目的:研究非甲基化胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸寡脱氧核苷酸(CpG-ODN，DSP30)在伴有骨髓浸润的B细胞非霍奇金淋巴瘤(B cell lymphoma，B-NHL)常规染色体检测中的价值。方法:搜集116例初诊时伴有骨髓浸润的B-NHL标本，设实验组应用DSP30联合IL-2刺激细胞增殖并培养72 h后进行染色体制备；对照组常规24 h培养处理并制备染色体，运用R显带技术对患者骨髓标本进行核型分析。结果:116例B-NHL中慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞淋巴瘤(CLL/SLL)47例，弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)19例，套细胞淋巴瘤(MCL)16例，滤泡细胞淋巴瘤(FL)13例，边缘区淋巴瘤(MZL)8例，伯基特淋巴瘤(BL)7例，淋巴浆细胞淋巴瘤/华氏巨球蛋白血症(LPL/WM)3例，毛细胞白血病(HCL)2例，富于T/组织细胞的大B细胞淋巴瘤1例；对照组116例行常规染色体检测，18例无分裂相，染色体成功分析中异常检出率为22.45%(22/98)，而经实验组(DSP30+IL-2)刺激的同期患者，无分裂相者减少至10例，异常检出率为59.43%(63/106)；在惰性淋巴瘤中，对照组检出率为16.21%(12/74)，实验组检出率为55.00%(44/80)，在非CLL/SLL的惰性淋巴瘤中，对照组检出率为17.95%(7/39)，实验组为52.50%(21/40)；无论骨髓侵犯比例多少，DSP30+IL-2都能够有效提高染色体异常检出率；实验组染色体异常累及数前5的依次为14、13、11、8和18号染色体，对照组依次为14、13、8、9和1号染色体；实验组检出具有特征性的染色体异常高于对照组。结论:DSP30+IL-2作为刺激剂应用于伴有骨髓浸润的B细胞淋巴瘤，可以明显提高染色体的异常检出率，特别在低比例肿瘤细胞浸润时，能有效减少异常染色体的漏诊率；DSP30+IL-2应用可检出更多不同种类的特异性遗传学改变，可以对淋巴瘤进行更准确的诊断分型，并为临床提供更精准的预后分层信息，也为少见的B-NHL特异性异常的研究提供遗传学证据。

目的:探讨Toll样受体9（TLR9）信号通路激活对肾小管细胞转录组的影响。方法:提取并培养小鼠原代肾小管上皮细胞，在细胞融合度达80%时分为两组，分别加入10 μL磷酸盐缓冲液（PBS，PBS对照组）和终浓度为5 μmol/L的TLR9激活剂胞嘧啶-鸟嘌呤寡脱氧核苷酸（CpG-ODN，CpG-ODN处理组）。提取细胞RNA后在Illumina平台进行测序，使用差异基因分析软件DEGseq分析两组细胞中基因的差异表达情况，通过Goatools和KOBAS在线软件分析差异基因所参与的信号通路，应用Homer软件预测转录因子。结果:与PBS对照组相比，CpG-ODN处理后有584个显著的差异表达基因，其中102个基因表达上调，482个表达下调。差异表达基因富集最显著的基因本体（GO）为β-干扰素响应、病毒响应或防御等炎症反应相关条目；京都基因与基因组百科全书数据库（KEGG）信号通路富集结果显示，富集系数最显著的信号通路包括2'-5'-寡腺苷酸合成酶活性、核糖核酸酶活性的调节、病毒生命周期的负调控、β-干扰素响应和对原生动物的防御反应等。转录因子预测结果显示，干扰素调节因子3（IRF3）是差异基因启动子序列上富集最显著的转录因子；IRF3是TLR9下游表达差异最显著的转录因子，转录因子21（TCF21）、锌指蛋白135（ZNF135）和阳性调节域4（PRDM4）等转录因子可能是TLR9信号通路的新候选靶标。结论:CpG-ODN激活TLR9信号通路，原代肾小管上皮细胞能直接响应CpG-ODN的刺激并发生转录组学变化，为进一步探究TLR9信号通路在脓毒症相关性急性肾损伤中的分子机制研究提供了基础。

目的:评价人工合成CpG寡聚脱氧核苷酸(CpG oligodeoxynucleotide, CpG-ODN)作为佐剂对灭活人腺病毒55型(human adenovirus type 55, HAdV-55)抗原诱导BALB/c小鼠免疫应答的影响。方法:HAdV-55 QS原型株经噬斑纯化构建疫苗候选株种子库，将疫苗候选株扩增产物经0.05% β-丙内酯灭活，纯化后制备成全病毒颗粒抗原。纯化HAdV-55抗原按低剂量组(0.2 mg/ml)和高剂量组(1 mg/ml)分别与CpG-ODN和氢氧化铝佐剂等体积混合，乳化后接种BALB/c小鼠，同时设PBS对照组，间隔21 d加强免疫1次。分别在初次免疫后21 d和35 d采集小鼠静脉血并分离血清，采集末次血清时分离小鼠脾脏淋巴细胞。通过酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)和微量中和试验检测免疫后小鼠血清中HAdV-55特异性IgG抗体和中和抗体水平，酶联免疫斑点法(enzyme linked immunospot assay，ELISpot)检测小鼠分泌IL-4和IFN-γ细胞因子淋巴细胞水平。结果:无论有无佐剂，随着免疫次数和接种剂量的增加，灭活HAdV-55抗原诱导BALB/c小鼠产生的病毒特异性IgG抗体显著升高；而中和抗体只有在加强免疫后才能达到可检测水平，中和抗体几何平均滴度(geometric mean titer，GMT)在1：11~1：23之间；使用不同佐剂对小鼠免疫应答有显著影响，低剂量抗原联合CpG-ODN和氢氧化铝混合佐剂可诱导小鼠产生较高的体液免疫和细胞免疫应答，其特异性IgG抗体和中和抗体水平分别是单独使用氢氧化铝佐剂组小鼠的2.2和1.8倍，分泌IFN-γ淋巴细胞数是其2.3倍。结论:新型CpG-ODN佐剂免疫能显著提高灭活HAdV-55全病毒抗原在BALB/c小鼠体内的免疫原性，同时使细胞免疫应答向偏向Th1型。

目的:了解新设计的6组CpG分子在动物体内对新型冠状病毒（SARS-CoV-2）重组亚单位疫苗免疫效果的提升作用，以初步筛选出有潜力的新型CpG佐剂。方法:通过序列检索比对，确定人鼠同源的CpG基序，以不同的组合方式设计出6条不同的CpG寡聚脱氧核苷酸（CpG-ODN）序列，并人工合成相应6种CpG，分别与SARS-CoV-2重组亚单位疫苗联用，已上市的佐剂CpG1018作为阳性对照。以间隔2周的方式免疫BALB/c小鼠2次，免疫后每周取眼眶血检测IgG1和IgG2a指标。2针免疫后21 d处死小鼠，取眼球血检测结合抗体抑制率；取脾脏淋巴细胞进行酶联免疫斑点试验检测。结果:初次免疫后14 d，CpG6组小鼠血清IgG2a和IgG1水平分别为3.63±0.27和3.44±1.03，显著高于CpG1018组的2.06±1.30和2.06±0.39。加强免疫后14 d，CpG6组小鼠血清IgG2a水平为6.52±0.21，高于CpG1018组的6.33±0.40。在针对原型株的结合抗体抑制率指标上，初次免疫14 d、加强免疫21 d后，各组间差异存在统计学意义（ F=13.66、12.58、19.38和19.38， P均<0.001）。初次免疫14 d后，稀释10倍血清中CpG6组小鼠血清抑制率为（64.67±20.41）%，高于CpG1018组[（27.84±20.23）%]，差异有统计学意义（ t=2.70, P=0.031）；加强免疫21 d后，稀释1 000倍的血清中CpG6组小鼠血清抑制率针对原型株[（89.71±4.83）%]和Delta株[（79.04±6.32）%]的抑制率水平均显著高于CpG1018组[（70.84±17.20）%和（52.61±14.22）%] ，差异有统计学意义（ t=2.36, P=0.046； t=3.80, P=0.005）。酶联免疫斑点实验结果显示，CpG1018组针对SARS-CoV-2原性株敏感和Delta突变株敏感的特异性IFN-γ分泌细胞数与CpG6组相比，差异均无统计学意义（ t=0.76， P=0.469； t=0.78， P=0.459）；在特异性IL-2分泌细胞数上，两组差异亦无统计学意义（ t=0.70， P=0.503； t=0.90， P=0.395）。 结论:CpG6与SARS-CoV-2重组亚单位疫苗联用，能在疫苗初次免疫后更快速地在小鼠体内产生体液免疫应答，且加强免疫后体液免疫和细胞免疫效果均不弱于已上市的CpG1018佐剂。CpG6有望成为潜在的备选佐剂与疫苗联用。

目的 探究Al(OH)3和CpG寡核苷酸免疫佐剂对结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)Ag85B蛋白免疫原性的影响.方法 将Mtb Ag85B蛋白在大肠埃希菌中进行重组表达,经亲和层析纯化后分别与Al(OH)3、CpG寡核苷酸(简称CpG)及Al(OH)3和CpG组成的复合佐剂[Al(OH)3+CpG]配伍,经皮下免疫BALB/c小鼠,初免后 28d加强免疫1 次,分别于初免后14、42 和56d采集免疫血清,采用ELISA检测血清中Ag85B特异性IgG、lgG1、IgG2a和IgG2b水平;初免后 42 d,每组取 4 只小鼠无菌分离脾淋巴细胞,利用酶联免疫斑点检测各组细胞中分泌γ干扰素和白介素 4 的淋巴细胞数量,采用流式细胞术检测各组细胞中CD4+T和CD8+T淋巴细胞的比例.结果 1.5 μg或 4.5 μg Ag85B重组蛋白与Al(OH)3+CpG配伍免疫后均诱导了高水平的Ag85B特异性IgG,免疫效果优于该蛋白与 2 种佐剂单独配伍组.1.5 μg或 4.5 μg Ag85B重组蛋白与 Al(OH)3+CpG配伍免疫血清中IgG亚型为IgG1、IgG2a和IgG2b混合型,其中IgG2a和IgG2b水平均高于Al(OH)3配伍免疫组,差异均有统计学意义(P均<0.001).酶联免疫斑点检测显示,4.5 μg Ag85B重组蛋白与Al(OH)3+CpG配伍免疫小鼠的脾淋巴细胞中分泌γ干扰素和白介素 4 的淋巴细胞数量均高于Al(OH)3配伍免疫组,差异均有统计学意义(P均<0.05);流式细胞术检测显示,1.5 μg或4.5 μg Ag85B重组蛋白与Al(OH)3+CpG配伍免疫小鼠的T淋巴细胞中CD4+T淋巴细胞的占比均高于Al(OH)3 配伍免疫组.结论 Al(OH)3 和CpG联合使用可能协同增强Ag85B重组蛋白的免疫原性.

CpG寡聚脱氧核苷酸(CpG oligonucleotide,CpG ODN)是由人工合成的含有非甲基化CpG的ODN,在疾病预防及临床治疗领域具有广阔的应用前景.其中B型CpG ODN因具有强免疫刺激作用等特点被广泛用于疫苗研究中,且部分基序已进入临床试验阶段.随着临床治疗中的细菌耐药性问题日益严重,以B型CpG ODN为佐剂开展细菌性疫苗研发成为研究热点.本文对现有的B型CpG ODN 1826、2006、2007和1668等基序在细菌性疫苗中的研究现状及相关研究进展作一综述,以期为后续细菌性疫苗的开发及应用提供参考.

目的 构建装载人乳头瘤病毒(HPV)16 E7多肽和佐剂CpG-寡脱氧核苷酸(ODN)的甘露糖修饰的脂质体,在局部晚期宫颈癌小鼠模型中评估接种该疫苗后的效果.方法 研究时间为2022年3-11月.选取6～8周龄的24只雌性C57BL/6小鼠,建立小鼠宫颈癌模型,构建装载HPV16 E7多肽和佐剂CpG-ODN的甘露糖修饰的脂质体,小鼠肿瘤体积达到200 mm3时接种该疫苗,采用流式细胞术检测疫苗对小鼠免疫功能的影响.结果 透射电镜下,Lip E7/CpG显示出球形结构,负染色后,脂质体大小在60～120nm的直径范围内变化,动态光散射测量脂质体直径为(122.21±8.37)nm.在(4±2)℃条件下储存,7d内Lip E7/CpG均能保持良好的稳定性.尤其是粒径和EE在7 d内几乎没有变化,确保了整个实验过程中脂质体疫苗的一致性.接种后12、14、16、18、20、22、24、26、28 d,肿瘤体积比较差异有统计学意义(P＜0.05),小鼠体质量比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 甘露糖修饰的脂质体共同递送HPV16 E7多肽和佐剂CpG-ODN可增强小鼠抗晚期宫颈癌的活性,研究为不断优化治疗性HPV疫苗设计、增强治疗性HPV疫苗效力提供了重要基础,为宫颈癌的防治提供了新途径,也为开发有效靶向树突状细胞的新型疫苗提供了新思路.

目的 考察B淋巴细胞内免疫复合物(IC)对Toll样受体9(TLR9)激动剂CpG寡脱氧核苷酸(ODN)诱导的CD40和CD80高表达信号通路的抑制作用.方法 给小鼠腹腔注射CpG ODN和IC后,用免疫磁珠法分选小鼠脾脏CD19+B淋巴细胞,流式细胞术检测B淋巴细胞表面CD40和CD80的表达.免疫磁珠法分选野生型和免疫球蛋白G Fc段受体Ⅱb(FcγRⅡb)缺陷小鼠脾脏B淋巴细胞,体外用CpG ODN和(或)IC刺激后,蛋白质印迹法检测细胞内相关蛋白激酶的磷酸化水平.用JNK抑制剂(SP600125,50μmol/L)和p38抑制剂(SB203580,20 mg/L)处理后,流式细胞术检测CpG ODN活化B淋巴细胞表面CD40和CD80的表达.结果 体内实验结果显示,IC抑制CpG ODN活化B淋巴细胞表面CD40和CD80的表达(P均<0.05).IC抑制B淋巴细胞内CpG ODN诱导的JNK和p38磷酸化水平,但不能抑制FcγRⅡb缺陷小鼠B淋巴细胞JNK和p38的磷酸化水平.SP600125和SB203580处理后,CpG ODN活化B淋巴细胞表面CD40和CD80的表达均下调(P均<0.01).结论 B淋巴细胞内IC通过抑制JNK和p38通路抑制TLR9激动剂CpG ODN诱导的CD40和CD80表达.

目的 利用树突状细胞CAL-1的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)检测平台,以进一步应用于抑制性寡聚脱氧核苷酸的筛选.方法 以含有未甲基化CpG基序的寡聚脱氧核苷酸CpG(CpG ODN) 0800(3μg/ml)作为刺激剂,将其作用CAL-1细胞(2×105个细胞/孔),48 h后收集上清,作用于L929细胞(2×104个细胞/孔).培养18h,加入水疱性口炎病毒(VSV),培养72 h,检测570 nm处的吸光度值.结果 筛选条件确定为CpG ODN 0800终质量浓度为3μg/ml,CAL-1上清液1∶5倍稀释.L929细胞数在2×104个细胞/孔,反应时间为24 h.应用此条件成功筛选出自行设计的抑制性ODN-SAT05f.结论 建立实验体系,成功检测了自行设计的抑制ODN和CpG ODN诱导的CAL-1细胞的TNF-α的生物学活性.

Toll样受体(Toll-like receptors,TLR)作为一类能识别病原体的模式识别受体广泛存在于抗原提呈细胞中,对介导固有免疫应答和适应性免疫应答起到了重要作用.人类一共有10种TLR,可分为分布于胞膜表面的受体以及分布于胞内区室的受体两类.其中TLR7和TLR9广泛分布于人B细胞胞内,对B细胞的功能起到重要作用.TLR可通过TLR-MyD88信号通路和非MyD88途径传导信号,作用于B淋巴细胞,促进其增殖、分化、抗体分泌等.TLR7、TLR9可通过其激动剂,如含有CpG的脱氧寡核苷酸(CpG-containing oligodeoxynucleotides,CpG-ODN),刺激记忆性B细胞和幼稚B细胞增殖,继而促进浆细胞的转化,降低其凋亡,促进B细胞分泌IL-6和IL-10.不仅如此,TLR7、TLR9还可刺激B细胞分泌免疫球蛋白IgG、IgM,使抗体向IgG2a转换,阻断了IgGl和IgE的产生.近期研究证实,TLR-MyD88信号通路与STAT3信号通路有关.而STAT3基因缺陷可导致常染色体显性遗传的高IgE综合征(hyper-IgE syndrome,HIES)的发病.HIES是一类以IgE水平异常增高、湿疹、反复皮肤感染、肺炎合并多系统症状为特点的原发性免疫缺陷病.TLR-MyD88-STAT3信号通路的异常可能与STAT3缺陷的HIES的发病机制密切相关.为此,该文对TLR对B细胞的激活作用以及与STAT3和HIES的关系作一综述.