目的 制备抗猴痘病毒(monkeypox virus,MPXV)A35R蛋白单克隆抗体并建立其双抗体夹心ELISA检测方法,同时对方法进行验证.方法 原核表达MPXV A35R蛋白并免疫BALB/c小鼠,经杂交瘤技术制备抗A35R蛋白单克隆抗体,对单克隆抗体的特异性、结合活性进行鉴定;建立双抗体夹心ELISA检测方法,对该方法的线性范围、检测限、专属性、准确性、精密度进行验证.结果 制备了 7 株抗MPXV A35R单克隆抗体.Western blot鉴定结果显示,7株单克隆抗体均与MPXV A35R蛋白及灭活MPXV发生特异性反应;7株单克隆抗体结合活性为11.35～27.73 ng/mL;抗体经配对筛选后,确定以7G5和2F5为最佳配对抗体,用于建立双抗体夹心ELISA方法.该方法对灭活MPXV抗原最低检测限为1.250×104 TCID50/mL,对MPXV A35R蛋白最低检测限为 1.95 ng/mL,线性范围为 3.91～125.00 ng/mL,线性回归方程为y=1.732 0x-0.920 8,R2=0.984 3;该方法专属性较强且不与其他病毒及蛋白发生交叉反应;准确性验证结果显示,病毒抗原回收率为 96.94%～110.04%;批间CV为 0.26%～8.13%,批内CV为 2.10%～5.48%.结论 成功制备了抗MPXV A35R蛋白单克隆抗体,建立了双抗体夹心ELISA检测方法.验证结果显示,该方法具有较高的灵敏度、准确度、重复性及专属性,可用于以A35R蛋白为基础的猴痘亚单位疫苗的生产质量控制.

目的 分析477例ABO血型鉴定自动审核不通过的原因及其影响因素,初步建立相应的处理流程.方法 依据并参考临床实验室定量检验结果的自动审核(WS/T 616-2018)的行标,制定了我室ABO血型鉴定的自动审核规则.收集2021年1月至2022年12月北京协和医院检验科ABO血型鉴定自动审核不通过的共计477患者的临床资料,分析ABO血型鉴定不通过的原因,结合患者的临床诊断特征,制定相应的处理流程.结果 按原因分类:抗原所致为79例,其中抗原减弱或缺失为50例,亚型为29例;抗体所致为398例,其中血清抗体减弱/缺失为305例,冷凝集素(冷抗体)为23例/自身抗体为27例,红细胞同种抗体为43例.按患者所患疾病类型:肿瘤为94例占19.7％;血液病为59例占12.4％;免疫性疾病为43例占9％;内分泌疾病为25例占5.2％;妇科疾病及妊娠为72例占15.1％;其他疾病为184例占38.6％.结论 在477例ABO血型鉴定自动审核不通过的原因中,以年龄变化导致的生理变化最为常见;此外不规则抗体、ABO亚型、抗原减弱也可造成此结果.在血型鉴定工作中,应综合考虑患者的情况,针对其原因选择相应辅助实验方法进行鉴定,以提高ABO血型的鉴定准确性,保证临床用血安全.

肾移植患者需要服用多种免疫抑制剂抗排斥治疗，是各类感染的高危人群。罕见病原体感染、混合感染是诊断及治疗的难点，抗生素覆盖病原微生物不准确和血药浓度不足均会影响疗效，增加病死率，及时且精准的鉴定病原微生物至关重要 [1]。现阶段病原微生物检测最常见的方法是体液涂片和培养，组织病理学检查是侵袭性真菌感染确诊的金标准，聚合酶链式反应（PCR）能够快速、准确、高灵敏度的找到特定感染病原体，抗原抗体检测可区分急性和既往感染。但体液培养耗时长、灵敏度差、抗生素治疗后送检标本的阳性率更低。怀疑侵袭性真菌感染时，并非所有患者都能获取感染组织标本送检组织病理学检查。PCR难以发现未知病原微生物。免疫抑制患者的病原微生物抗体检测，诊断效率亦欠佳 [2]。宏基因组二代测序技术（mNGS）可直接提取送检样本中全部微生物的核酸进行高通量测序，快速且客观的检测样本中的病原微生物，广覆盖、无偏倚、无需假设。近年来已广泛应用于急危重症和免疫缺陷患者感染的鉴别诊断中 [3,4]。本文报道1例肾移植患者，间断发热1个月，右侧鼻翼及鼻腔丘疹样溃疡形成，双侧眼睑粘膜红肿，CT见两肺大片状及结节样实性密度影，通过mNGS鉴定出马尔尼菲蓝状菌、烟曲霉、哥伦比亚分枝杆菌混合感染，调整抗生素后病情好转，现进行分析总结。

目的:建立Junior血型基因分型技术，用于Jr(a-)稀有血型的鉴定和筛查。方法:选取2021年1月至2021年5月于深圳市血液中心无偿献血的O型RhD＋健康受试者( n＝1 568)和1个疑难交叉配血家系( n＝3)，共1 571例，为研究对象。用血清学检测技术进行先证者血型鉴定、意外抗体鉴定以及抗体效价测定。用聚合酶链反应-序列特异性引物(PCR-SSP)技术进行先证者 RHD基因分型。建立 ABCG2基因编码区测序和PCR-SSP基因分型技术，对先证者及其家系成员进行基因型检测，并在深圳地区无偿献血者人群( n＝1 568)中开展Jra抗原阴性的稀有血型献血者筛查。 结果:先证者ABO血型为B型，RhD血型为部分D( RHD*DVI.3/RHD*01N.01)，Junior血型Jra抗原为阴性，血浆存在抗-D合并抗-Jra。 ABCG2基因测序发现先证者等位基因型为 ABGG2*01N.01/ABGG2*01N.01[c.376C>T(p.Gln126X)纯合变异]，为亚洲人群中最常见的Jr(a-)血型等位基因。在深圳地区无偿献血者人群中进行筛查，无Jr(a-)稀有血型献血者检出。通过杂合子的统计分析，发现 ABCG2*01N.01(c.376T)的等位基因型频率约为0.45%，这一分子背景的Jr(a-)稀有血型在深圳地区的出现频率约为0.2‰。 结论:本研究发现国内首例部分DVI.3型且Jr(a-)稀有血型，并成功建立Junior血型 ABCG2基因编码区测序以及PCR-SSP基因分型技术。

分析1例怀疑由免疫球蛋白G（IgG）抗-E抗体引起的新生儿溶血病。患儿ABO血型为O型，Rh血型分型为CcDEe，其母亲ABO血型为A型，Rh血型分型为CCDee，排除ABO、RhD溶血。对患儿外周血进行新生儿溶血三项实验，发现存在与患儿不相容的抗体，对患儿血浆、患儿红细胞放散液及其母亲血浆不规则抗体筛查及抗体特异性鉴定，结果均为IgG-E。该患儿溶血病由母体的IgG-E抗体引起，且因产前未进行不规则抗体筛查而未被发现。提倡孕妇产前进行不规则抗体筛查，有助于预防或早期诊断新生儿溶血，早期干预，减少围产儿并发症的发生。

目的:制备靶向甲型流感病毒血凝素(hemagglutinin，HA)蛋白的广谱抗体FHA3，并对其进行鉴定。方法:依据单链抗体(single-chain antibody fragment，scFv)序列信息，PCR扩增FHA3重链和轻链可变区序列，连入抗体哺乳细胞表达载体pFRT-IgG1κ，构建重组表达质粒pFRT-IgG1κ-FHA3。利用瞬时高效表达系统ExpiCHO以及亲和纯化技术获取抗体蛋白FHA3。ELISA检测FHA3与甲型流感病毒HA的结合。假病毒感染宿主细胞试验检测抗体FHA3的体外中和活性。结果:蛋白质电泳结果显示制备获取了高纯度FHA3。FHA3与甲型流感病毒H1N1 HA、H2N2 HA、H3N2 HA、H5N1 HA、H7N9 HA以及H9N2 HA均识别结合，且呈浓度依赖效应。FHA3具有较好的体外中和活性，在低浓度下(5 μg/ml)能有效阻断H5N1以及H7N9假病毒入侵靶细胞，在0.012 5 μg/ml浓度下能有效阻断H1N1假病毒入侵靶细胞。结论:获得1株具有体外中和活性的靶向甲型流感病毒HA蛋白的广谱抗体。

目的:探讨转录因子CCCTC结合因子(CTCF)对翼状胬肉中B淋巴细胞瘤-2基因( Bcl-2)表达的调控及其分子机制。 方法:纳入2017年6月至2019年2月在长沙市第一医院眼科行翼状胬肉切除联合自体角膜缘干细胞移植术治疗的原发性翼状胬肉患者22例，术中收集翼状胬肉组织作为翼状胬肉组；同期纳入因结膜裂伤、眼球破裂伤或眼球穿通伤就诊的眼外伤患者20例，取眼外伤修复手术过程中切取的少量正常结膜组织作为正常结膜组。分别采用实时荧光定量PCR和Western blot法检测各组样本中CTCF及Bcl-2的表达水平；采用亚硫酸氢盐处理后测序法(BSP)检测各组样本中Bcl-2启动子DNA甲基化水平。分离并培养翼状胬肉成纤维细胞，使用波形蛋白抗体进行免疫组织化学鉴定成纤维细胞。将分离培养的细胞分成2个组，CTCF干扰组转染CTCF干扰质粒，对照组转染对照质粒。采用实时荧光定量PCR法和Western blot法检测CTCF、Bcl-2表达水平；采用细胞计数试剂盒8检测各组培养12、24和48 h细胞增生活性；采用BSP检测各组样本中Bcl-2启动子DNA甲基化水平。比较各组各指标差异，采用Pearson线性相关分析探讨翼状胬肉组织中Bcl-2 mRNA与CTCF蛋白及 Bcl-2基因启动子甲基化水平的相关性。 结果:翼状胬肉组CTCF mRNA及蛋白相对表达水平分别为7.23±3.34和0.92±0.21，明显高于正常结膜组的1.10±0.44和0.28±0.07，差异均有统计学意义( t＝－8.136、－13.025，均 P<0.01)。翼状胬肉组Bcl-2 mRNA及蛋白相对表达水平分别为10.27±4.64和0.95±0.27，高于正常结膜组的1.10±0.41和0.32±0.14，差异均有统计学意义( t＝－8.789、－10.782，均 P<0.01)。翼状胬肉组CTCF蛋白相对表达量与Bcl-2 mRNA相对表达量呈显著正相关( r＝0.746， P<0.01)。翼状胬肉组Bcl-2启动子区DNA甲基化水平为0.65±0.09，低于正常结膜组的0.83±0.06，差异有统计学意义( t＝7.408， P<0.01)。翼状胬肉组Bcl-2启动子DNA甲基化水平与Bcl-2 mRNA相对表达量呈显著负相关( r＝－0.635， P<0.01)。CTCF干扰组CTCF及Bcl-2 mRNA相对表达水平为0.37±0.03和0.53±0.06，明显低于对照组的1.02±0.06和0.99±0.07，差异均有统计学意义( t＝20.035、9.029，均 P<0.01)；CTCF干扰组CTCF及Bcl-2蛋白相对表达水平为0.23±0.06和0.56±0.07，低于对照组的0.52±0.05和0.92±0.12，差异均有统计学意义( t＝6.914、4.719，均 P<0.01)。CTCF干扰组转染后12、24和48 h细胞活力分别为0.10±0.01、0.17±0.01和0.38±0.04，低于对应时间点对照组的0.12±0.01、0.29±0.01和0.85±0.06，差异均有统计学意义( t＝3.718、18.350、15.621，均 P<0.01)。CTCF干扰组Bcl-2启动子DNA甲基化水平为0.75±0.04，明显高于对照组的0.61±0.03，差异有统计学意义( t＝－4.472， P<0.05)。 结论:翼状胬肉中CTCF高表达，其可能通过下调启动子DNA甲基化水平介导Bcl-2异常表达。

目的:研究循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTCs)与神经母细胞瘤(neuroblastoma，NB)临床及病理特征的相关性，探讨CTCs检测在NB诊疗中的应用价值。方法:本研究为回顾性研究。选取2021年1月至2022年9月重庆医科大学附属儿童医院肿瘤外科收治的87例经病理检查确诊的NB患儿作为研究对象，并将其设为病例组，收集患儿年龄、性别、肿瘤分期、转移、生存情况等临床资料，以及尿香草扁桃酸(vanillyl mandelic acid，VMA)水平、CTCs检测结果等。选取20名健康儿童作为对照组。两组均采用乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)抗凝的真空采血管采集静脉血6 mL，采用CytoSorter ? CTCs检测系统，通过细胞表面波形蛋白(cell surface vimentin，CSV)抗体纳米微流控芯片免疫捕获CTCs，采用anti-CSV Ab和anti-GD2 Ab鉴定肿瘤细胞。使用SPSS 26.0和Graphpad Prism 9进行数据处理和图表制作。 结果:CTCs阳性率病例组为67.8%(59/87)，对照组为5%(1/20)，差异有统计学意义( P<0.01)。CTCs阳性率与年龄、肿瘤大小、国际神经母细胞瘤危险度分级协作组(International Neuroblastoma Risk Group，INRG)分期及危险度分层、骨髓转移、骨转移、生存状态、VMA水平相关( P<0.05)；与性别、肿瘤类型、Shimada分型、淋巴结转移、Mycn扩增与否无关( P>0.05)。CTCs的检出数量在年龄≥18个月、Shimada分型为预后不良型，肿瘤长泾大于5 cm、伴有骨/骨髓转移、更高INRG分期及危险度分层的患儿中明显升高，差异有统计学意义( P<0.05)。CTCs检出数量与生存状态明显相关，存活患儿CTCs检出数量明显低于死亡患儿，差异有统计学意义( P＝ 0.002)。本组87例NB患儿最长随访时间2.5年，总体生存率为53.9%(62/87)，CTCs阳性患儿生存率明显低于CTCs阴性患儿(46.8%比87.1%)，差异有统计学意义( P＝0.001)。相比24 h尿VMA，CTCs检出率对于NB有更高的诊断效能( P＝0.009)。 结论:CTCs在NB患儿中有较高检出率，其阳性率与临床不良预后结局相关。CTCs可以作为判断NB预后的一个指标。

目的:建立猪带绦虫（Ts）14-3-3.2原核表达系统，并观察Ts14-3-3.2蛋白在Ts成虫和囊尾蚴中的表达情况。方法:在遵义医科大学寄生虫学教研室前期获得Ts14-3-3.2基因序列的基础上，采用基于PCR的精确合成（PAS）方法全基因合成Ts14-3-3.2基因，经限制性内切酶 NdeⅠ和 XbaⅠ双酶切后连接质粒pCzn1，构建重组质粒pCzn1-Ts14-3-3.2。将重组质粒转化至大肠埃希菌ArcticExpress感受态细胞中诱导表达，采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和考马斯亮蓝染色分析和鉴定表达产物，通过镍（Ni）柱亲和纯化获得纯化Ts14-3-3.2重组蛋白。采用该纯化重组蛋白免疫新西兰大白兔，制备Ts14-3-3.2重组蛋白多克隆抗体，采用免疫印迹法（Western blot）检测Ts14-3-3.2蛋白在Ts成虫和囊尾蚴中的表达情况。 结果:成功构建重组质粒pCzn1-Ts14-3-3.2，诱导表达后菌体上清液和沉淀均在相对分子质量约29.31 × 10 3处出现Ts14-3-3.2目的蛋白条带。纯化后带有His标签的Ts14-3-3.2重组蛋白能被抗His单克隆抗体识别，获得效价为1∶512 000的Ts14-3-3.2重组蛋白多克隆抗体。Western blot结果显示，Ts14-3-3.2蛋白在Ts成虫和囊尾蚴中均有表达。 结论:成功建立Ts14-3-3.2原核表达系统，获得了高纯度、高效价的Ts14-3-3.2重组蛋白多克隆抗体。Ts14-3-3.2蛋白在Ts成虫和囊尾蚴阶段均有表达。

“分泌蛋白”是指由活细胞所分泌的丰富的、具有复杂生理功能的一系列蛋白，包括细胞因子、趋化因子、激素、消化酶、抗体、胞外蛋白酶和毒素等，这些蛋白参与细胞信号转导、粘连、迁移和免疫防御等多种生物过程，发挥重要的生理作用。近年来，蛋白组学技术飞速发展，极大地促进了分泌蛋白组学的研究和发展。分泌蛋白组学已经被广泛应用于人类生殖领域的探索，并鉴定了许多蛋白质，这些蛋白质可能是人类辅助生殖技术成功妊娠的潜在生物标志物或治疗目标。本文综述了分泌蛋白组学在人卵泡液、胚胎发育及子宫内膜分泌物中的研究进展，为分泌蛋白组学在人类生殖领域研究中的深入应用提供借鉴。