目的:探讨来自弗氏枸橼酸杆菌的产碳青霉烯酶的新型不相容群组质粒pNY2385-KPC的耐药机制及基因结构特征。方法:从宁波市医疗中心李惠利医院急诊病房的发热患者尿液样本中获得1株多药耐药菌。采用16S rRNA基因扩增和平均核苷酸一致性（ANI）进行菌种鉴定；采用全自动细菌鉴定及药敏分析系统检测细菌MIC值；通过“三代”测序方法获得基因组序列，然后通过BLASTP/BLASTN、RefSeq、ConservedDomains、ResFinder、Isfinder等对基因功能进行详细注释及比较基因组学分析。结果:弗氏枸橼酸杆菌NY2385携带的质粒pNY2385-KPC为一种新型不相容群组质粒，包含 blaKPC-2，具有接合转移（Ⅳ型分泌系统）基因，可发生接合转移。NCBI中共检索到同型质粒15个，来源于弗氏枸橼酸杆菌、黏质沙雷菌、大肠埃希菌、阴沟肠杆菌、肺炎克雷伯菌和植生拉乌尔菌等细菌，为泛宿主质粒。通过对来自弗氏枸橼酸杆菌中6个该新型质粒进行序列比较分析，发现该新型质粒结构具有一定的保守性，具有携带 blaKPC-2的Tn 6296变体结构，而且质粒pCF1807-3同时具有 repApNY2385-KPC和 repAIncX8。 结论:弗氏枸橼酸杆菌中的pNY2385-KPC型质粒均携带 blaKPC-2耐药基因，分为 repApNY2385-KPC单复制子和 repApNY2385-KPC/ repAIncX8双复制子两种亚型，属于泛宿主质粒，作为可移动遗传元件促进了 blaKPC-2的传播。

目的:探讨新疆出血热病毒（XHFV）糖蛋白的2个抗原优势区（GcⅠ和GcⅡ）以不同嵌合策略以及不同免疫方式诱导小鼠免疫应答的效果。方法:以在5'端加入或不加鼠白细胞介素-2（IL-2）信号肽与通用型辅助性T细胞（Th）表位为不同设计策略，将GcⅠ、GcⅡ及GcⅠ上已鉴定出来的表位（Gc 233~248、Gc 241~256和Gc 281~296）分别进行融合并构建至真核表达载体pVAX1与原核表达载体pET-28a上。采用间接免疫荧光法检测重组真核质粒的体外表达效果后进行大量提取，将重组原核质粒转化大肠杆菌BL21进行诱导表达及纯化。通过基因免疫、蛋白免疫和DNA初免-蛋白加强免疫（联合免疫）3种方式免疫BALB/c小鼠，酶联免疫吸附测定法检测小鼠体内IgG抗体水平以及小鼠脾细胞培养上清中IL-4和干扰素-γ（IFN-γ）的含量，噻唑蓝比色法检测小鼠脾T淋巴细胞的增殖情况。 结果:双酶切及测序结果表明8种重组质粒构建成功。荧光显微镜下可见构建的重组真核质粒在体外细胞均能成功表达。3次免疫小鼠后，各实验组的小鼠血清IgG抗体水平和刺激指数均明显高于对照组（均 P<0.01）。Th2型细胞因子IL-4与Th1型细胞因子IFN-γ的质量浓度检测结果表明，联合免疫组引起的免疫应答偏向Th1型。 结论:成功构建了XHFV糖蛋白的多表位嵌合疫苗且靶抗原在小鼠体内可有效表达，各免疫组与对照组相比均激发了较强的体液免疫及细胞免疫应答，其中pVAX1-ST（GcⅠe+GcⅡ）联合重组蛋白r（GcⅠe+GcⅡ）的免疫效果最好，有望作为XHFV的新型候选疫苗。

目的:构建和鉴定表达新型冠状病毒（severe acute respiratory symptom coronavirus 2，SARS-CoV-2）Omicron株刺突蛋白受体结合域（receptor binding domain，RBD）的重组4型腺病毒。方法:使用重叠延伸PCR和无缝克隆构建增强型绿色荧光蛋白和RBD双顺反子表达盒，将PCR得到的ccdB片段和pBR322-Ad4质粒进行同源重组获得中间质粒pBR322-Ad4-ccdB，使用 PacI和 SpeI酶切质粒pBR322-Ad4-ccdB后回收载体片段，回收片段与双顺反子表达盒在 E.coli GB08Red中同源重组获得重组质粒pBR322-Ad4-RBD，用 AsiSI线性化后转染HEK293T细胞获得重组腺病毒Ad4-RBD，RT-PCR验证RBD蛋白的转录，Western blot验证重组腺病毒中RBD蛋白的表达。 结果:重组腺病毒Ad4-RBD的滴度达到5×10 8 PFU/mL，并能在细胞中稳定表达外源基因。 结论:成功构建了表达SARS-CoV-2 Omicron株RBD蛋白的重组4型腺病毒，为SARS-CoV-2 Omicron株疫苗的研发提供了科学有效的依据。

目的:探讨新型光遗传学工具Channelrhodopsin-XXM2.0 （XXM2.0）、Channelrhodopsin- PsCatCh2.0 （ PsCatCh2.0）的光敏感性及动力学特征，分析其是否可用于光遗传学视觉功能的恢复。 方法:通过分子生物学技术将XXM2.0和 PsCatCh2.0的基因片段连接到包含抗氨苄青霉素筛选基因和报告基因的载体pCIG （c）-msFoxn3上，形成新质粒pCIG （c）-msFoxn3-XXM2.0、pCIG （c）-msFoxn3- PsCatCh2.0。将构建的新质粒转染到HEK 293T细胞上，用HEKA膜片钳系统行全细胞模式记录对光反应。在2.7×10 16、4.7× 10 15、6.4×10 14 photons/ （cm 2·s）的光强下记录电流大小；在2.7×10 16 photons/ （cm 2·s）光强下刺激XXM2.0、 PsCatCh2.0并让其充分恢复，在Clampfit 10.6软件中分析开放和关闭时间常数；在相同光强下，设置2~ 32 Hz的光脉冲刺激，记录XXM2.0、 PsCatCh2.0的响应情况，并在重复光刺激后间隔4000 ms和200 ms来分析电流衰减情况。组间比较均采用独立样本 t检验。 结果:在XXM2.0、 PsCatCh2.0序列两端引入限制性内切酶位点EcoRⅠ和EcoRⅤ，酶切后通过T4 DNA连接酶成功构建新质粒pCIG （c）-msFoxn3-XXM2.0和pCIG (c）-msFoxn3- PsCatCh2.0，并转染表达在HEK 293T细胞上。XXM2.0和 PsCatCh2.0均表现出光强依赖性，光强越大电流越大。在视网膜安全阈值内的光强6.4×10 14 photons/ （cm 2·s）刺激下，XXM2.0和 PsCatCh2.0仍产生较大电流，分别为（92.8±142.0）、（13.9±5.6）pA；两者比较，差异无统计学意义（ t=1.24、1.24， P=0.28、0.29）。XXM2.0、 PsCatCh2.0的开放时间常数分别为（23.9±6.7）、（2.4±0.8）ms，关闭时间常数分别为（5 803.0±568.2）、（219.9±25.6）ms；两者比较，XXM2.0开放时间常数、关闭时间常数均较 PsCatCh2.0大，差异均有统计学意义（ t=7.10、31.60， P=0.00、0.00 ）。在响应频率方面，XXM2.0和 PsCatCh2.0均能很好地响应32 Hz的高频率脉冲光刺激，并在较长时间（4000 ms）和较短时间（200 ms）间隔的重复光刺激后均保持较小的电流衰减率。 结论:XXM2.0和 PsCatCh2.0均可在对视网膜安全的光强条件下被激活，并都能以较低的电流衰减来响应高频率（至少32 Hz）的脉冲光刺激，均满足利用光遗传学来恢复视觉功能所需的光敏蛋白特性。

目的:研制新型冠状病毒S蛋白Del143~145突变位点假病毒核糖核酸标准物质，满足公共卫生检测领域对标准物质的需求。方法:以新冠病毒原始株序列为参考，引入Omicron变异株特征性S蛋白Del 143~145，使用三质粒慢病毒包装系统制备假病毒。对产物进行均匀性、长期稳定性和短期稳定性评价，多家实验室联合定值。结果:制备的假病毒标准物质均匀性良好，可在-40 ℃下长期保存6个月以上，在常温条件下稳定12 h以上。多家实验室联合确定标准物质量值为（1.37±0.24）×10 4 copies/μL。 结论:研究制备的标准物质均匀稳定，适用于相关实验室的量值传递；质量检定、质量控制等多个领域。

目的:研究新型氨基修饰的磁性介孔二氧化硅纳米颗粒的生物相容性以及跨膜转运能力，并观察该纳米颗粒的体内代谢分布，以此评价该纳米颗粒在基因或药物载体方面的应用前景。方法:制备新型介孔二氧化硅纳米颗粒，以20 nm Fe 3O 4为核心包裹的二氧化硅颗粒，并且进行修饰使之表面氨基化，对此氨基修饰的磁性介孔二氧化硅纳米颗粒细胞毒性研究，携带N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体NR2B亚单位基因小干扰RNA(siRNA)质粒细胞转染实验，以及白鼠活体注射靶向模拟实验研究其在体内的生物分布。采用单因素方差分析。 结果:该新型氨基修饰的磁性介孔二氧化硅纳米颗粒是一种直径在80～100 nm之间，孔径在2～4 nm之间的均一球体型纳米颗粒。在5～125 μg/ml浓度范围内，介孔二氧化硅纳米颗粒的对于细胞活性影响差异无统计学意义( P>0.05)，始终保持在6%以下。在姜黄素染色的装载有NR2B siRNA质粒的该纳米颗粒转染实验中，可以在荧光显微镜下观察到细胞内的荧光现象。在体外红外测定仪观察红外激发荧光染料标记的纳米颗粒实验中，可见该纳米颗粒在小鼠体内不会有蓄积作用，其最终会通过肾脏随尿液汇聚至膀胱，并最终排出体外。同时在外加磁场的情况下，会有大量荧光颗粒向磁场方向聚集，并且在撤出磁场后不会蓄积，浓度会持续下降。 结论:氨基化磁性介孔二氧化硅颗粒具有较好的装载能力以及生物安全性，可以携带NR2B基因siRNA质粒通过胞吞作用进入细胞，在外加磁场诱导下可靶向到达病灶区域，为靶向基因治疗奠定基础。

目的:利用HIV慢病毒包装系统构建新型冠状病毒(2019 novel coronavirus，2019-nCoV)原始株614D和突变株614G假病毒，并初步研究其生物学特性。方法:将重组表达质粒pCDNA3.1-614D和pCDNA3.1-614G分别与慢病毒质粒psPAX2和pLenti CMV Puro LUC瞬时共转染293T细胞，72 h后收集上清，进行20%蔗糖垫层超速离心，检测假病毒的滴度、形态、S蛋白表达和中和活性。结果:间接免疫荧光检测可见S蛋白特异性荧光，Western blot分析可见2019-nCoV 614D和614G假病毒S蛋白表达，透射电镜下可见假病毒颗粒具有明显刺突。614D和614G假病毒的滴度分别为1.12×10 4和2.52×10 4 TCID 50/ml，均能够中和S蛋白兔多克隆抗体，表明假病毒具有特异性。 结论:本研究成功构建了2019-nCoV 614D和614G假病毒，为建立基于假病毒的体外中和抗体检测平台奠定基础。

目的:利用毕赤酵母高效表达新型冠状病毒刺突蛋白受体结合域(receptor binding domain，RBD)，并评估以该RBD蛋白作为抗原所制备的疫苗组合物的免疫原性。方法:选取RBD蛋白并合成对应基因片段，将其构建至pPICZαA质粒，质粒经线性化转化后整合到毕赤酵母基因组中进行重组表达。Western blot和基于BLI(Biolayer Interferometry)技术的定量分析方法对培养上清中RBD蛋白进行检测，筛选能够分泌表达RBD蛋白的单克隆菌株。通过优化发酵工艺，包括培养基的盐浓度调整和诱导条件优化(pH、温度和时间等参数)，实现RBD蛋白的高效表达，并在小鼠体内评估其免疫原性。结果:筛选获得重组RBD蛋白表达效果较好的RBD-X33单克隆菌株。通过优化后的发酵工艺，即采用HBSM培养基、诱导pH为6.5±0.3、诱导温度为22℃、诱导时间持续120 h，实现发酵收获上清中重组RBD的表达量达到240 mg/L。在小鼠免疫原性试验中，采用铝+CpG双佐剂系统吸附重组RBD蛋白的疫苗组合物能够激发小鼠产生2.7×10 6结合抗体滴度和726.8活病毒(野生型)中和抗体滴度。 结论:采用毕赤酵母表达系统能够高效表达重组RBD蛋白，且所表达的RBD蛋白能够有效激发动物产生免疫应答。本研究为基于RBD蛋白的重组新型冠状病毒疫苗的开发提供了参考。

目的:利用原核表达系统制备针对新型冠状病毒BA.2变异株亚单位疫苗并评价其免疫原性。方法:利用分子克隆技术同时构建BA.2变异株RBD以及RBD与TT-P2表位串联的重组质粒，通过蛋白纯化技术获得重组蛋白So和Sot。蛋白So/Sot作为免疫原与Al(OH) 3佐剂混匀后对小鼠进行肌肉注射免疫以评价细胞和体液免疫效果。 结果:原核系统成功表达目的蛋白且透析复性后获得高纯度可溶性蛋白。Sot组分泌IFN-γ和IL-4的抗原特异性T淋巴细胞数(213.7±0.6和311.7±1.5)均显著高于So组(94.3±16.8和185.7±4.2)( P<0.001)。Sot组诱导小鼠产生的血清抗体水平高于So组，针对BA.2毒株的中和抗体几何平均滴度(geometric mean titer, GMT)分别为588和337( P<0.05)。Sot蛋白能诱导产生Th1/Th2混合型免疫应答但以Th2型为主。 结论:原核系统表达的蛋白亚单位疫苗具有良好的细胞和体液免疫原性，为新冠病毒Omicron变异株蛋白亚单位疫苗的研发提供了有力的理论依据。

目的:对2019新型冠状病毒(2019-novel Coronavirus，2019-nCoV)核衣壳蛋白(nucleocapsid protein，NP)进行原核表达、纯化与鉴定，并应用于2019-nCoV血清学诊断。方法:合成2019-nCoV NP基因，克隆至pET28a载体中，构建表达质粒，并进行诱导纯化。纯化蛋白经SDS-PAGE、间接ELISA、Western blot(WB)、免疫层析法进行鉴定。优化间接ELISA反应条件，进行血清抗体检测。结果:重组NP经镍柱纯化后SDS-PAGE电泳显示相对分子质量约50×10 3，与预期一致；间接ELISA、WB表明其能与2019-nCoV感染患者血清特异性结合；用免疫层析法发现对NP检测限为0.2 ng/ml；间接ELISA检测32份2019-nCoV感染者血清及对照血清，发现二者结果可见明显分群。 结论:原核表达的NP具有良好的免疫原性，可用于制备血清学诊断试剂。