结直肠及甲状腺恶性肿瘤手术患者的病案首页数据，提取患者住院费用和住院天数信息；采用结构变动度和中断时间序列分析DRG点数法付费实施(2021年1月)后3种恶性肿瘤手术患者的次均住院费用、费用结构和平均住院天数的变化情况。结果:共纳入39 708例患者病案首页，其中肺部、结直肠及甲状腺恶性肿瘤手术患者分别为19 635、6 073和14 000例。恶性肿瘤手术患者次均住院费用从DRG点数付费实施前的29 662元增至实施后的30 097元( P <0.05)，平均住院天数从10.83 d降至9.42 d( P <0.05)。恶性肿瘤手术患者住院费用构成比最高的是耗材费(35.12%)，其次为治疗费(23.52%)。DRG点数付费实施后，药品费构成比下降2.98%，综合医疗服务费、治疗费、检验检查费和耗材费构成比分别增加0.90%、0.23%、0.93%和0.92%;其中，药品费的结构变动度贡献率最大(50.13%)，其次为检验检查费(15.59%)和耗材费(15.34%)。经中断时间序列分析，DRG点数法付费实施后，肺部恶性肿瘤患者次均住院费用呈缓慢增长趋势( P< 0.05)，其他2种恶性肿瘤患者次均住院费用涨势均有所放缓( P>0.05); 3种恶性肿瘤手术患者平均住院天数下降趋势相对平缓( P >0.05)。 结论:DRG点数法付费实施后，宁波市4家医院恶性肿瘤手术患者次均住院费用整体增加，但涨势放缓，且费用结构得到一定优化；同时，患者平均住院天数得到缩短，变化趋势较平缓。建议在推行DRG点数法付费政策的同时，应重点加强检验检查项目和医用耗材的监管。