目的:探讨靶向肝癌干细胞的紫杉醇纳米粒的制备及其对肝癌HepG2细胞（CD133阳性亚群占8%）和Huh-7细胞（CD133阳性亚群占65%）的效果。方法:应用单乳溶媒挥发法制备聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物装载的紫杉醇纳米粒，采用1-乙基-3-（3-二甲基氨丙基）-碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺（EDC/NHS）交联法制备由抗CD133抗体修饰的紫杉醇纳米粒，即靶向纳米粒。检测纳米粒的表征及理化特性（包封率和载药率、粒度分布、形态、体外释放）。将肝癌Huh-7和HepG2细胞与紫杉醇纳米粒或靶向纳米粒共培养，应用流式细胞术分析肝癌细胞对纳米粒的摄取和累积，并检测CD133阳性细胞比例，应用平板克隆形成实验分析细胞存活情况。结果:扫描电镜检测显示，靶向纳米粒的粒径为（429.26±41.53）nm，Zeta电位为-11.2 mV，具有球形形态和较高的包封率[（87.53±5.90）%]。流式细胞术检测显示，37 ℃时，Huh-7细胞靶向纳米粒组的荧光强度较紫杉醇纳米粒组荧光强度高（13 397±720比6 898±604），差异有统计学意义（ P<0.05）；37 ℃时，HepG2细胞紫杉醇纳米粒和靶向纳米粒组间荧光强度差异无统计学意义（7 899±343比8 432±516， P>0.05）。Huh-7细胞靶向纳米粒组CD133阳性细胞比例较紫杉醇纳米粒组低[（15.7±2.6）%比（54.9±7.4）%]，差异有统计学意义（ t=7.31， P=0.008）；HepG2细胞两组间差异无统计学意义（ P>0.05）。平板克隆形成实验结果显示，靶向纳米粒作用后，各时间点Huh-7细胞存活率低于紫杉醇纳米粒作用后，差异有统计学意义（ F=5.56， P=0.009）；紫杉醇纳米粒和靶向纳米粒作用后，HepG2细胞存活率差异无统计学意义（ F=1.19， P=0.142）。 结论:制备的靶向肝癌干细胞的纳米粒对肝癌Huh-7细胞有良好抑制作用。

目的 制备运载双层抗原的CS-PLGA微球制剂,并对其进行相关表征鉴定.方法 通过复乳法结合溶剂挥发法制备得到多孔微球后,在4 ℃水浴条件下装载抗原,利用抗原浓度梯度介导的物理扩散促进抗原进入微球内部,并通过静电作用结合在微球外表面,形成内外双层抗原运载.根据聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)材料玻璃转化温度这一特性,促进多孔微球表面孔道在48 ℃条件下发生愈合,使其形成闭合的微球制剂,再将得到的微球制剂与壳聚糖溶液混悬镀层,进行阳离子修饰,逆转微球表面负性电位.通过扫描电子显微镜、动态光散射粒度仪等检测微球形态、粒径分布和电位变化,采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定抗原是否装载至微球制剂中,采用荧光标记的BSA和荧光标记的PLGA材料进行激光共聚焦显微镜观察抗原装载后的分布情况,通过BCA法检测微球制剂的包封率和载药率.结果 扫描电镜和光学显微镜结果显示多孔微球成孔良好,粒径大小为(73.94±0.81)nm,多分散性指数为0.038±0.004.Zeta电位由负转正说明壳聚糖已被成功镀层至微球表面.经过SDS-PAGE、激光共聚焦显微镜等证实BSA已被成功运载.经micro BCA试剂盒检测后多孔微球包封率为(3.01±0.04)％,载药率为(1.50±0.02)％.结论 成功制备得到运载双层抗原的CS-PLGA制剂,为后续缓控释制剂研究提供新思路.

目的:为解决野生型B细胞成熟抗原(BCMA)被γ分泌酶切割导致表达不稳定的问题,构建抵抗γ分泌酶切割的BCMA突变体并构建靶细胞,用于评价BCMA CAR-T细胞的杀伤功能.方法:将野生型BCMA的穿膜域替换为人CD8α穿膜域,构建抵抗γ分泌酶切割的BCMA突变体(BCMA-CD8α TM),构建过表达该突变体的U266(U266BCMA Mut)、K562(K562BCMA Mut)、SKOV3(SKOV3BCMA Mut)和CHO(CHOBCMA Mut)细胞;构建装载NFAT-EGFP报告基因的BCMA CAR Jurkat细胞(BCMA-CAR-Jurkat-Reporter)与U266BCMA Mut细胞共培养,采用FCM检测该细胞中EGFP表达水平以指示NFAT激活水平,荧光素酶法检测BCMA CAR-T细胞对Luciferase标记的K562BCMA Mut细胞的杀伤作用,实时无标记动态细胞分析技术(RTCA)检测BCMA CAR-T细胞对SKOV3BCMA Mut和CHOBCMA Mut细胞的杀伤作用.结果:应用γ分泌酶抑制剂LY411575抑制γ分泌酶活性,显著增强野生型U266细胞表面BCMA表达水平,平均荧光强度上调10倍以上;但撤除抑制剂后BCMA表达水平逐渐降低(P<0.01);BCMA-CD8α TM突变体可抵抗γ分泌酶的切割作用,在U266细胞表面稳定表达(P>0.05);U266细胞及过表达BCMA-CD8α TM的U266细胞与BCMA-CAR-Jurkat-Reporter细胞共培养后都可激活Reporter系统、增强EGFP表达,但该效应在BCMA-CD8α TM过表达的U266细胞中更显著(P<0.01);BCMA-CD8α TM在BCMA表达阴性的K562、SKOV3和CHO 3种靶细胞中成功过表达,且在LY411575处理下该突变体的表达水平仅有小幅度升高;荧光素酶法检测结果显示,不同效靶比下,BCMA CAR-T细胞均可特异、高效杀伤过表达BCMA-CD8α TM的K562细胞;RTCA结果显示,不同效靶比下,BCMA CAR-T细胞均可有效识别、杀伤过表达BCMA-CD8α TM的SKOV3和CHO细胞,但同等效靶比下的Mock-T细胞无此效应.结论:本实验构建的BCMA-CD8α TM突变体能够抵抗γ分泌酶的切割,在多种靶细胞表面稳定表达,为评价BCMA CAR-T细胞体外杀伤的有效性和特异性提供多种检测手段.

以谷胱甘肽修饰的CdTe量子点(GSH-CdTe QDs)与金纳米粒(AuNPs)形成复合材料(AuNPs@GSH-CdTe)为信号标记物,并在还原氧化石墨烯(rGO)和AuNPs双重信号放大的作用下,建立了一种高灵敏检测前列腺特异性抗原(PSA)的三明治免疫夹心式电化学方法.在rGO/AuNPs表面固定二抗蛋白(Ab2),捕获目标物PSA和标记有一抗蛋白(Ab1)的AuNPs@GSH-CdTe信号物,形成"三明治"免疫夹心结构.经HNO3溶解后,采用方波溶出伏安法(SWSV)测定酸解的Cd2+的峰电流用于定量分析PSA.其中AuNPs较大的比表面积以及较好的生物相容能力,达到了成功装载抗体以及放大信号的效果,同时具有较大表面积的rGO起到了协同放大的作用.所构建的免疫分析方法实现了对肿瘤标志物PSA的检测,其线性范围为0.5～200 ng/mL,检测限为5.0 pg/mL,并且该方法专属性、重复性以及稳定性好.此外,在实际样品的检测中,加标样回收率为98.20％ ～106.2％,结果准确度良好,为检测PSA提供了准确可靠且灵敏度高的新方法.

目的:研发一种S100B蛋白新型检测试剂及仪器,为颅脑创伤疾病的诊疗提供参考.方法:将S100B蛋白单克隆抗体与生物素(Biotin)、S100B蛋白抗体与辣根过氧化物酶(HRP)、链霉亲和素与羧基磁珠分别按照一定比例进行交联并稀释,制备R1、R2、R0试剂,再用校准品稀释液稀释S100B蛋白抗原制备校准品.S100B蛋白新型检测仪器由试剂模块、反应模块、清洗模块、检测模块4个部分组成,具体由试剂盘、样本盘、磁微粒盘、装载台、反应盘、清洗盘和检测盘构成.结果:成功制备了用于颅脑创伤患者S100B蛋白检测的新型试剂,研发了配套的化学发光免疫分析仪器,实现了加样、反应、清洗、检测的模块化和自动化.经过临床测试,该试剂和仪器可以准确获得S100B蛋白的浓度.结论:S100B蛋白新型检测试剂和仪器可以提供S100B蛋白的快速批量检测,将为颅脑创伤病情的判断提供重要保证.

复制因子-C(RFC)和 RFC 样复合物(RLC)介导增殖细胞核抗原(PCNA)的染色质结合,但 RFC 和 RLC 如何合作调节 PCNA 的装载和卸载仍然存在争议. 近日,一项跨国研究从分子水平揭示 ATAD5-RLC 具有有效的PCNA 卸载活性. 研究的相关结果于 2019 年 6 月 3 日发表在《Nature Communications》期刊上.

癌症一直是危害人类健康的主要疾病之一.传统的癌症治疗方法包括放疗、化疗和手术,均具有明显的毒副作用或局限性.脂质体和纳米颗粒作为被广泛研究的药物递送载体,在人体临床试验中也出现了药物渗漏和装载功能不全等问题.目前而言,应用具有肿瘤靶向性的载体递送抗肿瘤药物或小分子,是有希望介导安全、有效的肿瘤治疗的策略之一.近年来,细菌来源的非复制型小细胞已受到越来越多的关注.小细胞是细菌异常分裂时期产生的纳米级无核细胞,其直径为200-400 nm,因而具有较大的药物装载能力.对小细胞的表面进行修饰,例如,装配能与肿瘤细胞表面特异性抗原或受体结合的抗体/配体,可显著提高小细胞的肿瘤靶向性.这种具有靶向性的纳米材料能将抗肿瘤的化疗药物、功能性核酸或编码功能性小分子的质粒靶向递送至肿瘤,而减少药物在正常组织器官的集聚.因此,使用小细胞作为靶向递送载体有助于降低药物对机体的毒性,从而最大限度地发挥药物分子在体内的抗肿瘤活性.文中将对小细胞的产生与纯化、药物装载、肿瘤细胞靶向性、内化过程以及其用于递送抗肿瘤药物的研究进展等方面进行综述,为开发基于小细胞的癌症治疗策略提供一定的参考.

结直肠癌是一种常见的消化道恶性肿瘤,在中国结直肠癌发病率呈逐年增高的趋势,给家庭及社会带来极大的经济负担.随着纳米技术快速发展和对结直肠癌生物学研究不断深入,靶向纳米药物成为研究热点.本文介绍纳米载体以抗原、适配体、细胞表面受体为靶标,装载现已成熟的化疗药物组成主动靶向纳米颗粒治疗结直肠癌.本文旨在总结主动靶向纳米颗粒治疗结直肠癌的进展.在此基础上,对主动靶向纳米颗粒治疗结直肠癌的前景进行了展望.

目的:设计同时靶向B淋巴细胞表面CD20和CD19两个抗原蛋白的双特异嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)并制备BiCAR-T细胞,检测其对B淋巴细胞瘤细胞的杀伤作用以及对免疫缺陷B-NSG小鼠白血病模型的治疗效果.方法:构建基于鼠源CD19和人源化CD20 scFv的双靶点CAR分子,将CAR基因装载于慢病毒载体中,在293T细胞中包装慢病毒,感染健康人T细胞制备BiCAR-T细胞.构建表达CD19和CD20的K562-CD19-GFP、K562-CD20-GFP以及表达Luciferase的Nalm6-Luc-GFP细胞作为靶细胞,将BiCAR-T细胞与靶细胞共同孵育,检测其对靶细胞杀伤能力及释放IFN-γ水平.使用Nalm6-Luc-GFP细胞构建白血病小鼠模型,尾静脉注射BiCAR-T细胞,通过小动物成像方法观察BiCAR-T细胞对荷瘤小鼠的治疗作用.结果:健康人来源的BiCAR-T细胞经7d培养后扩增良好,扩增倍数为20～50倍,阳性率为10％～92％,显示成功制备BiCAR-T细胞.在效靶比为10:1时,BiCAR-T细胞对Nalm-6、K562-CD19-GFP和K562-CD20-GFP的杀伤率显著高于对照组细胞[(76.7±7.4)％vs(8.7±2.4)％、(93.3±5.2)％ vs(46.7±6.2)、(51.0±0.8)vs (30.7±0.5)％,均P＜0.01];与对照组相比,与Nalm-6细胞共孵育后BiCAR-T细胞分泌IFN-γ量显著增加[(872.7±7.7)vs(101.0±5.3)pg/ml,P＜0.01].动物实验表明,BiCAR-T细胞对B-NSG小鼠白血病模型治疗效果明显,注射BiCAR-T细胞后白血病细胞逐渐减少,第50天时基本消失,小鼠全部存活至第70天被安乐死;PBS和对照T细胞组小鼠分别在(19±3)和(20±1)d全部死亡.结论:成功设计了表达CD19和CD20的双靶点CAR分子后成功制备了BiCAR-T细胞,该细胞能够有效杀伤表达CD19和/或CD20的B淋巴细胞瘤细胞,与靶细胞共同孵育后能够分泌大量IFN-γ,对B-NSG免疫缺陷小鼠白血病模型具有明显的治疗效果.

目的 探讨血必净注射液对抗CD19嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)体外肿瘤杀伤活性的影响.方法 构建基于单链抗体(scFV)抗CD19靶点的CAR分子,将CAR基因装载于逆病毒载体质粒中,制备逆病毒载体,转导健康人供体T细胞制备抗CD19?CAR-T细胞.以CD19阳性淋巴瘤细胞(Raji)、Raji-荧光素酶(LUC)标记细胞为靶细胞,将未转导的T细胞、CD19?CAR-T细胞分别与靶细胞按1:2、1:4、1:8的效靶比共孵育12?h后,分别采用流式细胞术、荧光素酶报告基因检测法检测CAR-T细胞对靶细胞的杀伤效果.将血必净注射液按1?g/L及10?g/L浓度加入CD19?CAR-T细胞共培养基,采用同样的方法检测不同浓度血必净注射液处理的CD19?CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤效率.结果 健康人群来源的CD19?CAR-T细胞经过14?d培养后扩增良好,每48?h扩增倍数为2～6倍,阳性率70.17％,提示CD19?CAR-T细胞制备成功.效靶比为1:2、1:4、1:8时,CD19?CAR-T细胞对Raji细胞和Raji-LUC细胞的杀伤效率均显著高于未转导T细胞〔效靶比1:2时Raji细胞(65.57±2.93)％比(13.17±0.69)％,Raji-LUC细胞(49.23±2.11)％比(14.04±2.68)％;效靶比1:4时Raji细胞(44.40±0.80)％比(10.06±2.44)％,Raji-LUC细胞(29.97±1.77)％比(8.60±0.71)％;效靶比1:8时Raji细胞(27.39±1.70)％比(9.05±1.13)％,Raji-LUC细胞(25.40±0.57)％比(7.09±0.44)％,均P<0.001〕.在相应效靶比条件下,经1?g/L和10?g/L血必净注射液处理的CD19?CAR-T细胞对Raji细胞和Raji-LUC细胞的杀伤效率均高于未经处理的CD19?CAR-T细胞,其中以经1?g/L血必净注射液处理的CD19?CAR-T细胞的杀伤效率升高最为显著〔效靶比1:2时Raji细胞(74.53±2.56)％比(71.91±3.25)％、(64.06±0.86)％,Raji-LUC细胞(57.67±0.58)％比(53.33±0.58)％、(49.00±2.00)％;效靶比1:4时Raji细胞(63.96±3.23)％ 比(50.84±5.54)％、(43.95±0.50)％,Raji-LUC细胞(43.33±0.58)％ 比(40.00±1.00)％、(29.67±2.08)％;效靶比1:8时Raji细胞(41.79±3.58)％比(33.79±1.15)％、(27.62±2.07)％,Raji-LUC细胞(36.20±0.53)％比(31.90±0.66)％、(23.13±1.06)％,均P<0.05〕.结论 CD19?CAR-T细胞能有效杀伤CD19阳性肿瘤细胞,血必净注射液可有效提高CD19?CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤能力.