目的:了解新设计的6组CpG分子在动物体内对新型冠状病毒（SARS-CoV-2）重组亚单位疫苗免疫效果的提升作用，以初步筛选出有潜力的新型CpG佐剂。方法:通过序列检索比对，确定人鼠同源的CpG基序，以不同的组合方式设计出6条不同的CpG寡聚脱氧核苷酸（CpG-ODN）序列，并人工合成相应6种CpG，分别与SARS-CoV-2重组亚单位疫苗联用，已上市的佐剂CpG1018作为阳性对照。以间隔2周的方式免疫BALB/c小鼠2次，免疫后每周取眼眶血检测IgG1和IgG2a指标。2针免疫后21 d处死小鼠，取眼球血检测结合抗体抑制率；取脾脏淋巴细胞进行酶联免疫斑点试验检测。结果:初次免疫后14 d，CpG6组小鼠血清IgG2a和IgG1水平分别为3.63±0.27和3.44±1.03，显著高于CpG1018组的2.06±1.30和2.06±0.39。加强免疫后14 d，CpG6组小鼠血清IgG2a水平为6.52±0.21，高于CpG1018组的6.33±0.40。在针对原型株的结合抗体抑制率指标上，初次免疫14 d、加强免疫21 d后，各组间差异存在统计学意义（ F=13.66、12.58、19.38和19.38， P均<0.001）。初次免疫14 d后，稀释10倍血清中CpG6组小鼠血清抑制率为（64.67±20.41）%，高于CpG1018组[（27.84±20.23）%]，差异有统计学意义（ t=2.70, P=0.031）；加强免疫21 d后，稀释1 000倍的血清中CpG6组小鼠血清抑制率针对原型株[（89.71±4.83）%]和Delta株[（79.04±6.32）%]的抑制率水平均显著高于CpG1018组[（70.84±17.20）%和（52.61±14.22）%] ，差异有统计学意义（ t=2.36, P=0.046； t=3.80, P=0.005）。酶联免疫斑点实验结果显示，CpG1018组针对SARS-CoV-2原性株敏感和Delta突变株敏感的特异性IFN-γ分泌细胞数与CpG6组相比，差异均无统计学意义（ t=0.76， P=0.469； t=0.78， P=0.459）；在特异性IL-2分泌细胞数上，两组差异亦无统计学意义（ t=0.70， P=0.503； t=0.90， P=0.395）。 结论:CpG6与SARS-CoV-2重组亚单位疫苗联用，能在疫苗初次免疫后更快速地在小鼠体内产生体液免疫应答，且加强免疫后体液免疫和细胞免疫效果均不弱于已上市的CpG1018佐剂。CpG6有望成为潜在的备选佐剂与疫苗联用。

甲状腺相关性眼病(TAO)的发生与发展及其表观遗传的关系密切。其中，TAO的发生与脱氧核糖核酸甲基化所引起的差异基因表达、非编码核糖核酸(RNA)调控及微小RNA(miRNA)相关。miRNA－155和miRNA－146a通过参与免疫炎症及脂肪组织的增殖分化等参与TAO的病理过程；miRNA－21的表达与TAO的活动性及严重程度相关；miRNA－130a和miRNA－27在TAO眼眶成纤维细胞的成脂分化及脂肪组织增生中发挥着重要作用；miRNA－199a－3p和miRNA－199a－5p可增加患者眼眶脂肪组织的氧化应激和血管生成；TAO患者的miRNA－183和miRNA－96在外周血分化簇(CD)4+T细胞中表达升高，参与TAO病程的调节免疫；miRNA－29可通过抑制转化生长因子β1信号通路抑制细胞纤维化；miRNA－143可通过直接靶向胰岛素样生长因子－1受体，间接降低促甲状腺素受体和核苷酸结合寡聚域样受体热蛋白结构域相关蛋白3浓度，调节TAO的炎症反应。此外，长链非编码RNA、环状RNA、转运RNA衍生片段及组蛋白修饰的表观遗传调控亦与TAO的发病相关。

目的 利用树突状细胞CAL-1的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)检测平台,以进一步应用于抑制性寡聚脱氧核苷酸的筛选.方法 以含有未甲基化CpG基序的寡聚脱氧核苷酸CpG(CpG ODN) 0800(3μg/ml)作为刺激剂,将其作用CAL-1细胞(2×105个细胞/孔),48 h后收集上清,作用于L929细胞(2×104个细胞/孔).培养18h,加入水疱性口炎病毒(VSV),培养72 h,检测570 nm处的吸光度值.结果 筛选条件确定为CpG ODN 0800终质量浓度为3μg/ml,CAL-1上清液1∶5倍稀释.L929细胞数在2×104个细胞/孔,反应时间为24 h.应用此条件成功筛选出自行设计的抑制性ODN-SAT05f.结论 建立实验体系,成功检测了自行设计的抑制ODN和CpG ODN诱导的CAL-1细胞的TNF-α的生物学活性.

目的:观察以非甲基化寡聚脱氧核苷酸基序(CpG oligodeoxynucleotides,CpG ODN)为佐剂联合融合蛋白胞质转导肽(CTP)-HBcAg18-27-Tapasin免疫乙型病毒性肝炎(hepatitis B virus,HBV)转基因小鼠的免疫反应.方法:HBV转基因小鼠随机分为5组,实验组:CTP-HBcAg18-27-Tapasin+CpG ODN组,对照组:CTP-HBcAg18-27-Tapasin,干扰素(IFN-α)组,CpG ODN组,空白组为生理盐水组.融合蛋白及CpG ODN经肌肉注射免疫小鼠,流式细胞仪检测病毒特异性T细胞反应(HBV-specific cytotoxic T cell,CTL)变化,全自动免疫分析仪检测血清乙肝表面抗原(hepatitis B virus surface antigen,HBsAg)水平,ELISA检测T淋巴细胞培养上清白介素(IL)-2、γ-干扰素(IFN-γ)水平,实时荧光定量PCR(real time quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测HBV DNA水平,免疫组化观察HBV转基因小鼠肝脏中HBsAg水平.结果:CTP-HBcAg18-27-Tapasin+ CpG ODN组中IFN-γ+CD8+双阳性T细胞百分比增高,细胞培养上清IL-2、IFN-γ水平升高,肝脏病理显示炎性细胞增多,免疫组化显示HBsAg表达水平明显下降,同时对血清HBsAg及HBV DNA水平进行比较,CTP-HBcAg18-27-Tapasin有明显抑制作用.结论:CpG-ODN作为佐剂可以增强融合蛋白CTP-HBcAg18-27-Tapasin诱导的HBV转基因小鼠抗病毒免疫应答.

目的 研究含有CpG基序的寡聚脱氧核苷酸2395(CpG ODN2395)对鼠巨细胞病毒(MCMV)肝炎新生小鼠的治疗作用及相关机制.方法 SPF级BALB/c新生小鼠,按窝随机分为对照组、病毒组和治疗组.对照组:腹腔注射9 g/L盐水20×10-6L隔日1次;病毒组:腹腔注射MCMV(病毒致半数细胞感染量TCID50=108.31/L)20×10-6L1次,从接种MCMV当日起隔日腹腔注射9 g/L盐水20×10-6L;CpG治疗组:腹腔注射MCMV(TCID50=108.31/L) 20×10-6L1次,从接种MCMV当日起隔日腹腔注射CpG ODN2395 20 mg/kg.观测小鼠的生长发育情况.HE染色观察肝脏病理,酶联免疫吸附试验检测小鼠血清ALT、IFN-α,PCR法检测肝脏MCMV DNA,反转录(RT)-PCR法检测肝脏IFN-α mRNA,Wester blot法检测肝脏的Toll样受体9(TLR9)和衔接蛋白-髓样分化标志物88 (MyD88)的表达水平.应用SPSS 16.0软件进行分析.结果 1.病毒组小鼠生长发育落后,体质量低于对照组和治疗组,7d、14 d时差异有统计学意义(F=18.919、25.543,P均＜0.05);治疗组发育介于对照组和病毒组之间,体质量均低于对照组,在7d时差异有统计学意义(t=3.187,P ＜0.05).2.病毒组小鼠血清ALT高于对照组和治疗组,治疗组血清ALT高于对照组,差异均有统计学意义(F=11.407、11.791、154.565,P均＜0.05).3.肝组织病理改变:病毒组肝组织病变活动性积分(HAI)值在第3天达高峰,以后逐渐下降;治疗组肝组织HAI均值也在第3天达高峰,但肝损害明显轻于病毒组,以后肝病变逐渐减轻,在第7天和第14天时HAI均值都显著低于病毒组.4.病毒组和治疗组小鼠3d、7d和14 d时肝脏MCMV DNAPCR检测阳性,3个时间点治疗组MCMV DNA负荷量均低于病毒组.5.病毒组和治疗组的3d时血清IFN-α达高峰,7d、14 d时渐下降;治疗组的血清IFN-α高于病毒组和对照组.6.病毒组和治疗组肝脏IFN-α mRNA表达水平在3d时增加,7d时达高峰,14 d时下降,3个时间点表达水平差异有统计学意义.治疗组IFN-αmRNA表达水平高于病毒组和对照组,病毒组高于对照组.7.治疗组肝脏TLR9表达水平高于病毒组和对照组,病毒组高于对照组.治疗组肝脏MyD88表达水平高于病毒组和对照组,病毒组高于对照组.结论 CpGODN2395可能提高TLR9的表达水平,通过MyD88依赖途径激活IFN-α的分泌,抑制MCMV的复制,减轻新生小鼠MCMV肝炎肝功能损害,改善肝脏病变和降低肝脏病毒负荷量具有抗MCMV的活性作用.

目的 探讨miR-582-5p在人甲状腺乳头状癌(PTC)组织中的表达及其靶向调控AKT3对PTC细胞增殖和凋亡的影响.方法 选取2017年1月至2017年10月海南省肿瘤医院手术切除的PTC组织及癌旁组织(距离肿瘤边缘1～2 cm)标本各10例,采用实时定量聚合酶链反应(PCR)检测PTC组织和癌旁组织中miR-582-5p表达;培养人PTC K1细胞,待细胞生长融合度达到50％～60％时分为miR-582-5p mimics组、miR-582-5p反义miRNA寡核苷酸(AMO)组、mimics对照组和AMO对照组,进行细胞转染;细胞转染后,采用实时荧光定量PCR检测4组K1细胞中miR-582-5p表达,四甲基偶氮唑盐法检测4组K1细胞活性,平板克隆形成实验检测4组K1细胞克隆能力,锥虫蓝染色检测4组K1细胞存活率,末端脱氧核苷酰基转移酶介导性dUTP切口末端标记法检测4组K1细胞凋亡情况,Western blot法检测4组K1细胞中miR-582-5p靶基因AKT3蛋白表达.结果 PTC组织和癌旁组织中miR-582-5p相对表达量分别为0.372±0.237、1.010±0.083,PTC组织中miR-582-5p相对表达量显著低于癌旁组织(P＜0.05).miR-582-5p mimics组、mimics对照组、AMO对照组和miR-582-5p AMO组K1细胞中miR-582-5p相对表达量分别为14.143±2.318、1.063±0.214、1.041±0.372、0.435±0.145;miR-582-5p mimics组K1细胞中miR-582-5p相对表达量显著高于mimics对照组、miR-582-5p AMO组和AMO对照组(P＜0.05),miR-582-5p AMO组K1细胞中miR-582-5p相对表达量显著低于AMO对照组和mimics对照组(P＜0.05),mimics对照组与AMO对照组K1细胞中miR-582-5p相对表达量比较差异无统计学意义(P＞0.05).细胞培养Oh时4组K1细胞活性比较差异无统计学意义(P＞0.05).细胞培养12、24、36、48 h时,miR-582-5p mimics组K1细胞活性显著低于miR-582-5p AMO组、mimics对照组和AMO对照组(P＜0.05),miR-582-5p AMO组K1细胞活性显著高于mimics对照组和AMO对照组(P＜0.05),mimics对照组与AMO对照组K1细胞活性比较差异无统计学意义(P＞0.05).mimics对照组、miR-582-5p mimics组、AMO对照组、miR-582-5p AMO组K1细胞克隆数量分别为18.47±5.25、5.10±4.97、19.53±6.45、32.63±7.74;miR-582-5pmimics组K1细胞克隆数量显著少于mimics对照组、AMO对照组和miR-582-5p AMO组(P＜0.05),miR-582-5p AMO组K1细胞克隆数量显著多于AMO对照组和mimics对照组(P＜0.05),mimics对照组与AMO对照组K1细胞克隆数量比较差异无统计学意义(P＞0.05).mimics对照组、miR-582-5p mimics组、AMO对照组和miR-582-5p AMO组K1细胞存活率分别为(76.46±13.53)％、(42.64±10.85)％、(77.82±10.35)％、(83.63±13.53)％;miR-582-5p mimics组K1细胞存活率显著低于mimics对照组、AMO对照组和miR-582-5p AMO组(P＜0.05),miR-582-5p AMO组K1细胞存活率显著高于AMO对照组和mimics对照组(P＜0.05);mimics对照组与AMO对照组K1细胞存活率比较差异无统计学意义(P＞0.05).mimics对照组、miR-582-5p mimics组、AMO对照组和miR-582-5p AMO组K1细胞凋亡率分别为(23.35±9.64)％、(42.63±13.38)％、(22.85±9.74)％、(10.84±3.64)％;miR-582-5p mimics组K1细胞凋亡率显著高于mimics对照组、AMO对照组和miR-582-5p AMO组(P＜0.05),miR-582-5p AMO组细胞凋亡率显著低于AMO对照组和mimics对照组(P＜0.05),mimics对照组与AMO对照组K1细胞凋亡率比较差异无统计学意义(P＞0.05).mimics对照组、miR-582-5p mimics组、AMO对照组和miR-582-5p AMO组K1细胞中AKT3蛋白相对表达量分别为1.000±0.005、0.531±0.162、1.010±0.071、1.432±0.141;miR-582-5p mimics组K1细胞中AKT3蛋白相对表达量显著低于mimics对照组、AMO对照组和miR-582-5p AMO组(P＜0.05),miR-582-5p AMO组K1细胞AKT3蛋白相对表达量显著高于AMO对照组和mimics对照组(P＜0.05),mimics对照组与AMO对照组K1细胞AKT3蛋白相对表达量比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 miR-582-5p在PTC组织中表达下调;miR-582-5p可通过靶向调控AKT3的表达而抑制人PTC细胞的增殖,并促进其凋亡.

瘦素作为一种促炎细胞因子,与肿瘤的免疫逃逸机制有关,但其在妊娠期母体免疫应答中的作用尚不明了.为了探讨瘦素在促进胎盘滋养细胞Ⅰb类组织相容性抗原HLA-G表达中的作用机制,揭示妊娠期母体免疫应答可能的调节方式,本研究通过分离胎盘CTB和EVT、采集胎盘外植体和培养细胞后,用寡聚脱氧核苷酸抑制瘦素表达,采用qRT-PCR、Western blotting和免疫荧光检测了HLA-G表达情况.研究发现,滋养细胞来源的JEG-3细胞系与25～50 ng/mL的重组瘦素进行体外孵育后显著促进了HLA-G mRNA和蛋白的表达,并且在抑制PI3K-Akt信号通路后,HLA-G表达显著降低,且在足月胎盘组织外植体中观察到类似的瘦素刺激作用;此外,用瘦素反义寡聚脱氧核苷酸处理的JEG-3细胞表现较低的H-LA-G表达水平;免疫荧光和qPCR分析证实了胎盘组织中瘦素的生物合成,进一步表明侵袭性绒毛外滋养层细胞在正常妊娠的前三个月期间是瘦素的主要来源.本研究表明,瘦素作为促进胎盘滋养细胞中HLA-G表达的自分泌/旁分泌信号,在母胎界面上调节免疫逃避机制中起重要作用.

利用一对寡核苷酸引物，肘含有αl一抗胰蛋白酶（α 1-AT）cDNA基因的质粒进行定点诱变，使358 Met-ATG突变为Arg-AGG。经过Sanger双脱氧链末端终止法进行DNA序列测定，表明α 1-AT被成功地定点突变。将突变得到的α 1-AT Pitts基因克隆入pBV220载体中并进行表达，得到了有抗原活性的凝血酶抑制剂a 1-AT Pitts表达产物。以一对引物代替两对引物，节省了引物合成的费用，方法简便、快速、经济。

目的：:探讨聚乙二醇对反义寡核苷酸的生物利用度的影响。方法：:针对多药耐药基因（mdr-1基因）的反义寡聚脱氧核糖核苷酸靶向第二外显子跨越起始密码子AUG的-6~9位点，在其5′端连接聚乙二醇（称为AP）；在少1个碱基（互补于mdr-1基因第一1位点）的AS’的5′端连接聚乙二醇（称为AP’）。从mdr-1 mRNA、p170、细胞内柔红霉素浓度以及细胞对阿霉素的敏感性等各个水平上比较这几种反义寡核苷酸对人耐药白血病细胞系K562/AO2的作用。结果：:AP’能够极显著地增加K562/AO2细胞对阿霉素的敏感性，并在一定程度上下调mdr-1和MRP mRNA表达，降低p170的水平，升高细胞内药物浓度；而AP几乎不产生效应。MTT法证实反义核酸对K562/AO2细胞没有任何细胞毒性。在AS’和AP’的3′端连接荧光素FITC（分别称为ASF’和APF’）。流式细胞术检测发现K562/AO2细胞对APF’的摄入明显多于ASF’，荧光显微镜下发现细胞浆和细胞核内都有荧光分布。结论：:mdr-1基因的错配反义寡核苷酸可以更好地增加耐药肿瘤细胞的药敏性；单纯寡核苷酸并不影响细胞生长；低分子量聚乙二醇能明显提高反义寡核苷酸的细胞摄入率。错配反义寡核苷酸能更好地抑制mdr-1表达的原因，有待进一步研究。

背景 激素是变应性联合气道疾病(ACAD)常用的治疗方法,但慢性ACAD出现气道重塑,可能影响其疗效,故有必要寻找与激素联合并有协同作用的新型免疫治疗.前期研究发现CpG寡聚脱氧核苷酸(CpG-ODN)抑制ACAD气道炎症,但对气道重塑的效果有待研究.目的 探讨CpG-ODN对慢性ACAD小鼠模型气道重塑的影响.方法 本研究时间为2016年4月—2018年3月.30只清洁级雌性BALB/c小鼠采用随机数字表法分为正常对照组(Control组)、ACAD组、变应性联合气道疾病CpG-ODN干预组(ACAD/CpG-ODN组)、变应性联合气道疾病布地奈德干预组(ACAD/BUD组)、变应性联合气道疾病CpG-ODN+BUD联合干预组(ACAD/CpG-ODN+BUD组).实验动物腹腔卵清蛋白(OVA)或磷酸盐缓冲液(PBS)致敏,鼻腔OVA/PBS 3周激发,随之6周雾化气道激发.ACAD/CpG-ODN组、ACAD/BUD组和ACAD/CpG-ODN+BUD组分别给予CpG-ODN、BUD和CpG-ODN+BUD滴鼻,其他组给予PBS滴鼻.每次鼻腔或气道激发后10 min内,对小鼠抓鼻和喷嚏次数进行计数.HE和PAS染色观察小鼠鼻腔组织的病理特点.HE、AB-PAS和Masson's染色观察小鼠肺组织病理变化,并行气道炎症评分.免疫组化检测肺组织转化生长因子β1(TGF-β1)和α平滑肌肌动蛋白(α-SMA),应用Image-Pro Plus图片分析软件定量评估,并进行症状评估.结果 各组小鼠抓鼻次数和喷嚏次数比较,差异均有统计学意义(P<0.01);其中ACAD组抓鼻次数和喷嚏次数均多于Control组,ACAD/CpG-ODN组、ACAD/BUD组、ACAD/CpG-ODN+BUD组抓鼻次数和喷嚏次数均少于ACAD组(P<0.05).HE和PAS染色显示,ACAD/CpG-ODN组和ACAD/BUD组鼻黏膜病理改变较ACAD组减轻,而ACAD/CpG-ODN+BUD组进一步减轻.HE、AB-PAS和Masson's染色显示,ACAD/CpG-ODN组和ACAD/BUD组肺组织病理改变较ACAD组减轻,而ACAD/CpG-ODN+BUD组进一步减轻.各组气道炎症评分比较,差异有统计学意义(P<0.01);其中ACAD组气道炎症评分高于Control组,ACAD/CpG-ODN组、ACAD/BUD组、ACAD/CpG-ODN+BUD组气道炎症评分均低于ACAD组(P<0.05).各组肺组织中TGF-β1和α-SMA表达水平比较,差异均有统计学意义(P<0.01);其中ACAD组TGF-β1和α-SMA表达水平均高于Control组,ACAD/CpG-ODN组、ACAD/BUD组、ACAD/CpG-ODN+BUD组均低于ACAD组(P<0.05).结论 CpG-ODN、布地奈德抑制慢性ACAD模型鼻部炎症和支气管肺组织气道重塑,两者可能具有协同作用.