目的:探讨基于甲基丙烯酸酐化明胶（GelMA）仿生微环境与悬滴法三维培养小鼠毛乳头细胞（DPC）制备仿生毛乳头球的生物活性及其在裸鼠中的毛发诱导功能。方法:采用实验研究方法。采用酶消化法获取雄性5~6周龄C57BL/6J小鼠触须毛的DPC以及1 d龄C57BL/6J小鼠皮肤角质形成细胞（KC），经免疫荧光法鉴定前者第3代细胞稳定表达DPC标志物神经细胞黏附分子、碱性磷酸酶（ALP）、β连环蛋白及α平滑肌肌动蛋白，后者原代细胞稳定表达KC标志物角蛋白15。取第8代DPC，用GelMA重新悬浮并接种至Transwell孔板插件底面，光交联后倒置培养，于光学显微镜下观察培养0（即刻）、3 d GelMA悬滴中DPC聚集情况（聚集成球即仿生毛乳头球），采用活/死染色试剂盒检测培养3 d仿生毛乳头球中细胞活性。将传统二维培养的原代DPC、第8代DPC以及按前述方法制备的仿生毛乳头球分别设为原代DPC组、第8代DPC组、仿生毛乳头球组，利用高通量测序技术平台对每组培养3 d的3个样本中DPC进行转录组测序，利用基迪奥生物信息云工具平台（OmicShare Tools）对转录组数据进行主成分分析、Pearson相似性分析、差异表达基因筛选，利用时间序列趋势分析软件对差异表达基因进行表达模式聚类分析，利用基迪奥生物信息云工具平台对具有特定表达模式的差异表达基因进行京都基因与基因组百科全书（KEGG）和基因本体论（GO）富集分析。同前进行细胞分组，采用随机数字表法从差异表达基因中抽取性别决定区Y框蛋白8（ SOX8）、基质金属蛋白酶9（ MMP- 9）、26型胶原纤维α1（ COL26A1）、无翅型MMTV整合位点家族成员6（ Wnt6），采用实时荧光定量反转录PCR（RT-PCR）法验证差异表达基因mRNA表达情况与测序结果的一致性（样本数为9）；采用实时荧光定量RT-PCR法检测DPC生物功能标志物成纤维细胞生长因子7（FGF7）、Wnt10a、淋巴样增强因子1（LEF1）、ALP、β连环蛋白、多功能蛋白聚糖、SOX2的mRNA表达情况（样本数为9）。取3只5~6周龄雄性BALB/c裸鼠，分别设为原代DPC组、第8代DPC组、仿生毛乳头球组，将原代DPC、第8代DPC、仿生毛乳头球分别与原代KC以2∶1细胞数比例混合后分别注射至相应组别裸鼠皮下，每只注射6个区域。注射后2周，取注射区域全厚皮，计数再生毛发，行苏木精-伊红染色后观察再生毛囊情况。对数据行单因素方差分析、Tukey检验并进行Bonferroni校正。 结果:培养3 d，DPC在GelMA悬滴中由培养0 d的分散状态聚集成仿生毛乳头球，制备的仿生毛乳头球中细胞活性良好。培养3 d，主成分分析显示，相比于第8代DPC组，原代DPC组、仿生毛乳头球组组内样本间变异程度较低，仿生毛乳头球组与原代DPC组组间样本变异程度最低，3组DPC样本超过90%的基因谱数据变异可由第1个和第2个主要成分来解释；Pearson相似性分析显示，组内样本重复性好，原代DPC组和仿生毛乳头球组样本间的相关系数为0.84~0.95，原代DPC组和第8代DPC组样本间的相关系数为0.72~0.87；3组DPC间差异表达基因分析筛选出642个组间交集差异表达基因，对其进行表达模式聚类显示有2种基因表达模式有显著趋势（ P<0.05），分别为第8代DPC组基因表达显著低于原代DPC组/仿生毛乳头球组、第8代DPC组基因表达显著高于原代DPC组/仿生毛乳头球组，共包含411个差异表达基因；KEGG富集分析显示这411个差异表达基因在Wnt信号通路以及磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B信号通路显著富集（ P<0.05），GO富集分析表明细胞外基质、经典Wnt信号通路、细胞分化等GO术语被显著富集（ P<0.05）。与原代DPC组、仿生毛乳头球组比较，第8代DPC组细胞基因 SOX8、MMP- 9、COL26A1、Wnt6 mRNA表达量均明显下降（ q=15.950、8.854、11.890、11.050，9.851、5.884、7.418、4.870， P<0.01），与测序数据一致。与原代DPC组、仿生毛乳头球组比较，第8代DPC组细胞生物功能标志物FGF7、Wnt10a、LEF1、ALP、β连环蛋白、多功能蛋白聚糖、SOX2 mRNA表达量均明显下降（ q=11.470、9.795、4.165、9.242、10.970、10.570、8.005，7.472、4.976、3.651、4.784、5.236、6.825、5.214， P<0.05或 P<0.01）。注射后2周，第8代DPC组裸鼠无毛发再生，仿生毛乳头球组与原代DPC组裸鼠再生毛发数量相近（ q=1.852， P>0.05）且均显著高于第8代DPC组（ q=18.980、17.130， P<0.01）；第8代DPC组裸鼠注射区域皮肤仅形成了坏死灶，而仿生毛乳头球组与原代DPC组裸鼠注射区域皮肤均观察到再生毛囊且毛囊横断切面有黑色素沉着。 结论:基于GelMA仿生微环境与悬滴法三维培养小鼠DPC制备仿生毛乳头球的培养模型可一定程度上恢复高传代DPC在裸鼠中的毛发诱导能力，且其生物特性更加类似于原代DPC，可实现DPC的扩增后特性恢复。

高血压是导致脑卒中、心肌梗死、心力衰竭和肾衰竭等发生的危险因素,也是导致死亡的主要原因,因此研究高血压的潜在治疗靶点、开发新的抗高血压药尤为重要.现总结近年来关于高血压新治疗靶点的研究进展,包括Elabela/Apelin-APJ轴、序列相似性家族3D蛋白、成纤维细胞生长因子21和血管紧张素Ⅱ 1型受体的变构调节,以期为抗高血压药的研究提供新的思路和文献支持.

目的:克隆编码滇重楼赤霉素合成代谢途径中关键酶GA氧化酶(Gibberellic oxidase,GAox)的全长cDNA序列,并进行生物信息学分析.方法:根据滇重楼转录组测序序列,设计特异性PCR引物,利用RT-PCR技术扩增目标基因编码区的全长序列连接至pMD18-T载体上,进行序列测定及序列同源性比较分子系统进化树构建、结构域搜索及蛋白质三维结构预测等生物信息学分析.结果:成功克隆了滇重楼的的6条GAox基因,大小在1000 bp左右,分别命名为PpGA2ox1、PpGA2ox2、PpGA2ox3、PpGA2ox4、PpGA20ox1和PpGA3ox1.6条基因分别属于GA氧化酶三个不同的亚家族.滇重楼GAox蛋白氨基酸数量均在300～ 400,理论等电点在4～7左右,带正电荷.PpGA2ox1、PpGA2ox2和PpGA2ox4为不稳定蛋白,PpGA2ox3、PpGA20ox1和PpGA3ox1为稳定蛋白,均为没有跨膜结构域和信号肽的亲水蛋白.除了PpGA2ox1亚细胞定位在叶绿体,其他蛋白均定位在细胞质.滇重楼GAox蛋白与不同物种同源序列的序列相似性较高,保守性比较强.结论:首次从滇重楼中克隆了6条GAox基因并对其进行了初步的生物信息学分析.

该研究以‘宁杞1号’枸杞果实为材料,基于转录组测序TR28373|c0_g1序列,利用RT-PCR技术,克隆出枸杞果糖激酶基因LbFRK7的全长序列为1 060 bp,其中,ORF开放阅读框为1 044 bp,编码有348个氨基酸,蛋白质分子量为37.44 kD,理论等电点5.05;LbFRK7编码的氨基酸序列包含有pfkB碳水化合物激酶家族高度保守的3个特异性区域,2个底物识别位点,4个ATP结合位点;LbFRK7与烟草和辣椒的FRP7基因序列相似性较高,达到90％;利用实时荧光定量技术分析发现,不同组织中LbFRK7基因均有表达,且果实中的表达量最高,根中最低;随着果实的发育,果实中LbFRK7基因的表达量呈先升后降的变化趋势,并于开花后15 d达到最高.在果实发育前期,LbFRK7基因的表达量与果糖含量的变化趋势相同,但在果实发育中期和后期,LbFRK7基因的表达量与果糖含量的变化趋势相反.相关分析结果显示,LbFRK7表达量与果糖和蔗糖含量的相关系数分别为-0.326和-0.339,但均未达到显著水平.研究表明,LbFRK7基因在枸杞果实发育过程中对果糖转化起到一定作用,特别是在果实成熟过程中对果糖含量的升高具有重要的作用.该研究结果为进一步探讨枸杞LbFRK7的功能及果糖代谢奠定了基础.

β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶作用于肽聚糖或几丁质,从其非还原末端水解产生β-D-N-乙酰氨基葡萄糖单体,该酶在细胞壁代谢过程中起重要作用,在医药和生物技术领域也有广泛的应用.[目的]克隆表达来源于兼性嗜碱菌Bacillus pseudofirmus 703的β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶NagZ703,为获得乙酰氨基葡萄糖单体奠定基础.[方法]以B.pseudofirmus 703基因组DNA为模板,克隆得到了β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因NagZ703,通过构建pET28a-nagZ703表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达NagZ703,利用镍柱纯化得到NagZ703纯蛋白,并对其酶学和生化性质进行分析.[结果]NagZ703与其同源蛋白多序列比对分析结果表明,NagZ703属于糖苷水解酶3家族(GH3),由2个结构域构成,催化活性中心由位于N端结构域的Arg232-His234-Arg318组成,和研究最多的Bacillus subtilis 168来源的BsNagZ氨基酸的序列相似性为37％.酶学性质分析表明,以对硝基酚-β-乙酰氨基葡萄糖苷(pNP-β-GlcNAc)为底物,NagZ703的最适反应温度和pH分别为60℃和pH 6.5,比酶活为10.79 U/mg,其Km和Vmax分别为0.276 mmol/L和0.612 mmol/(mg·min).该酶具有较好的稳定性,在50℃处理30 min,或在pH 6.0-10.5条件下,4℃保存12h后,仍保留80％以上的酶活力.EDTA不影响该酶的活性,推测其为非金属依赖酶,且Hg2+可完全抑制酶活性.[结论]本研究将兼性嗜碱菌Bacillus pseudofirmus 703 来源的β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶NagZ703在大肠杆菌中成功表达和纯化,并分析了其酶学性质;NagZ703的最适pH为6.5,没有表现出耐盐嗜碱的特征;NagZ703能水解胶体几丁质产生GlcNAc,为酶解生产GlcNAc提供了一条可行的思路.

为了研究鱼类foxO(Forkhead box O)基因的功能,基于组学测序及PCR扩增获得了团头鲂(Megalobrama amblycephala)foxO家族7个基因,foxO1a/b、foxO3a/b、foxO4和foxO6a/b的编码序列,分别为1965、1892、1929、1959、1878、1803和2157 bp.SMART结构域分析显示该家族基因属于典型的FoxO家族蛋白,具有保守的Forkhead、FOXO_KIX_bdg和FOXO-TAD结构域.系统进化分析显示,团头鲂FoxO与其他鲤科鱼类的同源基因具有较高的相似性.基于qPCR分析显示7个基因在所检测的9个组织中均有表达,但在各组织间存在表达差异,其中foxO4在血液中表达量最高,foxO6a在肝脏中表达量最高,而foxO6b在脑中表达量最高.在胚胎早期发育过程中,foxO1a和foxO1b、foxO3a和foxO3b、foxO6a和foxO6b的表达模式类似;而foxO4在发育早期,除了体节出现期、眼色素沉淀晚期、体节生成期和受精后10d表达量高外,其他时期表达量都比较低.经急性低氧处理后,团头鲂foxO家族基因的表达水平在所检测的大部分组织中呈现显著上调趋势,尤其是在肌肉组织中.基于JASPAR分析显示foxO家族基因都包含有Hif-1α结合位点,利用双荧光素酶报告系统对foxO1b启动子进行了验证,发现该基因受到Hif-1α调控.这些结果说明foxO基因可能通过Hif-1α介导的途径在团头鲂低氧应激中发挥重要作用.

该研究基于前期陆地棉根部低磷胁迫基因表达谱芯片差异表达序列数据分析及基因组数据库,从陆地棉'新陆早19'中克隆AP2/ERF基因(GhERF5),并对其基因组DNA与cDNA测序分析,借助生物信息学方法分析其基因结构和进化关系;采用半定量RT-PCR技术与荧光定量PCR(qRT-PCR)方法检测该基因于根、茎、叶、花等组织的表达变化以及低磷胁迫不同时间的相对表达.结果表明:(1)成功克隆获得一个AP2/ERF基因,命名为GhERF5;GhERF5基因开放阅读框序列长度963 bp,共编码320个氨基酸;该基因在177～241处存在一个AP2保守结构域,属于AP2家族.(2)多序列比对发现,GhERF5与亚洲棉GaERF5、雷蒙德氏GoraiERF5L相似性达到95％;系统进化树分析显示,陆地棉GhERF5蛋白序列与陆地棉GhERF5L(NP_001386305)的相似性最高,推测GhERF5基因是位于D亚基因组的基因.(3)半定量RT-PCR和qRT-PCR检测发现,GhERF5基因在陆地棉根、茎、叶和花中均有表达,但主要在叶中表达,其次为根和茎,花中的表达量最低;低磷处理0～72 h过程中,GhERF5基因在根部组织中的表达量呈先下降后上升再下降的变化趋势,且在低磷处理72 h时GhERF5的表达量仅为适磷处理的33％.研究表明,GhERF5基因属于低磷胁迫响应基因,可能参与陆地棉低磷胁迫下的应答反应.